Anwendung von Botulinumtoxin (BoNT) bei neurologischen Indikationen ÖPG/ÖDBAG Zertifizierungskurs Teil 1 Allgemeines Modul 2 Th. Sycha Universitätsklinik für Neurologie, AKH-Wien thomas.sycha@meduniwien.ac.at botulium@meduniwien.ac.at
ÖPG/ÖDBAG Zertifizierungskurs Allgemeines Modul 2 Übersicht 1.) Pharmakologische Aspekte 2.) Rechtliche Aspekte 3.) Praktische Hinweise
ÖPG/ÖDBAG Zertifizierungskurs ALLGEMEINES MODUL 2 Pharmakologische Aspekte Übersicht Struktur Bindung Internalisierung Translokation Proteaseaktivität
Struktur 7 Serotypen (A-G) Bildung durch Clostridien (botulinum, barati, butirycum) Polypeptidkette [150 kda] Schwere Kette (H-Chain) [ca. 100 kda] Leichte Kette (L-Chain) [ca. 50 kda]
Struktur 3 funktionelle Bereiche: H-Chain C terminale 50 kda Bindung H-Chain N terminale 50 kda Translokation L-Chain katalytische Aktivität Singh, 2006
Struktur H-Chain C terminale 50 kda Bindung HC-1 N-terminal: Zucker-Bindung? HC-2 C-terminal: Protein-Bindung? Singh, 2006
Struktur Darstellung der Proteinstruktur HC-1 HC-2 LC HC-N Ahsan, 2006 Lacy, 1998
Bindung Ganglioside Clostridien Toxine binden an G D1b, G T1b, G Q1b: Inkubation von Toxin mit Gangliosiden Wirkung an neuromuskulären Endplatte vermindert Vorbehandlung von Zellen mit Gangliosiden erhöhte Wirkung Vorbehandlung von Zellen mit Neuraminidase verminderte Bindung Schiavo, 2000
Bindung Proteine Neurotransmitter-Freisetzung schnellerer Wirkung (Hughes, 1962) BoNT/B bindet an Synaptotagmin (+Ganglioside) (Nikishiki, 1994) BoNT/G bindet an Synaptotagmin (-Ganglioside) (Rummel, 2004) BoNT/A Proteinrezeptor?
Bindung Depolarisation der Nervenzellen mittels K+ Bufferlösung Stimulation der Neurotransmitterauscheidung Mouse hemi-diaphragma immunostaining Exozytose von synaptischen Vesikeln exponiert BoNT/A Rezeptoren
Bindung Aktivitätsabhängige Aufnahme in Hippocampus-Neurone von Ratten (gemeinsam mit Synaptotagmin) Hippocampus-Neuron immnostaining BoNT/A Rezeptoren sind in sekretorischen Vesikeln vorhanden Bindung und Aufnahme von BoNT/A sind aktivitätsabhängig!!!
Bindung Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen bekannte synaptische Vesikelproteine Rattenhirnnervenzellextrakt - Immunpräzipitation SV2 (synaptisches Vesikelmembranprotein) ist der BoNT/A Proteinrezeptor
Bindung SV2 (Synaptisches Vesikelmembranprotein) lokalisiert in synaptischen und endokrinen Vesikeln strukturell verwandt mit Neurotransmitter-Transporter 3 Isoformen SV2-A,-B,-C (Janz, 1999) Funktionell: Ca ++ Regulation (Südhof, 2004) 12 Transmembran-Domänen Toxinbindungsstelle: stark glykosilierte Loop (L4)
Bindung Hippocampusneurone von Knock-out Mäusen Immunostaining
Bindung Überlebenszeit von Knock-out Mäusen nach intraperitonealer BoNT/A Applikation
Bindung Zusammenfassung Der Protein-Rezeptor von BoNT/A ist SV2 BoNT/A bindet hochselektiv aktive Neurone (Exozytose ist Voraussetzung) BoNT/B wird über Synaptotagmin I und II aufgenommen Beide Proteinbindungen werden durch Gangliosidbindungen unterstützt Gangliosid-Protein Doppelrezeptormodell
Internalisierung Endozytose im Rahmen des Vesikel recycling Temperatur und energieabhängiger Prozeß BoNT als Trojanisches Pferd
Translokation Freisetzung der LC ins Zytosol ph-abhängiger Prozeß (ph 4,4-4,6) neutrale Form (wasserlöslich) saure Form (fettlöslich) HC-N als Endosomenmembran-Kanal (Koriazova, 2003) Gangliosid-angereicherte Doppellipidschicht als Membranmodell 50 Å HC-N HC-N 15 Å
Translokation Sekundärstruktur CD-Spektroskopie bei ph 4.5 7.0: keine wesentliche Änderung der Sekundärstruktur
Translokation Tertiärstruktur Tryptophan Fluoreszenz Verteilungsprofile: mit sinkendem ph breiter höhere Heterogenität ph = 7.0 Zunahme der Anisotropie: Zunahme mit sinkendem ph LC größer oder länger; max. bei ph 5.0 ph = 5.0
Translokation Konformationsänderung ANS-Fluoreszenz: Zunahme der Intensität mit sinkendem ph vermehrt hydrophobe Strukturen exponiert Bei niedrigem ph: Sekundärstruktur erhalten Tertiarstruktur heterogen hydrophobe Strukturen vermehrt molten globule state
Translokation Schematisches Modell der LC von BoNT/A Strukturänderung ph 7.0 ph5.0: molten globule state Übergang in längliche Form bei erhaltener Sekundärstruktur; exponierte hydrophobe Gruppen (für spezifische Interaktionen mit HC-N bzw der Zell-Membran?)
Translokation Zusammenfassung: Die Translokation der katalytischen Einheit erfolgt: mit Hilfe der N-terminalen Domäne der HC als Vesikelmembrankanal über eine ph abhängige Zustandsänderung der LC ( molten globule state ) Die Sekundärstruktur der LC bleibt hierbei erhalten
Übersicht Bindung Internalisierung Translokation Proteaseaktivität
Proteaseaktivität Die LC von BoNT spaltet spezifisch Aminosäurebindungen des SNARE-Vesikelfusionskomplexes: BoNT/A BoNT/B SNAP-25 Syntaxin BoNT/B,D,F,G VAMP Acetylcholin-gefüllte Vesikel können nicht mehr mit der präsynaptischen Membran fusionieren neuro-muskuläre/glanduläre Blockade
Proteaseaktivität BoNT/A,C,E SNAP-25 BoNT/B Syntaxin BoNT/B,D,F,G VAMP
Wirkung dosisabhängige Wirkung Wirkdauer: ca. 3 Monate (neuromuskulär) ca. 6 Monate (neuroglandulär) nach Inaktivierung des Toxins und Neubildung von Fusionsproteinen normale synaptische Übertragung keine persistierende morphologischen Veränderungen