D-(+)-Biotin (Vitamin H)

D-(+)-Biotin (Vitamin H) Benedikt Jacobi 28. Januar 2005 1

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Aufgabenstellung: Prüfung der Stabilität von Biotin (Vitamin H) unter alltäglichen Bedingungen (Kochen, Mikrowelle, UV-Licht).. 1 1.2 Allgemeine Daten zu Biotin....................... 1 1.3 Kernspinresonanz............................. 3 2 Experimentelles 3 2.1 Stabilitätsuntersuchungen........................ 3 2.2 Zuordnung................................. 9 3 Ergebnisse 15 3.1 Zuordnung................................. 15 3.2 Stabilität.................................. 15 3.3 Schlussfolgerung............................. 16 i

1 Einleitung 1.1 Aufgabenstellung: Prüfung der Stabilität von Biotin (Vitamin H) unter alltäglichen Bedingungen (Kochen, Mikrowelle, UV- Licht) Vor den 3 Experimenten habe ich jeweils die Probe vorbereitet. Ca. 0,01 Gramm Biotin in 5ml D 2 O gelöst. Einmalig wurden 500 µml der D 2 O-Lösung mit Biotin in ein NMR-Röhrchen abgefüllt um als Vergleichsbasis zu den Proben nach den Experimenten zu dienen. Je nach Experiment haben wir jeweils eine dieser 3 Proben einem der verschiedenen Einflüsse ausgesetzt: 3 Stunden im Heizblock bei 95 C erhitzt, 3 Stunden in einem Schälchen unter eine UV-Lampe gestellt oder 15 Minuten in einem Wasserbad in der Mikrowelle erhitzt. In bestimmten Zeitabständen wurden den Lösungen Proben von 500 µml entnommen und in NMR-Röhrchen gefüllt. Beim Heizblock nach 5, 10, 15, 20, 30, 60 und 180 Minuten Unter der UV-Lampe nach 5, 10, 15, 20, 30, 60 und 180 Minuten In der Mikrowelle nach 2, 4, 10 und 15 Minuten Später haben wir die einzelnen Proben im 400 MHz Spektrometer vermessen. Bis dahin wurden die Proben im Kühlschrank aufbewahrt. 1.2 Allgemeine Daten zu Biotin Nat. Vorkommen: Biotin kommt überwiegend gebunden an Proteine, in Eigelb, Pflanzensaaten, Hefe und tierischen Geweben vor. Aber auch als Biocytin, einer Verbindung mit Lysin, in Gemüse, Früchten und Milch. Summenformel: C 10 H 16 N 2 O 3 S Molmasse: 244,32 g/mol 1

Beschreibung: Reines Biotin besteht aus langen. farblosen Nadeln und ist empfindlich gegen Sauerstoff und UV-Licht. Gegen Luft, Tageslicht und Wärme ist es allerdings relativ stabil. In kaltem Wasser ist es nur wenig, in heißem etwas besser löslich. Der Schmelzpunkt liegt bei ca. 232 C. Funktion: Biotin ist Bestandteil vieler körpereigener Enzyme, die einerseits beim Abbau bestimmter Aminosäuren benötigt werden und andererseits zur Bildung langkettiger Fettsäuren beitragen. Biotin spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Neubildung von Kohlenhydraten aus Nichtzuckerstoffen wie Fett und Eiweiß. Bei Biotinmangel können leichte Hautentzündungen mit Rötung und Schuppung der Haut, sowie gestörte Talgproduktion vorkommen. Täglicher Bedarf: Der Bedarf ist abhängig von der Menge und Herkunft des anderweitig zugeführten Eiweißes. Im Duchschnitt wird für den täglichen Bedarf eine Menge von 150-300 Mikrogramm angegeben, bei der auf keinen Fall ein Mangel auftreten kann. Da Biotin wasserlöslich ist und daher mit dem Harn augeschieden werden kann, sind bisher keine Überdosierungserscheinungen bekannt. Abb. 1: Struktur von D-(+)-Biotin (= Vitamin H) 2

1.3 Kernspinresonanz a) b) c) Abb. 2: Schematische Darstellung der beobachtbaren H-C Korrelationen Das COSY-Spektrum zeigt Protonen die sich über 3 Bindungen sehen. Siehe a) in Abb. 2 Das HSQC-Spektrum zeigt Kohlenstoff zu unmittelbar benachbarten Protonen. Siehe b) in Abb. 2 Das HMBC-Spektrum zeigt Kohlenstoff zu Protonen über mehrere Bindungen. c) in Abb. 2 Mit diesen relativen Daten ist eine Zuordnung der Resonanzen für die meisten Kerne möglich. Einzig der Carbonyl-Kohlenstoff zwischen den NH Gruppen ist nicht sichtbar, außer im 13 C-1D Spektrum 2 Experimentelles 2.1 Stabilitätsuntersuchungen Aufgrund der allgemeinen Informationen zu Biotin erwarten wir nur bei den Experimenten mit Mikrowelle und UV-Licht eine Zersetzung, siehe Seite 3 Abschnitt, Beschreibung. 3

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm Abb. 3: Spektren vom Heizblockexperiment übereinandergelegt. Cyan = 5 Minuten Orange = 10 Minuten Pink = 15 Minuten Blau = 20 Minuten Grün = 30 Minuten Rot = 1 Stunde Schwarz = 3 Stunden. Wie man sieht verändern sich die Spektren kaum, das Biotin bleibt also intakt. 4

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm Abb. 4: Spektren vom Heizblockexperiment leicht versetzt. Cyan = 5 Minuten Orange = 10 Minuten Pink = 15 Minuten Blau = 20 Minuten Grün = 30 Minuten Rot = 1 Stunde Schwarz = 3 Stunden. 5

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm Abb. 5: Spektren nach dem UV-Licht Experiment übereinandergelegt. Rot = Unbehandelte Probe Cyan = 5 Minuten Schwarz = 3 Stunden. Bereits nach 5 Minuten sind erstmals kleine neue Peaks zu erkennen, die Abbauprodukte sein müssen. 6

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm Abb. 6: Spektren nach dem Mikrowellenexperiment übereinandergelegt. Cyan = 2 Minuten Orange = 4 Minuten Pink = 15 Minuten. Man sieht nach 15 min erstmals schwache neue Peaks auftreten, die Abbauprdukte sein müssen. 7

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm Abb. 7: Spektren nach dem Mikrowellenexperiment leicht versetzt. Cyan = 2 Minuten Orange = 4 Minuten Pink = 15 Minuten. 8

2.2 Zuordnung Auf den folgenden 3 Seiten sind 2D Spektren von Biotin abgebildet, die mit einem 600 Mhz Spektrometer mit Cryokopf aufgenommen wurden. Sie werden benötigt, um den Atomen im Biotinmolekül Resonanzfrequenzen zuzuordnen. 9

pp 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.5 8.0 1.60 1.65 8.5.5 1.70.0 1.65 1.60.5 1.50 1.55.0 1.45.5 1.40.0.5 1.35 1.70 b) 1.30 ppm.0.5 7.5 1.55 7.0 1.40 1.45 1.50 6.0 1.35 5.5 ppm ppm 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5.0 4.0.5 3.5.0 3.0.5 2.5.0.5 2.0 4.5 a) 1.5 ppm pm Abb. 8: COSY-Spektrum von Biotin. Nur im Bereich < 4.7 ppm ist Signal zu sehen, dieser Bereich ist in a) vergro ßert dargestellt. Um die Signalform genauer zu zeigen ist ein Bereich um 1.5 ppm in b) vergro ßert dargestellt. 10

ppm 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 ppm 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 ppm 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm Abb. 9: Hsqc-Spektrum von Biotin. Das kleine Bild zeigt den Abschnitt in dem sich die Peaks befinden vergrößert. Das Spektrum ist nicht vollständig, vermutlich wegen zu kurzer Messzeit. 11

ppm 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1.60 1.55 1.50 1.45 1.40 1.35 1.30 1.25 ppm 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm Abb. 10: HMBC-Spektrum von Biotin. Das kleine Bild zeigt einen Abschnitt, in dem sich viele Peaks befinden, vergrößert. 12

210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm Abb. 11: Kohlenstoff 1D Spektrum. Es sind nicht alle erwarteten Signale zu beobachten. 13

Tabelle 1: In der Tabelle sind alle indentifizierten Protonen verzeichnet. Die mit Sternchen versehenen Werte stimmen nicht mit unseren Erwartungen überein. COSY HMBC HSQC 4,51 4,34 1,34 24,5 2,12 15 4,32 61,8 4,34 4,52 1,34 27,4 2,25 24,7 4,47 60,2 4,51 2,90 1,34 34,4 2,25 28,0 3,25 55,2 4,34 3,25 1,34 55,2 2,25 180 2,8 40 3,25 1,64 1,50 24,4 2,69 55,2 *1,3 28 3,25 1,50 1,50 2,69 60,2 27,9 2,90 2,69 1,50 2,71 55,2 61,8 2,69 2,91 1,50 2,71 60,2 61,8 2,25 1,55 1,53 3,25 27,3 180 1,54 2,26 1,53 4,33 39,4 34,3 1,50 1,64 1,55 4,33 55,0 27,9 1,50 1,34/5 1,64 4,51 39,4 24,3 1,55 1,34/5 1,55 4,51 55,1 27,9 1,64 1,35 1,64 24,3 1,64 27,8 1,64 55,2 *1,64 61,8 Tabelle 2: Die - bzw. + Zeichen bedeuten, dass der darüberstehende ppm Wert bis zum letzten der jeweiligen Zeichen zu den dazugehörigen ppm Werten gehört 13 C 1H I 61,6 1,34 2 2,90 1 59,9 1,35-3,25 1 55,0 1,37-4,34 1 39,2 1,54 4 4,51 1 34,4 1,64 + 2,12 1 27,3 2,26 2 24.2 2,68 1 14

3 Ergebnisse 3.1 Zuordnung Die in Abb. 12 grün eingezeichneten Protonen können im Spektrum nicht gesehen werden, weil sich das Biotin in einer D 2 O-Lösung befindet, in welcher diese Protonen austauschen. Abb. 12: Zuordnung der Resonanzen zu den Atomkernen von D-(+)-Biotin. Kohlenstoff chemische Verschiebungen sind in rot, Protonen chemische Verschiebungen in blau eingezeichnet. Die grünen Protonen sind nicht beobachtbar wegen Austausch. 3.2 Stabilität Unsere auf die Literatur bezogenen Vermutungen haben sich bestätigt. Wie in den Spektren der verschiedenen Experimente zu sehen ist hat sich das Biotin nach 3 Stunden im Heizblock bei 95 Grad kaum verändert, es ist also relativ stabil bei Wärme. Unter UV-Licht hat sich das Biotin, wie man in den Spektren erkennen kann, verändert, es ist teilweise zerfallen. Nach 15 Minuten in der Mikrowelle sind ganz deutlich starke Veränderungen in den Spektren zu sehen, das Biotin ist teilweise zerfallen. 15

Bei einem zusätzlichen Experiment, bei dem ich etwas Milch in D 2 O gegeben habe und ein zweite Probe darüber hinaus mit Biotin versehen habe und beide Proben dann vermessen habe, habe ich festgestellt, dass Biotin entweder gar nicht, oder nur extrem gering in Milch enthalten ist, da sich in der zweiten Probe die Peaks nicht sichtlich verändert haben. 3.3 Schlussfolgerung Lebensmittel, die Vitamin H enthalten, kann man ohne Bedenken auch länger kochen, allerdings sollte man es vermeiden, sie in der Mikrowelle zu erhitzen, oder zu lange dem Sonnenlicht auszusetzen, um das Vitamin möglichst zu erhalten. 16