Martin Däumer Labor Dr. Thiele Kaiserslautern Resistenzen in der HIV-Therape - Wenn die Medikamente nicht mehr wirken - AIDS Fälle in Deutschland cart 1
HIV Replikationszyklus und antiretrovirale Zielstrukturen viral entry: fusion inhibitors, coreceptor anagonists matura,on: protease inhibitors reverse transcrip,on: NRTIs, NNRTIs (co)receptors CCR5 / CXCR4 RNA RNA DNA RNA RNA proteins integra,on: Integrase Inhibitors DNA DNA integrase provirus Zugel. antiretrovirale Medikamente Drug class Generic name Abbreviation Trading name Company Zidovudine ZDV Retrovir ViiV/GSK Didanosine ddi Videx Bristol-Myers Squibb Stavudine d4t Zerit Bristol-Myers Squibb NRTI Lamivudine 3TC Epivir ViiV/GSK Abacavir ABC Ziagen ViiV/GSK Tenofovir TDF Viread Gilead Emtricitabine FTC Viread Gilead NNRTI PI EI Nevirapine NVP Viramine Boehringer Ingelheim Rilpivirine RPV Edurant Janssen Cilag Etravirine ETR Intellence Janssen Cilag Efavirenz EFV Sustiva/Stocrin Bristol-Myers Squibb Saquinavir SQV Invirase, Fortovase Roche Ritonavir RTV Norvir AbbVie Indinavir IDV Crixivan Merck & Co. Nelfinavir NFV Viracept Agouron Pharmaceuticals Fosamprenavir FPV Telzir (Lexiva) ViiV/GSK Lopinavir LPV Kaletra AbVie Atazanavir ATV Reyataz Bristol-Myers Squibb Tipranavir TPV Aptivus Boehringer Ingelheim Darunavir DRV Prezista Janssen Cilag Enfuvirtide ENF Fuzeon Roche Maraviroc MVC Celsentri ViiV/Pfizer Raltegravir RAL Isentress MSD Sharp &Dohme INI Elvitegravir EVG B. v. Stribild Gilead Dolutegravir DTG Tivicay ViiV/GSK 2
Fallbeispiel: N. M. *1971 39 Jahre junger Mann ED HIV: Juni 2005 Fallbeispiel: N. M. *1971 TDF, FTC, EFV 3
Fallbeispiel: N. M. *1971 TDF, FTC, EFV Fallbeispiel: N. M. *1971 TDF, FTC, EFV Resistenztest 4
Definition Resistenz:" " Als Resistenz bezeichnet man in der Medizin im engeren Sinn die Widerstandsfähigkeit eines Organismus gegenüber negativen äußeren Einflüssen (Noxen)." Im weiteren Sinn umschreibt Resistenz auch die fehlende bzw. nachlassende Wirkung körpereigener (Hormone) oder körperfremder Substanzen (Arzneistoffe), z.b. weil Rezeptoren auf den Zielzellen vermindert ausgeprägt werden." aus: 5
HIV Mutationen entstehen spontan HIV: hohe Replikationsrate 10 9 Viruspartikel pro Tag + HIV RT: unzuverlässig Fiele Schraibvähler prä-genomische RNA zu proviraler DNA 1 auf 10 4 kopierte Basen + HIV RT: kein Korrekturmechanis mus Alle möglichen Punktmutationen entstehen jeden Tag Insuffiziente Suppression führt zur Selektion resistenter Virusvarianten 6
HIV Quasispecies Major viral population Intermediate viral populations Minor viral populations Insuffiziente Suppression führt zur Selektion resistenter Virusvarianten 7
Resistenzrisiko minimieren Prinzip der Resistenz Wirkstoff Wirkstoff HIV HIV empfindlich resistent 8
Die Nomenklatur Beispiel: Protease M46 (Wildtyp) Mutation: M46I Austausch an der Position 46: Methionin gegen Isoleucin TMC125-C223: Einfluss aktiver Substanzen auf die Viruslastsenkung n= 2 ak?ve Substanzen 33 35 1.2 1.67 10 0.28 1 ak?ve Substanz 32 31 19 0.15 0.41 1.02 400mg bid 800mg bid Ac,ve control 0 ak?ve Substanzen 14 12 10 0 0.14 0.61 0 0.5 1 1.5 2 Viruslastreduk,on zur Woche 48 (log 10 Kopien/mL) Cohen. BHIVA 2006, Abs. 2 9
Richtig oder falsch? Die Patienten mit dem geringsten Grad an Adhärenz haben die höchste Wahrscheinlichkeit eine Resistenz gegenüber ihrer HAART zu entwickeln. Adhärenz und Resistenz 10
Wie entsteht Resistenz? Geringe Adhärenz/Geringe Spiegel Medikamentenresistenz Therapieversagen Resistenztest ja, aber wann?...siehe gemeinsamer Bundesausschuss, 20.09.2005 Bei Erstdiagnose / Erstvorstellung? Mögl. übertragene, resistente Stämme werden u.u. überwuchert Vor Therapiebeginn? (initial) Immer! Es kann viel passiert sein! Bei Therapieversagen? Selbstverständlich! Und die Viruslast? Zw. 200 und 500 Kop/mL kann man loslegen! 11
Genotypische Resistenztestung Plasma M Probe RNA Extraktion RNA 7-10 Tage PCR Produkt Reverse Transkription/ 1. Polymerase Ketten Reaktion (PCR) des HIV-1 pol Gens (weitere targets ) cdna 2. Polymerase Ketten Reaktion Protease und Reverse Transkriptase Aufreingung (optional) (optional) Sequenz Reaktion Aufreingung Elektrophorese, DNA Sequenzierer Editieren von Sequenzen ViroSeq HIV-1 Genotyping software (Celera Diagnostics, Abbott) 12
13 >09-21343(B) CCTCAGATCACTCTTTGGCAgCGACCCttCgTCACAATAAAAGTAGGRGG GCAGTTAAAGgAAGCTCTATTAGATACaGGAGCaGATGATACAGTATTAG aagaaatgaatttgccaggaagrtggaaaccaaaahtratagggggaatt GGAGGTTTTATGAAAGTAAAACAGTATGAGGAAGTACCCATAGaAATCTG TGGACATAAGGTTACAGGTACAGTAGTAGTAGGACCTACACCTGCCAACA TAATtGGAAGGAATCTGTtGACTCAGCTtGGTTGCACTTTAAaTTTTCCC ATTAgTCCTaTtGAAACTGTACCAGTAAAATtAAAGCCaGGAATGGATGG cccaaaagttaaacaatggccattgacagaagaaaaaataaaagcattag TAGAAATTTGtacAGAATtGGAAAAGGAtGGGAAAATTTcaAAAATTGGG CCTGAaAATCCATACAATACTCCAGTGTTTGCCATAAAGAAAAAAGACGG TACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTC AAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATcccgGAGGGTTAAAA AAGAACAAATCAGTAACAGTACTAGATGTGGGTGATGCATATTTTTCART TCCCTTACAtGAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTA CAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATACCAGTACAATGTGCTTCCACAG GGATWERDIESLIESTHATGUTEAUGENGGAAAGGATCACCAGCAATATT AGAGCCCTTTAGAAAACAAAATCCAGAATTAGTTATCTATCAATACGTGG ATGATTTGTATGTAGGATCtGaCTtAgAaATAGGgCAgCATAGAaCaaAA ATAGACGAacTGAGAGAACaTCtgTGgaAGTgGGGGTTTtACACACCAGA CAAAaAACATCAGAAAGAACCTCCATTTCTTtGgATGGGTTATGAACTCC ATCcTGATAAATGGACAGTGCAGCCTATAGTGCTGCCAGAAAAAGACAGC TGGACTGTCAATGACATACAgAAGTTAGTGGGAAAATTGAATTGGGCAAG TCAaATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGCAAACTCCTTAGAG GAACCAAAGCACTGACAGAAGTAGTACCTCTAACGGAAGaAGCAGAGCTA GAACtGGCAGAAAACAGGGAGaTTCtGAAAGAACcAGTACATGGAGTGTA TTATGaCCCCTCAAAAGAYTTAATAGCAGAAAtAcAGAAGCAGGGGCAaG G Das Ergebnis: fasta Datei 2006100903 Protease L10F M46I M46L I54M L63P A71V L76V V82A V3I I15V S37N R57K D60E Q61E I62V I72T I93L 2006100903 Reverse Transcriptase M41L E44D S68G K103N V118I M184V L210W T215Y A98G D121H I135T D177E I178L E203D Q207E R211K L214F I293V Genotyp: Mutationen
Das Dilemma res. (inaktiv?) K103N L210W cut-off T215Y M41L empf. (aktiv) EFV (Sustiva ) M184V AZT (ZDV, Retrovir ) Kreuzresistenz und genetische Barriere 3TC 184V Wild-type virus 3TC-resistentes Virus FTC-resistentes Virus FTC 184V Darunavir-resistentes Virus Amprenavir-resistentes Virus 3TC in FTCvorbehandelten Patienten DRV 184V 76V/47V/54M 32I 54L FPV, dann DRV 32I ± 47V 76V or 54M 32I + 47V 14
Genotypische Resistenztestung und Regel-basierte Interpretationsalgorithmen VirtualPhenotype RegaInst v7.0 ANRS AC11 HIV ViroScorer v1.0 " TRUGENE HIV-1 Genotyping Test" geno2pheno ver3.0! Regelwerke, basierend auf Expertenmeinungen ZDV Resistent intermediäre Resistenz eingeschränkte Empfindlichkeit 151M 2 aus (41L, 67N, 70R, 1 Mutation aus (41L, 69 ins 210W, 215F/Y, 67N, 70R, 210W, 3 aus (41L, 67N, 219Q/E) 215F/Y, 219Q/E) 70R, 210W, 215F/Y, 219Q/E) Kommentar: Falls an 215 eine andere Mutation als F und Y vorkommt ist dies ein Zeichen für archivierte resistente Viren Als TAMs werden gewertet: 41L, 67N, 70R, 210W, 215F/Y, 219Q/E Wenn 65R vorliegt werden 2 TAMs abgezogen, sofern der Selektionsdruck auf 65R aufrecht erhalten bleibt Wenn 74V, 181C, 184V/I vorliegen wird je eine TAM abgezogen, sofern der entsprechende Selektionsdruck aufrechterhalten bleibt. Für 184V/I gilt die Regel nicht, wenn 41L+ 210W+ 215F/Y oder mehr vorliegt. Maximal Verbesserung um eine Kategorie pro Mutation bei 74V, 181C, 184V/I 15
Befund???? Fertig???? Sicher nicht!! 16
Fallbeispiel Fallbeispiel G.P. *12.09.1986 aktuelle Therapie: TDF, FTC, NVP VL: 8.900 Kop/ml CD4: 320 (19%) 17
Fallbeispiel Resistenztestung: PR:./. RT: 65R, 103N, 181C, 184I Vorhersage für Kombinationstherapien 18
Klinische Konsequenz? 19
Virusdynamik in der Therapiepause 05.09.2002 12.09.2002 19.09.2002 26.09.2002 K103N Genotyp-Historie Kumulative Befundung Aktuelle Entwicklungen! in der HIV-Resistenztestung! 20
Verteilung Therapie-erfahrene/ Therapie-naive in der Resistenztestung 2000 und 2008 [%] Viruslast bei Anforderung der Resistenztestung Viruslast Däumer, 2011, unveröffentlicht 21
Entwicklung der HIV-Resistenz am Beispiel von NNRTI-Mutationen n=2085 (1/2007-12/2009) Anzahl Mutationen Prävalenz von übertragener Medikamenten Resistenz Total TDR NRTI Resistenz NNRTI Resistenz PI Resistenz 16,0% 14,0% 12,0% 10,0% 8,0% 6,0% 4,0% 2,0% 0,0% (39) 2001 (48) 2002 (55) 2003 (101) 2004 (138) 2005 (189) 2006 (265) 2007 (343) 2008 (365) 2009 (292) 2010 (115) 2011 Prevalence of drug resistance in first Prot/RT sequences from treatment naive patients (n=1.950) by year according to Prevalence of TDR: 10,4% (95% CI 9.1-11.8) p for trend = 0.6, 2001-2011 Overall Prevalence NRTI NNRTI 3% (95% CI 2-4; p=0.6) 7% (95% CI 6-8; p=0.7) PI 3% (95% CI 2-4; p=0.7) 0% 5% 10% Fragen per E-Mail an: hiv.germany@bms.com 22
Grenzen der Standard-Resistenztestung Blood plasma RNA extrac,on RNA Reverse Transcrip,on/ Polymerase Chain Reac,on cdna M Sample 2. Nested PCR PCR products (op,onal) Purifica,on (op,onal) Sequencing Sensitivity Reac?on for minor variants: >20% Purifica,on Sequencer Die Suche nach der Nadel im Heuhaufen 23
Ultra-tiefe Resistenztestung Standard Sanger-sequencing...PQIYMDDHTRE... Ultra-deep sequencing...pqiymddhtre......pqiymddhtre......pqiyvddhtre......pqiymddhtre......pqiymddhtre......pqiymddhtre... 24
Acknowledgments Bettina Spielberger Kirsten Becker Anna Memmer Alexander Thielen Bernhard Thiele Vielen Dank!! 25