Mikrobiologisches Praktikum im Grundmodul GM12 2015 Mikrobiologie der Technischen Universität Kaiserslautern 1
Inhaltsverzeichnis Beschreibung der Praktikumsversuche 1 Untersuchung der Bodenflora 1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl einer Bodenprobe 2 Untersuchung der Flora des Mund- und Nasenraumes 2.1 Isolierung von Streptococcus spp. 2.2 Isolierung von Staphylococcus spp. 3 Wachstum von Bakterien. Erstellen einer Wachstumskurve. 4 Antibiotische Substanzen 4.1 Erstellen eines Antibiogramms von E. coli und Staphylococcus carnosus 4.2 Lantibiotika Produktion von Staphylococcus 5. Bestimmung biochemisch-physiologischer Merkmale 5.1 Katalase 5.2 Verwertung von Zuckern Anhang Material, Medien, Lösungen 2
BESCHREIBUNG DER PRAKTIKUMSVERSUCHE Vorbemerkung: Eine wesentliche Voraussetzung für mikrobiologische Experimente ist das sterile Arbeiten. Durch Vorsichtsmaßnahmen soll gewährleistet werden, dass Mikroorganismen, die sich in der Luft, auf Oberflächen, auf Personen befinden, keinen Eingang in die Experimente finden. Ebenso ist darauf zu achten, dass die Bakterien, die aus der Umwelt (Boden, Körper) isoliert und vermehrt wurden, nicht unkontrolliert im Labor weiterverbreitet werden. Vor allem die Kontamination von Personen mit den Isolaten sollte vermieden werden. Dementsprechend sollte mit bakteriellen Kulturen vorsichtig und ruhig umgegangen werden. Steriles Arbeiten: Sterile Gefäße immer geschlossen halten, zum Gebrauch so kurz wie möglich öffnen. Das Öffnen geschieht stets in der Nähe der Bunsenbrennerflamme. Vorher werden Flaschen und Reagenzgläser kurz am Hals abgeflammt, damit dort warme Luft das Eindringen kalter, unsteriler Luft verhindert. Vor dem Schließen wird der Gefäßrand kurz abgeflammt. Nicht über geöffnete Gefäße greifen, da Keime hineinfallen können. Die Gefäßdeckel wenn möglich in der Hand behalten. Pipettenbehälter werden nur zur Entnahme geöffnet; Pipetten vor Gebrauch kurz durch die Bunsenbrennerflamme ziehen. Falls die Pipette berührt wird, nicht mehr benutzen. Allgemein ist Zugluft zu vermeiden, da die Wirkung der Erwärmung in der Umgebung des Bunsenbrenners zerstört wird. 1. Untersuchungen zur Bodenflora 1.1 Bestimmung der Lebendkeimzahl einer Bodenprobe 1 g Bodenprobe wird in einer Schüttelflasche mit 99 ml sterilem 0.9 % NaCl durch 5-minütiges Schütteln suspendiert und dann davon die Verdünnungsstufen 10-3, 10-4 und 10-5 hergestellt. Davon und von der 10-2 Verdünnung werden jeweils 0.1ml auf LB Agar Platten ausgestrichen. Inkubation der Platten über Nacht bei 37 C. Durch Auszählen der bewachsenen Platten wird anschließend die Keimzahl pro Gramm Boden bestimmt. Die Organismen aus einigen Kolonien werden einem Katalase Test (5.1) unterzogen. Anlegen einer Verdünnungsreihe: Verdünnungsschritte: 1:100 1:10 1:10 1:10 Verdünnungsstufe: 10-2 10-3 10-4 10-5 0,1 ml der Verdünnungsstufen 10-2, 10-3, 10-4 und 10-5 werden auf LB-Agar mittels eines Drigalski-Spatels ausgestrichen. 3
Ausplattieren mit dem Drigalski Spatel: 1. Bakteriensuspension auf die Mitte einer Agar Platte geben. Sofort weiterarbeiten. Nicht lange stehen lassen, da die Flüssigkeit einziehen könnte. 2. Drigalski Spatel in eine Schale mit reinem Ethanol tauchen. Ethanol abtropfen lassen. 3. Spatel durch die Flamme eines Bunsenbrenners ziehen. Am Spatel verbliebenes Ethanol abbrennen lassen. Spatel nicht extrem erhitzen. 4. Spatel am Rand auf den Agar auftupfen, um den Spatel Glas vollständig abzukühlen. Bakteriensuspension gleichmäßig auf dem Agar verteilen. Eine Weile aufrecht stehen lassen. Danach umdrehen und inkubieren. 2.1 Isolierung von oralen Streptokokken (Streptococcus spp.) Mit einem sterilen Wattestäbchen werden Abstriche von der Mundschleimhaut auf einer D-Blutagar Platte ausgestrichen.. Die Platte wirdbei 37 C über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation sollen die Kolonien der unterschiedlichen Ausstriche verglichen werden. Die Koloniemorphologie und und eventuell auftretende Hämolyse sollen beschrieben werden. Die Zellen von unterschiedlichen Kolonien werden einem Katalasetest unterzogen. In diesen Ausstrichen können sich verschiedene Streptokokken, wie z.b. Streptococus mitis, S. oralis, S. mutans, S. salivarius befinden. Andere bakterielle Spezies können unter Umständen ebenfalls vorhanden sein. 2.2 Isolierung von Staphylokokken Mit einem sterilen Wattestäbchen wird ein Abstrich des Nasenraumes auf einer Baird-Parker-Agar Platte ausgestrichen. Zusätzlich können weitere Abstriche, z.b. Ohr, Haut, Haaransatz angefertigt werden. Platten über Nacht bei 37 C bebrüten. Schwarze, gut wachsende Kolonien auf Baird-Parker-Agar stellen Staphylococcus aureus dar, graue, langsamer wachsende Kolonien sind wahrscheinlich Staphylococcus epidermidis oder andere Staphylokokken. Einige Kolonien werden einem Katalase Test (5.1) unterzogen. 3. Wachstum von Bakterien. Erstellen einer Wachstumskurve In dem Versuch soll das Wachstum bakterieller Kulturen durch die Messung der optischen Dichte verfolgt werden. In einer wachsenden Bakterienkultur wird durch Zellteilung die Zahl der Organismen erhöht, was zu einer Zunahme der Trübung des Mediums führt. Die Messung der Trübung, d.h. der optischen Dichte kann daher zur Bestimmung des bakteriellen Wachstums genutzt werden. Drei Röhrchen mit 5 ml Kulturmedium werden mit je 0.5 ml Übernachtkultur oder Glycerinkultur von drei Test Bakterien, Escherichia coli, Staphylococcus carnosus und Streptococcus pneumoniae, beimpft. Von den beimpften Kulturen wird im Photometer die optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) bestimmt.. Danach werden die Kulturen ohne Belüftung bei 37 C im Wasserbad inkubiert und in Intervallen von. 45 Min. 60 Min. wird die OD 600 gemessen. Die erhaltenen Werte werden auf sog. Halb-logarithmisches Papier aufgetragen. Die Einteilung der Zeitachse erfolgt linear, das Auftragen der OD 600 erfolgt dagegen logarithmisch. Im linearen Teil der Kurve kann die Verdopplungszeit abgelesen und damit die Wachstumsrate bestimmt werden. Die Kulturen werden nach dem Ende der Messungen am Nachmittag in den 37 C Brutraum gestellt. Am nächsten Morgen werden die Bakterien durch Vortexen resuspendiert. Zum Abschluss der Wachstumskurve wird noch einmal die OD 600 4
gemessen. Zwei der Kulturen werden für die Versuche zur Antibiotikaresistenz und für den Lantibiotikaversuch weiterverwendet. 4. Antibiotische Substanzen 4.1 Erstellen eines Antibiogramms In diesem Versuch wird das Antibiogramm von Escherichia coli als Vertreter Gram-negativer Bakterien und von Staphylococcus carnosus als Vertreter Gram-positiver Bakterien erstellt. Für diesen Test werden die E. coli und S. carnosus Kulturen der ersten Wachstumskurve benutzt. Jeweils 0,1 ml der Kulturen werden auf je eine LB-Agar Platte mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die ausplattierte Flüssigkeit soll dann für ca. 1 Stunde in den Agar einziehen.. Danach werden 6 Filterplättchen, die verschiedene Antibiotika enthalten, auf die Platte aufgebracht und diese über Nacht bei 37 C bebrütet. Zur Auswertung wird die Größe der Hemmhöfe bestimmt. In diesem Versuchsteil wird die Wirkung von Cephalotin (ein Cephalosporin), Chloramphenicol, Erythromycin, Rifampin, Streptomycin und Tetracyclin untersucht. 4.2 Produktion von Lantibiotika durch Staphylococcus Eine Gruppe von antibakteriellen Peptiden zeichnet sich durch das Vorhandensein von Lanthionin aus und werden deshalb als Lantibiotika bezeichnet. Lantibiotika werden von einer Reihe von Bakterien produziert, unter anderem von verschiedenen Staphylokokken. In dem Versuch werden vier Staphylokokken auf die Produktion von Lantibiotika untersucht. Dazu werden je 0.1 ml der unter 3. beschriebenen Kulturen von E. coli und von S. carnosus auf eine LB-Agar Platte ausgestrichen (Drigalski). Nach Eintrocknen (ca. 1 Stunde) werden die verschiedenen Staphylokokken mit einem sterilen Zahnstocher oder mit der Impföse von der Agar Platte abgenommen und in einer Linie über die vorplattierten Testplatten gestrichen. Die Platten werden über Nacht bei 37 C inkubiert. Die Hemmhöfe zeigen die Produktion von Lantibiotika an. 5. Bestimmung biochemisch-physiologischer Merkmale 5.1 Nachweis von Katalase Das Enzym Katalase produziert aus H 2 O 2 Sauerstoff und Wasser. Das Vorhandensein von Katalase kann mit verdünnter H 2 O 2 -Lösung (3% in H 2 O) getestet werden. Man tropft die Lösung entweder auf Kolonien auf Agar-Platten oder man überträgt eine Impföse Bakterien auf einen Objektträger und tropft dort die H 2 O 2 -Lösung auf. Das Aufschäumen (Sauerstoffbildung) zeigt die Katalase Aktivität an. In dem Experiment sollen Katalase Tests mit Eigenisolaten (Boden, Mund, Nase, 1.1, 1.2, 2.1, 2.2) durchgeführt werden. 5.3 Verwertung von Zuckern Die Verwertung von Zuckern wird häufig durch die Bildung von Säure angezeigt. Eine Reihe von Nachweisen zur Zuckerverwertung beruht auf dem Nachweis der Säureproduktion durch geeignete ph Indikatoren. 5.3.1 Nachweis der Lactose-Verwertung; Nachweis der ß-Galactosidase Aktivität Zum Nachweis der Lactose-Verwertung werden zwei Agar Platten eingesetzt, Chinablau-Lactose Agar und MacConkey Agarplatten. In beiden Agarplatten ist Lactose enthalten. Der Abbau der Lactose wird in beiden Platten durch ein Ansäuern des Mediums mit Hilfe von ph-indikatoren angezeigt. Auf Chinablau-Lactose Agar erscheinen Lactose-fermentierende Organismen blau, auf MacConkey Agar dunkelrot. Chinablau-Lactose Agar enthält keine Hemmstoffe, er ist also geeignet für Gram-positive und Gram-negative Bakterien, MacConkey Agar enthält dagegen Gallensalze und Kristallviolett, wodurch das Wachstum von Gram-positiven Bakterien gehemmt wird. Die Aktivität der ß-Galactosidase, des Enzyms, das für die Spaltung von Lactose in Glucose und GaLactose verantwortlich ist, kann auf Agar Platten nachgewiesen werden, die das chromogene Substrat X-Gal ((5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D- Galactopyranoside) enthalten. Die Aktivität der ß-Galactosidase ist an der Entwicklung einer blauen Farbe erkennbar. Die zu testenden Organismen werden auf den Platten mit der Impföse ausgestrichen und über Nacht bei 37 C inkubiert. 5
Anhang Material, Medien, Lösungen Nährböden/Medien Die Angaben gelten, wenn nicht anders vermerkt, für 1 l dest. Wasser. Zur Verfestigung Zusatz von 1,5 % (g/v) Agar. LB-MEDIUM / LB-AGAR Trypton 10,0 Hefeextrakt 5,0 NaCl 10,0 (Agar 15,0) LB-X-Gal Agar Platten Zugabe von 60µg/ml X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-Galactopyranosid). THB-Medium (Todd-Hewitt Broth) Komplex-Medium zur Anzucht von verschiedenen Bakterien, u.a. Streptococcus pneumoniae. Herzinfusion Pepton Glucose Natriumcarbonat Natriumchlorid Dinatriumphosphat ad 1000ml 3,1 g 20,0 g 2,0 g 2,5 g 2,0 g 0,4 g D-AGAR (Blutagarplatten für S. pneumoniae oder Streptococcus mitis) Glucose 1 Bactopepton 10 Neopepton 5 Yeast-extract (Hefe-Extract) 1,25 NaCl 5 Tris 1,25 AGAR 16,5 Pro 100 ml Medium werden 3 ml defibriniertes Schafsblut zugegeben gut durchmischt und dann umgehend die Platten gegossen. Zu heißer Agar führt zum Platzen der Erythrocyten und zu einer Braunfärbung der Platten! BAIRD PARKER AGAR Verwendungszweck: Nachweis von Staphylococcus aureus. Schwarze Kolonien zeigen die aerobe Reduktion von Tellurit zu metallischem Tellur an. Natriumpyruvat und Glycin wirken auf Staphylokokken wachstumsfördernd, während Lithiumchlorid und Tellurit auf die übrige Begleitflora hemmend wirkt. 6
Pepton aus Casein 10,0; Fleischextrakt 5,0; Hefeextrakt 1,0; Natriumpyruvat 10,0; Glycin 12,0; Lithiumchlorid 5,0; Agar 15,0. Zubereitung: 58 g des Trockennährbodens werden in 950 ml destilliertem oder voll-entsalztem Wasser suspendiert, 15 min eingeweicht, zum Lösen vorsichtig erhitzt und 1 min gekocht. Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven bei 121 C für 15 min. Danach wird das Medium auf ca. 48-55 C abgekühlt. Danach 50 ml einer Eigelb-Tellurit Emulsion zugeben. CHINABLAU LACTOSE AGAR Nährboden zur Unterscheidung Lactose-positiver und Lactose-negativer Mikroorganismen sowie zur Keimzahlbestimmung in Milch. Wirkungsweise: Der Nährboden ohne Hemmstoffe enthält Lactose als C-Quelle, deren Abbau zu Säure vom ph-indikator Chinablau durch einen Farbumschlag von farblos nach blau angezeigt wird. Fleischextrakt 3,0 Pepton aus Casein 5,0 Natriumchlorid 5,0 Lactose 10,0 Chinablau 0,375 Agar 12,0 ph 7,0 0,2 Zubereitung: 35,5 g /Liter, durch Erhitzen lösen, 15 min autoklavieren MacConkey Agar Der Agar ist ein Selektivmedium zur Isolierung und zum Nachweis von Enterobakterien in klinischem Material, Wasser, Milch, Milchprodukten und anderen Nahrungsmitteln. Wirkungsweise: Durch Kristallviolett und Gallesalze werden die Grampositiven Keime weitgehend unterdrückt. Die Lactose dient zur Differenzierung von Lactose-positiven und -negativen Bakterien. Lactose-abbauende Mikroorganismen bilden Säure. Die Reduktion des ph wird durch Neutralrot angezeigt. Lactose-positive Kolonien sind dunkelrot. MacConkey-Agar (in g/l) (Mengen für 1 Liter): Bacto Pepton 20,0 Bacto Gallensalze 3,0 NaCl 5,0 Neutralrot 0,03 Kristallviolett 0,001 Lactose 10,0 Agar 13,5 7