Virale Expressionsstrategien Ziel: Abruf der im Genom gespeicherten Information zur richtigen Zeit und in der richtigen Menge
Genomgrössen von verschiedenen sequenzierten Organismen Amoeba dubia 670 billion (= 10 9 ) bp Plasmodium falciparum 0.023 billion bp http://www.genomenewsnetwork.org/articles/02_01/sizing_genomes.shtml
Genomgroessen von verschiedenen Viren: DNA Viren DNA Virus: Mimivirus Wirt: Amoeba DS DNA Genom 1.2 x 10 6 BP 911 Gene > 400 nm ø. DNA Virus: Circovirus Wirte: Schwein, Vögel ES (-) DNA Genom 1.8-2.3 x 10 3 Basen 12-26 nm ø;.
Genomgroessen von verschiedenen Viren: RNA Viren Coronavirus Wirt: Säugetiere SS (+) RNA Genom 16-21 x 10 3 Basen 80-160 nm ø; Behüllt. Picornavirus Wirt:Wirbeltiere, Insekten ES (+)RNA Genom 7.2-8.4 x 10 3 Basen 28-30nm ø; Unbehüllt.
Baltimore Klassifikation zur Einteilung der Viren.
DNA Viren der Wirbeltiere: Baltimore Klassen I-II Properties Family name Virion polymerase Virion ø(nm) Genome size (kbp) Classification Criteria Nucleic Acid Capsid Symmetry Naked or enveloped Genome architecture Baltimore class From Fig. 1.10. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
RNA Viren der Wirbeltiere: Baltimore Klassen III-V From Fig. 1.10. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Retroviren: Baltimore Klasse VI Beispiel HIV Classification criteria Properties Nucleic Acid RNA Symmetry of capsid? conical morphology Naked or enveloped enveloped Genome architecture (+) SS Baltimore class VI Family name Retro Virion polym erase Yes Virion diameter (nm) 145 ± 25 Genome size (kbp) ~10
Anforderungen an Informationsspeicherung und -Abruf bei Viren Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms; Zeitliche Koordination der Synthese viraler Bestandteile; Behauptung in der Konkurrenz um zelluläre Ressourcen; Erhaltung der Virusfamilie: Vermehrung; Erhaltung auch unter ungünstigen Bedingungen;
Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms Beispiel HIV: 1 Gen ergibt 15 Proteine vif http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit2/viruses/hivgenes.html
Maximale Ausnutzung der Speicherkapazität des Genoms Beispiel HIV: Überlappende Leseraster LTR Gag Pol Vif Vpr Vpu Rev Tat envenv Nef LTR
Der Preis: Veränderung eines Nukleotids kann sich auf mehrere Proteine auswirken Env Rev Tat... C T C C C A A T C L G T T T C A G A C C C A C C T C C C A A T C C C G A G G G G A C C C G A C A G G C C C G A A G G A A Env (gp 41) F Q T H L P I P R G P D R P E G Rev Exon 2 D P P P N P E G T R Q A R R N Tat Exon 2 P T S Q S R G D P T G P K E Substitution: C -> T S P P Q N G T T T C A G A C C C A C C T C C T A A T C C C G A G G G G A C C C G A C A G G C C C G A A G G A A Env (gp 41) F Q T H L L I P R G P D R P E G Rev Exon 2 D P P P N P E G T R Q A R R N Tat Exon 2 P T S I Auswirkungen: Env (gp 41) CCA -> CAA P -> Q Rev Exon 2 CCC -> CCA kein Effekt Tat Exon 2 CAA -> AAA Q -> K
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information RNA-Prozessierung Alternatives Splicing von einem Primär-Transkript Beispiele: Adenoviridae Orthomyxoviridae Papillomaviridae Polyomaviridae Retroviridae From Fig. 3.10. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Voraussetzung: mrnas müssen in den Zellkern Balt. Genom 1 Familien RNA Klasse (Beispiele) Syntheseort 2 I dsdna Herpesviridae K Adenoviridae K Papovav iridae K Poxviridae Z II esdna Parvovoridae K III dsrna Reoviridae Z (segmentiert) IV (+) esrna Picornaviridae Z Coronaviridae Z Flaviviridae Z Togaviridae Z V (-)ssrna Orthomyxov iridae K (segmentiert) unsegm. Paramyxovi ridae Z Rhabdov iridae Z VI RNA ->DNA Retroviridae K VII DNA 3 ->RNA Hepadnaviridae K 1 Ds: doppelsträngig; es: einzelsträngig. 2 Z = Zytoplasma; K = Kern 3 DNA-Viren mit RNA als Zwischenstufe
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information RNA-Synthese Überlappende Transkriptionseinheiten: Bildung von verschiedenen Primär-Transkripten Beispiele: Adenoviridae Hepadnaviridae From Fig. 3.10. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information RNA-Prozessierung Editieren der RNA Sequenz: Gezielte Veränderung des Ribonukleotids während oder nach Synthese Beispiele: Paramyxoviridae: Filoviridae: Hepatitis delta Satelliten virus: Ko-transkriptionell Ko-transkriptionell Post-transkriptionell
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese Leaky Scanning: Start der Translation an verschiedenen Start-Kodons möglich Beispiele: Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Polyomaviridae Retroviridae
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese Wiederbeginn der Translation an einem stromabwärts gelegenen Start-Kodon: Voraussetzung: Strom-Aufwärts gelegenes Start Codon. Beispiele: Orthomyxoviridae Herpesviridae
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese IRES (internal ribosmal entry site): Bindung von Ribosomen an interne Sequenzen des Transkripts Beispiele: Flaviviridae Picornaviridae
Strategien zum Abruf und zur Umsetzung der im Genom gespeicherten Information Proteinsynthese Überlesen von Translations-Stop-Signale Beispiele: Alphaviruses Retroviridae
Translationsstrategien von Viren Proteinsynthese von poly-cistronischen mrnas UTR: Untranslated region ORF: Open reading frame Fig. 11.1. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Regulation der Initiation der Translation Translationsinitation von zellulären mrnas: Vorrangiger Mechanismus Interaktion der 40S Untereinheit der Ribosomen mit verschiedenen Initiationsfaktoren und mit Met-tRNA i ; Interaktion des Prä-Initiationskomplexes mit der mrna; Scanning der mrna bis zum Start-Codon (oft das erste ATG) Freisetzung der Initiationsfaktoren und Zusammenbau des vollständigen Ribosoms Proteinsynthese
Regulation der Initiation der Translation Das RNA Cap : Essentiell für die Translation von vielen mrnas in eukaryotischen Zellen 5 Ende der mrna http://cats.med.uvm.edu/cats_teachingmod/microbiology/courses/gene_regulation/pro_euk/2.6.grg.cap.html
Regulation der Initiation der Translation: 1 2 3 4 5 Fig. 11.3A. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Regulation der Initiation der Translation Leaky Scanning : Überlesen des ersten Start-Kodons beim Scanning Beispiele: Viral Source Identifier Sequenc e Proteins flanking first AUG codon SV40 Late 19S mrna UCCaugG VP2 u. VP3 Cellular Hepatitis B Virus capsid proteins 2.1 kb mrna GCCaugC Middle and small surface proteins HIV-1 Spliced mrna CCUaugG Rev and Nef regulatory proteins Glucocorticoid receptor gene Optimal sequence human CUGaugG Long and short trans-activators GCCR*CCaugG Kozak M., 2002. Gene 299, 1-34 *R = Purine (A oder G)
Regulation der Initiation der Translation Wiederbeginn der Translation durch erneute Gewinnung von mettrnai durch die an RNA gebundenen 40 S Untereinheit. Voraussetzungen: Stromaufwärts-gelegener offene Leseraster; CMV gp48 Influenza B Virus RNA Segment 7 Stop Start Fig. 11.12. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Alternative Strategien zur Translationsinitiation IRES: Internal Ribosomal Entry Site Initiation der Translation ist abhängig von einer RNA- Sekundärstruktur, nicht von der CAP-Struktur.
Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES Type I: Poliovirus Type II: Encephalomyocarditis virus From Fig. 11.5. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES Cap-abhängige Initiation IRES-gesteuerte Initiation Bei Poliovirus: Spaltung von eif4g durch virale protease 2A pro : => Hemmung der zellulären mrna Synthese; Stimulation der Translation an der IRES Fig. 11.3C. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Schematic representation of the cap-dependent ribosome scanning (left panel) and internal initiation (right panel) pathways for the formation of 80 S initiation complexes Komar, A. A. et al. J. Biol. Chem. 2005;280:23425-23428 ITAF: IRES trans-acting factors
Alternative Strategien zur Translationsinitiation: IRES Hepatitis C Virus: Typ III IRES Direkte Bindung von 40S Untereinheit mit IRES Konformationsänderung der 40S Untereinheit => Positionierung des ATG; Bindung von Met-tRNAieiF2-GTP Komplex Translationsstart Fig. 11.5 and 11.3A,C. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Verwendung von IRES fuer die Molekularbiologie: Koexpression von Selektions-Bzw. Markergenen. Box 11.2. Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Leserasterverschub Problem: Gag und Protease bzw. Gag und Protease und Pol werden von unterschiedlichen Lesrastern kodiert. Lösung: kontrolliertes Rutschen der Ribosomen in ein anderes Leseraster. http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/retroviruses.html
Programmierter -1 Leserasterverschub Gag-Protein Leserasterverschub: Gag-Protease-Pol http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/retroviruses.html Gag; 1. Leserasterverschub: Gag-Protease 2. Leserasterverschub: Gag-Protease-Pol
FIGURE 1. Overview of programmed -1 ribosomal frameshifting Linker Region Rutsch-Stelle: X XXY YYZ G GGA AAC XXX: 3 identische Nukleotide YYY: 3 identische Nukleotide Z: A,C oder U; nicht G Ribosom pausiert während der Elongation Pseudoknoten Verlagerung des Ribosoms um eine Position in 5 Richung EWAN P. PLANT et al. RNA 2003; 9: 168-174 Verschiebung des Leserasters; Auflösen des Pseudoknotens
Leserasterverschub bei dem SARS-Coronavirus. S: Spike; E: Envelope; N: Nucleocapsid; M: membrane protein; ORF, X: weitere Leseraster. Ramos, FD et al., 2004, BiochemSoc Transact.32, 1081-1083
RNA Pseudoknoten Strukturen in verschiedenen Coronaviren. Ramos, FD et al., 2004, BiochemSoc Transact.32, 1081-1083
Modell für den Beitrag von Pseudoknoten zum Leserasterverschub. EWAN P. PLANT et al. RNA 2003; 9: 168-174
Überlesen vom Terminations-Kodon: Murines Leukämie Virus Gag Pro Pol Pseudoknoten http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/retroviruses.html Staple DW and Butcher SE 2005.PLoS 3, 956-959. Fig. 11.13 Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Die Wunderwaffe der Viren Regulationsfaktoren Aufgaben: Aktivierung/Hemmung der Expression von viralen Proteinen; Priming der Zelle für die Virusreplikation; Zeitliche Koordination der Virusreplikation Gemeinsame Eigenschaften Multifunktionell; Interagieren mit vielen verschiedenen Proteinen
Virale Transkriptionsaktivatoren Beispiele von viralen Transkriptions-Regulatoren, die keine Sequenz-spezifische DNA Bindung zeigen. Faktor Virus Interaktion mit Effekt zellulären DNAbindenden Proteinen E1A Adenovirus TFIID Aktivierung/Repression (289; 243 AS) Tax HTLV CREB VP16 Herpes OCT-1 Aktivierung simplex virus EBNA2 EBV RBP-J Aktivierung
Virale Transkriptionsaktivatoren Beispiele von viralen Transkriptions-Regulatoren, die an spezifische Nukleinsäure Signale binden. Faktor Virus Wirkung Effekt durch direkte Bindung an Signale in Nukleinsäuren ICP4 Herpesvirus DNA Aktivierung/Repression T-Antigen Polyom avirus DNA Aktivierung (spät Gene); Repression (frühe Gene) Tat HIV RNA Aktivierung
Einige Grundlagen zur Transkription: Der Promoter Aus Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Einige Grundlagen zur Transkription: Beipiele für virale Promotoren Fig. 8.4 Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Beispiel eines wichtigen zellulären Transkriptionsfaktors: NFkappaB Fig. 8.6A aus Principles of Virology ;SJ. Flint, L.W. Enquist, V.R. Racaniello, A.M. Skalka;ASM Press; 2004; 2nd Edition
Beispiel eines wichtigen zellulären Transkriptionsfaktors Beispiele für virale Promotoren die durch NFkappaB aktiviert werden: HTLV-I HIV-1 SV40
Beispiel eines viralen Transkriptionsregulators: Polyoma T-Antigen Aus Fields Virology, D.M.Knipe, P.M. Howley, Lippincott Williams & Wilkins.2001, p. 2156.
Die Kontrollregion im SV40 Genom Aus Fields Virology, D.M.Knipe, P.M. Howley, Lippincott Williams & Wilkins.2001, p. 2146.
Beispiel eines viralen Transkriptionsregulators: HSV VP16 VP16 500-1000 molecules α-genes Immediate early Latency β-genes early + - γ-genes late Virus particle:http://www.stdgen.lanl.gov/stdgen/bacteria/hhv1/herpes.html
VP16 funktioniert als Komplex mit zellularen Faktoren Acidic activation domain HCF-1: human factor C1 Oct-1: Octamer 1 transcription factor Wysocka J and Herr W. 2003.TIBS 28, 294-304. POU domains
VP16 Domänen AD: Transkriptions-Aktivierungsdomäne Core-Domäne: Essentiell für die Bildung von VIC (VP16-induced complex); Interagiert mit Oct-1 und HCF-1; Nur schwache DNA Bindung alleine; Sequenz konserviert zwischen verschiedenen α-herpesviren; Wysocka J and Herr W. 2003.TIBS 28, 294-304.
VIC: Warum so kompliziert? Mögliche Erklärung: Oct-1 und HCF-1 sind wichtig für die Zellproliferation; Durch die Interaktion mit diesen beiden Faktoren tastet VP16 die Bereitschaft der Zelle für die Virusreplikation ab (lytische Phase).