Praktikumsteil: 3 - RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box- Genen aus Tulpen

Praktikumsteil: 3 - RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box- Genen aus Tulpen Vorbereitung auf diesen Praktikumsteil: Organisation 2. Praktikumstag: - Für den Bioinformatik-Teil benötigen Sie am 2. Tag dieses Praktikumsteils pro Gruppe einen Laptop. - Installieren Sie das Programm sequencher auf diesem Laptop. - Stellen Sie sicher, dass der Akku vollständig geladen ist (die Anzahl der Steckdosen im Seminarraum ist begrenzt). - Stellen Sie sicher, dass Sie über das Uni-Netzwerk Zugang zum Internet haben. Lesen Sie das gesamte Skript als Vorbereitung auf das Praktikum durch. Folgende Fragen sollen Ihnen helfen sich auf das Praktikum vorzubereiten. - Was sind MADS-Box-Gene? - Aus welchen Abschnitten besteht die mrna? - Was ist eine cdna und mit welchen Methoden können cdna-sequenzen vervollständigt werden? - Was ist eine RACE? - Wie funktioniert PCR und welche Faktoren beeinflussen das Ergebnis? - Was sind Plasmide? Welche Eigenschaften muss ein Plasmid haben, um als Klonierungsvektor benutzt werden zu können? - Auf welchem Prinzip beruht die Plasmidreinigung mittels der alkalischen Lyse? - Was ist sequence assembly? - Welche Programme gibt es für das sequence assembly? - Wie funktioniert die Sanger-Sequenzier-Methode mit Fluoreszenzmarkierung? - Wie beeinflussen die Parameter minimum match percentage und minimum overlap das sequence assembly? - Was ist eine BLAST-Suche und wie funktioniert diese? - Welche Informationen können Sie aus der BLAST-Suche über das von Ihnen sequenzierte Gen gewinnen? Literatur: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics, C. Mühlhardt, Spektrum-Verlag Molekulare Genetik, R. Knippers, Thieme-Verlag Allgemeine und Molekulare Botanik, E. Weiler & L. Nover, Thieme-Verlag Seite 1 von 13

Abb. 1: Übersicht über den Ablauf des Praktikumsteil 3 - RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen aus Tulpen. Im Praktikum wird Ihnen sowohl das Template für die nested-pcr (3 RACE-PCR-Produkt) als auch das cdna-template für die 3 RACE zur Verfügung gestellt. Umgekehrt als in diesem flow-chart, wird aus Zeitgründen das erste Experiment die nested-pcr sein. Seite 2 von 13

Einleitung RACE (rapid amplification of cdna ends) Die mrna eines Gens besteht aus einer Protein codierenden Region (coding DNA sequence = cds), die in ein Protein translatiert wird, den sich im 5 - und 3 -Bereich anschließenden nicht-translatierten Regionen (UTR = untranslated region, Siehe Abb.2), sowie dem 5 -Cap und dem poly-a-schwanz am 3 -Ende. In den UTRs können sich regulatorische Sequenzelemente befinden, aber oft ist von einer mrna nur die kodierende Sequenz bekannt. Mit der RACE-PCR kann die vollständige Sequenz der mrna ermittelt werden. RACE (rapid amplification of cdna ends) bedeutet schnelle Amplifikation von cdna-enden. Ausgehend von einer bekannten Sequenz im Transkript wird die Sequenz des 5 -Endes (5 -RACE-PCR) bzw. des 3 -Endes (3 - RACE-PCR) ermittelt. Abb.2: Schematische Darstellung der Genstruktur und der Struktur der transkribierten mrna (Q: https://www.mun.ca/biology/scarr/igen3_05-12_figure-l.jpg). Die mrna wird aufgrund ihrer Struktur in einer herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion nicht vervielfältigt (=amplifiziert) und muss demzufolge erst in einer Reaktion in eine DNA-Sequenz umgesetzt werden (cdna-synthese, Siehe Abb. 3). Während der cdna-synthese wird eine zur mrna reverskomplementäre DNA-Sequenz (complementary DNA = cdna) mit dem Enzym Reverse Transkriptase synthetisiert. Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und benötigt für die DNA- Synthese einen Primer als Startpunkt. Meist wird ein Oligo-dT-Primer (15-25 Desoxythymidine) verwendet, der komplementär zum Poly-A-Schwanz des 3 -Endes der mrna ist und dort bindet. Am Ende der Reaktion liegt ein RNA-DNA-Hybrid vor, aus dem die RNA dann durch die zusätzliche RNase H-Aktivität der Reversen Transkriptase abgebaut wird. Am 5 -Ende des Oligo-dT-Primers schließt sich eine Ankersequenz an, die in der anschließenden PCR1 (hier 3 RACE-PCR) als Bindestelle für einen Primer genutzt wird. Der zweite Primer bindet genspezifisch im codierenden Bereich der mrna-sequenz (Abb.3). Oft erhält man nach der ersten Amplifizierungsrunde (3 RACE-PCR) von cdna noch viele unspezifische PCR- Produkte. Der Anteil spezifischer PCR-Produkte kann durch eine nested-pcr (verschachtelte PCR) erhöht werden. Für eine nested-pcr wird eine geringe Menge des PCR-Produkts aus der ersten Amplifikationsrunde Seite 3 von 13

(3 RACE-PCR) als Template verwendet. Im Gegensatz zu den Primern der 3 -RACE-PCR binden die Primer der nested-pcr leicht in 5 -Richtung versetzt auf dem zu amplifizierenden DNA-Fragment, sodass sie sich in ihrer Sequenz von den Primern der ersten PCR unterscheiden und dadurch die Spezifität der PCR erhöhen. (3 RACE-PCR) (nested PCR) Abb. 3: Ablauf von cdna-synthese, 3 RACE-PCR und nested-pcr (Q: Protocols & Applicatios Guide, www.promega.com, rev. 3/11). Tag 1 Bitte berücksichtigen Sie, dass aus Zeitgründen erst die nested-pcr und dann die 3 RACE-PCR angesetzt wird, im normalen Ablauf würde man es umgekehrt machen. 1. Durchführung nested-pcr (= Experiment 1) 1.1. Pipettieren Sie folgende Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein 0,2 µl PCR-tube auf Eis: (als Template erhalten Sie vom Betreuer schon vorbereitetes PCR-Produkt) Komponente Endkonzentration bzw. Menge in Eingesetzte Menge einem Reaktionsansatz ddh2o 10x Reaktionspuffer 1x dntp Mix (je 10 mm) je 200 µm T127-Ankerprimer (50 µm) 1 µm T175-Primer (50 µm) 1 µm Template: 1. PCR-Produkt 1:50 variabel 2 µl verdünnt Taq (5 U/µl) 2 U Endvolumen: 50 µl Endvolumen: 50 µl Seite 4 von 13

1.2. Mischen Sie den Reaktionsansatz und zentrifugieren Sie diesen kurz ab. 1.3. Stellen Sie ihre PCR-Reaktion so lange auf Eis bis das PCR-Programm gestartet wird. 1.4. PCR-Programm: Bezeichnung Temperatur [ C] Zeit Initiale Denaturierung 95 2 min Denaturierung 95 15 sec Primer-Annealing 58 30 sec 35 x Elongation 72 1 min Abschließende Elongation 72 5 min 15 hold 1.5. Geben sie zu der PCR-Reaktion 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer. Weiter mit Gelelektrophorese im Punkt 2.6.. 2. Durchführung 3 RACE-PCR (Rapid Amplification of 3 -cdna Ends) (= Experiment 2) 2.1. Pipettieren Sie folgende Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein 0,2 µl PCR-tube auf Eis: Komponente Endkonzentration bzw. Menge Eingesetzte Menge in einem Reaktionsansatz ddh2o 10x Reaktionspuffer 1x dntp Mix (je 10 mm) je 200 µm T126-Ankerprimer (50 µm) 1 µm T176-Primer (50 µm) 1 µm cdna Template variabel 1 µl Taq (5 U/µl) 2 U Endvolumen: 50 µl Endvolumen: 50 µl 2.2. Mischen Sie den Reaktionsansatz und zentrifugieren Sie diesen kurz ab. 2.3. Stellen Sie ihre PCR-Reaktion so lange auf Eis bis das PCR-Programm gestartet wird. 2.4. PCR-Programm: Bezeichnung Temperatur [ C] Zeit Initiale Denaturierung 95 2 min Denaturierung 95 15 sek Primer-Annealing 58 45 min 25 x Elongation 72 1 min Abschließende Elongation 72 5 min 15 hold 2.5. Nach der PCR pipettieren Sie 10 µl der PCR in ein neues und gut beschriftetes 1,5 ml Tube für eine spätere nested-pcr (wird im nächsten Block verwendet). 2.6. Geben sie zu den restlichen 40 µl der PCR-Reaktion 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer. 2.7. Gelelektrophorese: Laden Sie die PCR-Produkte auf ein 1%iges Agarose-Gel mit großen Taschen (schon vorbereitet) und legen Sie für ca. 45 min eine Spannung von 120 V an das Gel. (nicht vergessen: zusammen mit der nested-pcr auftragen) Seite 5 von 13

2.8. Ausschneiden der DNA-Fragmente aus dem Agarose-Gel (vom Betreuer). DNA im Agarose-Gel kann auf Eis oder für eine längere Lagerung bei -20 C aufbewahrt werden. Hinweise zur Auswertung der Gelelektrophorese beider PCR-Produkte (Exp. 1&2): Wie viele Banden erscheinen auf dem Agarose-Gel für die verschiedenen PCR-Reaktionen? Auf welcher Höhe liegen die Banden und welche Intensität haben sie? Gibt es Banden mit denen Sie direkt ohne nested-pcr weiterarbeiten würden? 3. Aufreinigung (Elution) von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel (mit dem High Pure PCR Product Purification Kit von Roche Applied Science) Auflösen des Agarosegel-Stückes: 3.1. Geben Sie zu dem Agarosegel-Stück (ca. 150 mg) 450 µl Binde-Puffer (Tube mit Nr.1). 3.2. Inkubieren Sie das Gel-Stück solange bei 56 C bis es komplett gelöst ist (max. 10 min.). Vortexen Sie kurz ca. alle 2 3 min während der Inkubationszeit, um den Lösungsvorgang zu beschleunigen. 3.3. Geben Sie 225 µl Isopropanol (Nr.2) zu der Lösung und vortexen nochmals gründlich. Vor dem Weiterarbeiten die Lösung kurz abzentrifugieren, damit keine Tropfen mehr am Deckel hängen. Bindung der DNA an die Säulen: 3.4. Stecken Sie eine Säule in ein Sammel-Tube. 3.5. Geben sie das gelöste Agarosegel aus Schritt 3.3. auf die Säule. 3.6. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur. 3.7. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 13 000 x g. 3.8. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall. Waschen 3.9. Geben Sie 500 µl Wasch-Puffer (Nr.3, mit EtOH) auf die Säule. 3.10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 13 000 x g. 3.11. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall. 3.12. Geben Sie 200 µl Wasch Puffer (Nr.3, mit EtOH) auf die Säule. Durch den zweiten Waschschritt soll die Reinheit des eluierten Produktes erhöht werden. 3.13. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall. Elution der DNA von der Säule 3.14. Stecken Sie die Säule in ein neues, gut beschriftetes 1,5 ml-tube. (Beschriftung: Gruppennummer, Datum, evtl. an der Seite cdna-name notieren) 3.15. Geben Sie 50 µl Elutionspuffer (Nr.4) in die Mitte der Säule, berühren Sie aber nicht die Membran mit der Pipettenspitze! 3.16. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur. 3.17. Zentrifugieren Sie 1 min bei 13 000 x g. 3.18. Lagerung der PCR-Fragmente bei -20 C bzw. 4 C möglich. Seite 6 von 13

4. pjet-klonierung (mit dem CloneJet PCR Cloning Kit von Thermo Scientific) Die eluierten PCR-Produkte werden in einer Ligations-Reaktion in den Klonierungsvektor pjet1.2/blunt (Abb.4 Vektorkarte) kloniert und der Vektor anschließend in chemokompetente Escherichia coli (E. coli) DH5α-Zellen transformiert. Der pjet1.2/blunt Vektor liegt in dem verwendeten Kit schon linearisiert vor, sodass DNA-Fragmente direkt in den Vektor ligiert werden können. Im Vektor ist das Gen bla(ap R ) enthalten das eine Ampicillin-Resistenz vermittelt, damit nur die Zellen auf einem Ampicillin-selektiven Medium überleben, die den Vektor aufgenommen haben. Des Weiteren trägt der Vektor in der Multiplen Cloning Site (MCS) das Gen eco47ir, dessen Genprodukt letal für die Bakterienzelle ist. Durch die Ligation eines DNA Fragmentes in die MCS wird die Sequenz des Gens eco47ir unterbrochen und demzufolge in den Zellen kein letales Genprodukt mehr hergestellt. Darum wachsen nach der Transformation auf Ampicillin-selektivem Medium nur noch die E. coli Zellen, welche das rekombinante Plasmid aufgenommen haben. Zellen, die den rezirkularisierten Vektor (Vektor ohne DNA-Fragment) aufgenommen haben, sterben aufgrund des letalen Genproduktes. Abb. 4: Vektorkarte und Sequenz der MCS des Vektors pjet1.2/blunt (Q: http://img.docstoccdn.com/thumb/orig/127225690.png) 4.1. Blunting Reaction Der linearisierte Vektor pjet1.2 hat glatte Enden (sogenannte blunt ends). Da die Taq-Polymerase PCR- Produkte mit einem 3 -da Überhang produziert, müssen glatte Enden in einer sogenannten blunting Seite 7 von 13

reaction mittels dem DNA-Blunting-Enzym hergestellt werden. Das DNA-Blunting-Enzym entfernt 3 - Überhänge (Exonukleaseaktivität) und füllt 5 Enden auf. 4.1.1. Pipettieren Sie folgenden Ansatz auf Eis: 5 µl 2x Reaction Buffer 2,5 µl ddh2o 1 µl eluiertes PCR-Produkt 0,5 µl DNA Blunting Enzym 4.1.2. Kurz vortexen und abzentrifugieren 4.1.3. Inkubation: 70 C, 5 min 4.1.4. Auf Eis abkühlen 4.2. Ligation Das blunt-end-pcr-produkt kann nun in den Vektor pjet1.2 (Siehe Vektorkarte in Abb.4) kloniert werden. Die enzymatische Verknüpfung der DNA-Enden wird als Ligation bezeichnet und durch das Enzym T4- DNA-Ligase realisiert. Der vom Enzym benötigte Kofaktor ATP ist im Puffer schon vorhanden. 4.2.1. Zum Reaktionsansatz aus Schritt 4.1.4. pipettieren Sie folgende Reagenzien auf Eis: 0,5 µl pjet1.2 blunt Cloning Vector 0,5 µl T4 DNA Ligase 4.2.2. Kurz vortexen und abzentrifugieren 4.2.3. Inkubation: 22 C, 5 min 4.2.4. Auf Eis abkühlen 5. Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-zellen (Calciumchlorid-Methode) und Hitzeschock Manche Bakterienstämme produzieren von Natur aus verschiedenen Kompetenzproteine, die an der Aufnahme von Fremd-DNA beteiligt sind. Das in der Molekularbiologie häufig verwendete Bakterium E. coli besitzt nur einen Teil des Kompetenz-Operons und somit keine hohe Affinität Fremd-DNA aufzunehmen. Mit der Calciumchlorid-Methode werden E. coli-zellen chemisch kompetent gemacht. Bei der Transformation mit Hitzeschock bei 42 C wird kurzfristig die DNA-Membranfluidität erhöht und die Zellen nehmen vermehrt die DNA aus dem Ligationsansatz auf. Nach kurzem Abkühlen auf Eis werden die Zellen bei 37 C rekultiviert, bevor man sie auf selektiven LB-Agarplatten (enthalten Ampicillin) ausplattiert. Durchführung der Transformation: 5.1. Tauen Sie ein Aliquot (100 µl) chemisch kompetente E. coli- Zellen (Stamm DH5α) auf Eis auf. 5.2. Pipettieren Sie den gesamten Ligationsansatz aus Schritt 4.2 zu den chemokompetenten Zellen. 5.3. Inkubieren Sie den Transformationsansatz 30 min auf Eis. Seite 8 von 13

5.4. Führen Sie den Hitzeschock durch: Inkubation der Zellen für 2 min bei 42 C. 5.5. Stellen Sie die Zellen nach dem Hitzeschock unmittelbar auf Eis. 5.6. Geben Sie 1 ml LB-Medium zum Transformationsansatz. 5.7. Inkubieren Sie den Transformationsansatz mindestens 30 min bei 37 C. 5.8. Zentrifugieren Sie den Transformationsansatz 1 min bei 8000 x g. 5.9. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Benutzen Sie für jeden Transformationsansatz eine neue Spitze. Sollten Sie ausversehen das Pellet mit pipettieren, wiederholen Sie den Schritt 5.8. 5.10. Resuspensieren Sie das Bakterienpellet in 100 µl LB-Medium. 5.11. Bitte unter der Clean Bench: Plattieren sie 30 µl des Transformationsansatzes auf einer LB-Platte mit Ampicillin. Der restliche Transformationsansatz wird bei 4 C aufbewahrt. 5.12. Inkubieren Sie die Transformationsplatte über Nacht bei 37 C. Hinweise zur Auswertung: Warum müssen Sie die transformierten Zellen auf LB-Platten mit Ampicillin ausplattieren? Wie wirkt Ampicillin und wie wird die Ampicillinresistenz vermittelt? Welche Kolonien werden nur auf der Platte wachsen und warum? Sind Satellitenkolonien gewachsen? Tag 2 6. Kolonie-PCR Mittels Kolonie-PCR kann man schnell nach einer Transformation E. coli-kolonien identifizieren, welche das gewünschte Plasmidkonstrukt (d.h. Vektor + DNA-Fragment) aufgenommen haben. Für die Kolonie-PCR wird keine DNA isoliert, sondern es werden ganze E. coli Zellen eingesetzt. Um die DNA aus den Bakterienzellen freizusetzen, werden die Zellen im vorliegenden Protokoll mittels initialer Denaturierung 7 min bei 94 C erhitzt. Damit im Anschluss an die PCR noch Klone der untersuchten Kolonie vorhanden sind, wird gleichzeitig eine Masterplatte angelegt, die zum Wachsen der Klone über Nacht bei 37 C inkubiert wird. verwendete Primer: pjet1.2 for: CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC pjet1.2 rev: AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG Es werden 4 Kolonien pro Transformation untersucht. 6.1. Pipettieren Sie folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge auf Eis: Komponente Endkonzentration bzw. Menge in Eingesetzte Menge einem Reaktionsansatz ddh2o 10x Reaktionspuffer 1x dntp Mix (je 10 mm) je 200 µm pjet 1.2 for (50 µm) 1 µm pjet1.2 rev (50 µm) 1 µm Homemade Taq (1 U/µl) 1 U Endvolumen: 25 µl Endvolumen: 25 µl Seite 9 von 13

6.2. Mischen Sie den Master-Mix, zentrifugieren Sie diesen kurz ab und aliquotieren Sie diesen zu je 25 µl in ein PCR-Tube auf Eis. 6.3. Diesen Schritt unter der Clean Bench durchführen: Picken Sie eine Einzelkolonie mit einer gelben Pipettenspitze und beimpfen Sie damit eine Masterplatte (LB mit Ampicillin). Anschließend stellen Sie die Pipettenspitze in ein PCR-Tube mit dem PCR-Mix. Die Masterplatte wird über Nacht bei 37 C inkubiert. 6.4. PCR-Programm: Bezeichnung Temperatur [ C] Zeit Initiale Denaturierung 94 7 min Denaturierung 94 30 sek Primer-Annealing 60 30 sek 28 x Elongation 72 45 sek Abschließende Elongation 10 5 min 15 hold 6.5. Geben sie 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer zur PCR. 6.6. Gelelektrophorese: Laden Sie die PCR-Produkte auf ein 1%iges Agarose-Gel mit kleinen Taschen (schon vorbereitet) und legen Sie für ca. 45 min eine Spannung von 120 V an das Gel. Hinweise zur Auswertung: Auf welcher Höhe erwarten Sie die DNA-Bande für Ihr PCR-Produkt? Achten Sie auf die Lage der Primer im Vektor. Finden Sie eine mögliche Erklärung für PCR-Produkte unerwarteter Größe. 7. Plasmid-Aufreinigung (mit dem GeneJET Plasmid Miniprep Kit von Thermo Scientific) Von der Transformation aus Schritt 5 wurden je 1-2 Kolonien in 2 ml flüssiges LB-Medium mit Ampicillin in einem Reagenzglas angeimpft und über Nacht bei 37 C und 200 rpm kultiviert. Aus dieser Bakterien- Kultur sollen Sie heute das Plasmid nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isolieren. Alle benötigten Komponenten sind in dem oben erwähnten Kit enthalten. Die E. coli Kultur wird abzentrifugiert (pelletiert), der Überstand entfernt und das Pellet dann in EDTAhaltigem Puffer resuspendiert. EDTA destabilisiert die Zellwand durch Komplexierung von zweiwertigen Ionen wie Mg 2+, Ca 2+. Anschließend werden die Bakterien mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert und die DNA durch NaOH denaturiert. Im Vergleich zu chromosomaler DNA kann die niedermolekulare Plasmid-DNA nach der Denaturierung wieder renaturieren (allerdings nur, wenn die Denaturierung nicht zu lange erfolgt). Im anschließenden Neutralisierungsschritt wird das Lysat durch Zugabe von saurem Kaliumacetat-Puffer neutralisiert. Dabei präzipitieren die denaturierten Proteine und chromosomale DNA mit dem Kalium-Dodecylsulfat. Die niedermolekulare Plasmid-DNA bleibt in Lösung und kann renaturieren. Die unlöslichen Komponenten (denaturierte Proteine, hochmolekulare RNA, denaturierte Seite 10 von 13

chromosomale DNA, bakterieller Zelldebris) werden abzentrifugiert. Im klaren Überstand befindet sich die Plasmid-DNA. Der Überstand wird auf ein Säulchen gegeben. Die Plasmid-DNA bindet in Gegenwart von Salzen an das Säulchen-Material und wird mit Ethanol-haltigen Puffern gewaschen. Zum Schluss wird die Plasmid-DNA mit Wasser von der Säule eluiert, aufgefangen und die Konzentration bestimmt. Durchführung der Plasmid-Mini-Präparation: Pelletierung der Bakterienzellen: 7.1. Geben Sie je 1 ml der E. coli-kultur in ein frisches 1,5 ml Tube. 7.2. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g. 7.3. Pipettieren Sie den Überstand mit einer blauen Pipettenspitze vorsichtig ab und geben Sie den Überstand in den flüssigen S1-Abfall. Sollten Sie aus Versehen das Pellet mit pipettieren, pipettieren Sie die Lösung zurück in das Tube und wiederholen Schritt 7.2 Resuspension, Zelllyse und Neutralisiation 7.4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 µl Resuspension-Solution mit RNaseA (Nr.1) durch aufund abpipettieren. Achten Sie darauf, dass das Pellet komplett resuspendiert ist und keine weißen Zell-Klümpchen mehr vorhanden sind. 7.5. Alkalische Lyse: Geben Sie zu der Lösung mit den resuspendierten Zellen 250 µl Lysis Solution (Nr.2). Mischen Sie unmittelbar nach Zugabe der Lösung durch viermaliges Invertieren des Tubes. Invertieren ist das Hin- und Herschwenken des Tubes mit den Fingern - Nicht vortexen! es kann zum Scheren der chromosomalen DNA kommen. Nicht länger als 5 min inkubieren, um eine Denaturierung der Supercoiled Plasmid-DNA zu verhindern. 7.6. Inkubieren Sie 2 min bei Raumtemperatur. 7.7. Neutralisation: Geben Sie 350 µl Neutralisation-Solution (Nr.3) dazu. Mischen Sie unmittelbar nach Zugabe der Lösung durch vier- bis sechsmaliges Invertieren des Tubes. Es bildet sich ein weißes Präzipitat, das die chromosomale DNA und Proteine sowie weitere Zellbestandteile enthält. 7.8. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 12 000 x g. Reinigung: 7.9. Pipettieren Sie den klaren Überstand auf eine Säule des GeneJET -Kits. Vorsicht: nicht das weiße Präzipitat mitpipettieren! 7.10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g. 7.11. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall. 7.12. Geben Sie 500 µl Wash-Solution (Nr.4, mit EtOH) auf die Säule. Die Waschschritte dienen der Reinigung der Säule von anderen Zellbestandteilen. 7.13. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g. Seite 11 von 13

7.14. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall. 7.15. Geben Sie erneut 500 µl Wash-Solution (Nr.4, mit EtOH) auf die Säule. 7.16. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g. 7.17. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall. 7.18. Zentrifugieren Sie erneut für 1 min bei 12 000 x g um den restlichen EtOH zu entfernen. Wichtiger Schritt, denn falls zu viel Ethanol auf der Säule ist, sind die Ausbeuten an Plasmid-DNA gering und zudem verunreinigt. Elution: 7.19. Stecken Sie die Säule in ein neues und gut beschriftetes 1,5 ml Tube 7.20. Geben Sie 50 µl Elution-Buffer (Nr.5) in die Mitte der Membran der Säule (nicht mit der Pipettenspitze berühren!). 7.21. Inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur. 7.22. Zentrifugieren Sie für 2 min bei 12 000 x g. 7.23. Messen Sie die DNA-Konzentration (wird vom Praktikumsleiter durchgeführt). 7.24. Gereinigte Plasmid-DNA kann bei -20 C gelagert werden. Die Plasmid-DNA wird in der Sequenzierreaktion zusammen mit dem Primer pjet1.2 for verwendet. Zusatz für schnelle Arbeitsbienen: 8. Restriktionsverdau des Plasmids und Auftragen auf ein Gel Um Herauszufinden, ob im Plasmid das Fragment der richtigen Größe enthalten ist, kann ein Testverdau mit Restriktionsenzymen durchgeführt werden. Dazu wird das Plasmid mit zwei Enzymen, dessen Erkennungssequenzen die MCS flankieren, verdaut. Als Kontrolle wird ein Plasmid ohne Insert ebenso verdaut. 8.1. Restriktionsansatz: Pipettieren Sie folgende Komponenten in ein neues 1,5 ml-tube: Komponente Endkonzentration bzw. Menge Eingesetzte Menge in einem Reaktionsansatz ddh2o 10x FastDigestReaktionspuffer 1x XbaI 1 µl XhoI 1 µl Plasmid-DNA 1 µg Endvolumen: 20 µl Endvolumen: 20 µl 8.2. Mischen und abzentrifugieren Sie den Reaktionsansatz. 8.3. Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37 C im Heizblock (Eppendorf) für 5 min. 8.4. Stellen Sie den Reaktionsansatz auf Eis und geben Sie 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer zur PCR. Seite 12 von 13

Als Kontrolle wird ebenso 1 µg unverdautes Plasmid aufgetragen. 8.5. Gelelektrophorese: Laden Sie den Verdau auf ein 1%iges Agarose-Gel mit kleinen Taschen und legen Sie für ca. 45 min eine Spannung von 120 V an das Gel. Anhang Abb. 5: GeneRuler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific) Seite 13 von 13