C. Mülhardt Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics

C. Mülhardt Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics

In der Reihe DER EXPERIMENTATOR sind bereits erschienen Rehm: Proteinbiochemie/Proteomics Luttmann et al.: Immunologie Müller/Röder: Microarrays Schmitz: Zellkultur

Cornel Mülhardt Der Experimentator: Molekularbiologie/ Genomics 6. Auflage

Autor Dr. Cornel Mülhardt F. Hoffmann-La Roche AG Grenzacherstr. 124 CH-4070 Basel cornel.muelhardt@roche.de Wichtiger Hinweis für den Benutzer Der Verlag und der Autor haben alle Sorgfalt walten lassen, um vollständige und akkurate Informationen in diesem Buch zu publizieren. Der Verlag übernimmt weder Garantie noch die juristische Verantwortung oder irgendeine Haftung für die Nutzung dieser Informationen, für deren Wirtschaftlichkeit oder fehlerfreie Funktion für einen bestimmten Zweck. Der Verlag übernimmt keine Gewähr dafür, dass die beschriebenen Verfahren, Programme usw. frei von Schutzrechten Dritter sind. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Buch berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Der Verlag hat sich bemüht, sämtliche Rechteinhaber von Abbildungen zu ermitteln. Sollte dem Verlag gegenüber dennoch der Nachweis der Rechtsinhaberschaft geführt werden, wird das branchenübliche Honorar gezahlt. Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.d-nb.de abrufbar. Springer ist ein Unternehmen von Springer Science+Business Media springer.de 6. Auflage 2009 Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2009 Spektrum Akademischer Verlag ist ein Imprint von Springer 09 10 11 12 13 5 4 3 2 1 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlages unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. Planung und Lektorat: Dr. Ulrich G. Moltmann, Bettina Saglio Herstellung: Ute Kreutzer Umschlaggestaltung: SpieszDesign, Neu-Ulm Titelbild: Einsicht, 2001 von Prof. Dr. Diethard Gemsa. www.gemsakunst.de e-mail: gemsa@staff.uni-marburg.de Satz: Autorensatz Druck und Bindung: Stürtz GmbH, Würzburg Printed in Germany ISBN 978-3-8274-2036-7

Für meine drei Frauen, die mir immer weniger Zeit für die Arbeiten an diesem Buch lassen

Vorwort zur sechsten Auflage Kinder, wie die Zeit vergeht! Zehn Jahre ist es jetzt her, dass die erste Auflage das Licht der Welt erblickt hat. Viel tut sich nicht mehr in der Molekularbiologie, und so langsam dürfte jeder, der es braucht, sich ein Exemplar von diesem Buch zugelegt haben, dachte ich mir; Zeit, dem Ganzen ein Ende zu bereiten. Zum Glück erreichte mich genau in dieser Zeit ein Leserbrief, der mich nachhaltig eines Besseren belehrte, und auch die Tatsache, dass noch immer eine Auflage die nächste jagt, spricht dafür, dass ich mich mit meiner Einschätzung getäuscht haben dürfte. So stürzte ich mich voller Elan in die Arbeiten für die sechste Auflage. Von wegen, es hat sich nichts getan, fast zwanzig Seiten sind neu hinzugekommen, es brummt noch immer in diesem Bereich. Am spannendsten dürften sicherlich die neuen Entwicklungen im Bereich der Sequenzierung sein, die die Arbeit in der Molekularbiologie (und vermutlich auch in etlichen anderen Disziplinen der Biologie) nachhaltig beeinflussen werden. Dazu kommen ein Haufen größere (SAGE, ChIP) und kleinere Ergänzungen, Aktualisierungen und Korrekturen. Ich hoffe, das Buch erfüllt damit auch weiterhin seinen Zweck, nämlich die Grundlagen der Molekularbiologie zu erklären und einen Überblick über die aktuell verfügbaren Techniken zu vermitteln. Vorwort zur ersten Auflage Sie wollen ein Vorwort? Lesen Sie die Vor- und Nachbemerkungen in Hubert Rehms "Experimentator: Proteinbiochemie" (Spektrum Verlag), und anschließend, wenn Sie Blut geleckt haben, Siegfried Bärs "Forschen auf Deutsch: Der Macchiavelli für Forscher - und solche, die es noch werden wollen" (Verlag Harri Deutsch). Auch wenn's der Neuling nicht glauben mag, der Hase läuft tatsächlich so wie dort beschrieben. Der erfolgreiche Forscher zeichnet sich nämlich nicht durch bahnbrechende Ergebnisse, sondern durch geschicktes Drähteziehen hinter der Publikationsbühne und eine Menge Freunde aus. Das Ziel lautet, die Phase zwischen Studium und Professorenstelle so kurz wie möglich zu halten. Einmal am Ziel angekommen, läßt man andere die Forschung erledigen, so wie ein erfolgreicher Feldherr nicht mehr selber zum Säbel greift, sondern sich vom grünen Tisch aus der Vorstöße anderer ambitionierter Feldherren erwehrt. Mit Forschung hat man in diesem Stadium nur noch indirekt zu tun. Sollten Sie nach diesen Lektüren nicht das Handtuch geworfen haben, dürften Sie die notwendige Gelassenheit besitzen, um sich ganz der molekularbiologischen Forschung hingeben zu können. Von dieser Gelassenheit werden Sie nämlich viel brauchen, um an der endlosen Reihe von Fehlschlägen, die Sie im Laboralltag erwartet, nicht irre zu werden. Viel Spaß dabei. Wie Hubert Rehm so schön sagt: "Lassen Sie sich [...] nicht entmutigen! Auch die anderen rackern sich erfolglos ab; es ist normal, dass sich erstmal kein Ergebnis blicken läßt. Halten Sie durch! - Oder lernen Sie gleich einen vernünftigen Beruf." In diesem Sinne... Cornel Mülhardt

Danksagung Ich habe die überschwenglichen Danksagungen zu Beginn eines Buches immer für dröge Pflichterfüllung des Autoren gegenüber Freunden und Verwandten gehalten. Heute weiß ich, dass sie tatsächlich Herzenssache sind, Ausdruck des Dankes für das Überstehen einer schwierigen Lebensphase. Ich möchte Marc Bedoucha, Igor Bendik, Hans-Georg Breitinger, Uli Certa, Roger Clerc, Dorothee Foernzler, Christophe Grundschober, Andreas Humeny, Frank Kirchhoff, Nina Meier, Nicoletta Milani und Ruthild Weber danken für ihren Anteil am Gelingen dieses Buches und vor allem Cord-Michael Becker, der mich über Jahre hinweg vielfältig unterstützte und damit seinen Anteil daran hat, dass aus mir ein buchschreibender Molekularbiologe wurde, wofür ihm mein ganz besonderer Dank gilt. Ein Sonderdank geht an Franziska Niehr, die die fünfte Auflage innerhalb kürzester Zeit zweimal durchgelesen hat, das erste Mal aus Wissensdurst und ein zweites Mal, um mir eine Liste mit Verbesserungsmöglichkeiten und Tippfehlern zukommen zu lassen. Respekt. Schließlich wären da noch der Springer Verlag und sein Projektplaner Ulrich Moltmann, von denen die Idee zu einem solchen Buch stammte und die mir damit die Erfüllung eines sehr alten Traums ermöglichten, Jutta Hoffmann, ohne deren gelegentliches freundliches Drängen die erste Auflage das Licht der Welt nie erblickt hätte und Bettina Saglio, die sich seit Jahren mit all den neuen Versionen herumschlagen darf. Wenn es einen Gott gibt, so möge er ihnen pünktlichere Autoren schenken. Bekanntlich ist nichts so gut, dass es nicht noch verbessert werden könnte. Das gilt in besonderem Maße für ein solches Buch, weshalb ich mich sehr über konstruktive Kritik freuen würde. Der Verlag leitet gerne jedes Schreiben an mich weiter.

Inhalt 1 Was ist denn Molekularbiologie, bitteschön?...................... 1 1.1 Das Substrat der Molekularbiologie, oder: Molli-World für Anfänger.... 2 1.2 Was brauche ich zum Arbeiten?.................................. 7 1.3 Sicherheit im Labor............................................ 9 2 Einige grundlegende Methoden.................................. 12 2.1 Nucleinsäure ist gleich Nucleinsäure und auch wieder nicht........... 12 2.2 Methoden zur DNA-Präparation................................. 14 2.2.1 Bakterienmedien........................................ 14 2.2.2 Präparation von Plasmid-DNA............................. 16 2.2.3 Minipräparation........................................ 16 2.2.4 Maxipräparation........................................ 18 2.2.5 Präparation von Phagen-DNA............................. 20 2.2.6 Präparation einzelsträngiger DNA mittels Helferphagen......... 25 2.2.7 Präparation von genomischer DNA......................... 25 2.3 Die Reinigung von Nucleinsäuren............................... 27 2.3.1 Phenol-Chloroform-Extraktion........................... 27 2.3.2 Anionenaustauschersäulen............................... 29 2.3.3 Glasmilch / Silica-Membranen............................. 31 2.3.4 Cäsiumchlorid-Dichtegradient........................... 32 2.3.5 Fällung mit PEG....................................... 33 2.3.6 Dialyse............................................... 34 2.3.7 Magnetic Beads........................................ 35 2.3.8 Proteinbindende Filtermembranen.......................... 35 2.3.9 Alkohol-Fällung........................................ 36 2.3.10 Konzentratoren......................................... 36 2.3.11 Exonuclease-Phosphatase-Verdau.......................... 36 2.4 Konzentrieren von Nucleinsäuren................................ 37 2.4.1 Alkohol-Fällung....................................... 37 2.4.2 Konzentratoren......................................... 40 2.4.3 Speed-vac............................................. 41 2.4.4 Aussalzen........................................... 42 2.5 Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäurelösungen............... 42 3 Das Werkzeug................................................. 47 3.1 Restriktionsenzyme........................................... 47 3.2 Gele....................................................... 58 3.2.1 Agarosegele........................................... 58

X Inhalt 3.2.2 DNA-Fragmente aus Agarosegelen isolieren..................66 3.2.3 Polyacrylamidgele (PA-Gele)..............................70 3.2.4 DNA-Fragmente aus PA-Gelen isolieren......................73 3.2.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)...........................73 3.2.6 Kapillarelektrophorese....................................74 3.2.7 Mikrochip-Kapillarelektrophorese...........................75 3.3 Blotten......................................................75 3.3.1 Southern Blot..........................................76 3.3.2 Northern Blot..........................................79 3.3.3 Dot und Slot Blot........................................81 4 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).............................84 4.1 Die Standard-PCR...........................................84 4.2 Neue Entwicklungen...........................................96 4.3 Tipps zur Verbesserung der PCR.................................96 4.3.1 Nested PCR............................................99 4.3.2 Multiplex PCR........................................100 4.3.3 Amplifikation langer DNA-Fragmente (> 5kb)................100 4.4 PCR-Anwendungen...........................................101 4.4.1 Reverse Transkription - Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)....101 4.4.2 Rapid Amplification of cdna Ends (RACE).................102 4.4.3 Amplifikation zufälliger Produkte.........................104 4.4.4 Klassische quantitative PCR..............................106 4.4.5 Real-time quantitative PCR...............................109 4.4.6 Inverse PCR...........................................115 4.4.7 Biotin-RAGE und Supported PCR..........................116 4.4.8 Mutagenese mit modifizierten Primern......................116 4.4.9 Amplification Refractory Mutation System (ARMS)...........117 4.4.10 in-situ-pcr............................................118 4.4.11 Cycle Sequencing.......................................119 4.4.12 cdna-synthese........................................119 4.4.13 Einzelzell-PCR........................................119 5 RNA........................................................121 5.1 Methoden der RNA-Isolierung..................................122 5.2 Methoden der mrna-isolierung.................................125 5.3 Reverse Transkription (cdna-synthese)..........................126 5.4 In-vitro-Transkription (RNA-Synthese)..........................127 5.5 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE).......................129 5.6 RNA-Interferenz (RNAi).......................................134

Inhalt XI 6 Die Klonierung von DNA-Fragmenten........................... 139 6.1 Die Grundlagen des Klonierens................................. 139 6.1.1 Klonieren von PCR-Produkten............................ 146 6.1.2 Klonieren mit Rekombinase-Systemen..................... 149 6.2 Mit welchen Vektoren klonieren?............................... 152 6.2.1 Plasmide............................................ 152 6.2.2 Phagen.............................................. 155 6.2.3 Cosmide............................................. 157 6.2.4 PACs und BACs....................................... 158 6.2.5 YACs............................................... 158 6.3 Welche Bakterien?........................................... 160 6.4 Herstellen kompetenter Zellen und Transformation................. 160 6.5 Probleme beim Klonieren..................................... 165 6.6 Die Lagerung von Klonen..................................... 166 7 Wie man DNA aufspürt........................................ 169 7.1 Herstellung von Sonden....................................... 169 7.1.1 Methoden zur Herstellung markierter Sonden............... 171 7.2 Hybridisierung.............................................. 175 7.3 Nachweis der markierten DNA................................. 177 7.3.1 Autoradiographie...................................... 177 7.3.2 Nicht-radioaktive Nachweismethoden...................... 179 7.4 Screenen von rekombinanten DNA-Banken....................... 182 7.5 Two-hybrid system.......................................... 186 7.6 Phage display............................................... 190 8 DNA-Analyse................................................. 192 8.1 Sequenzierung.............................................. 192 8.1.1 Radioaktive Sequenzierung.............................. 194 8.1.2 Nicht-radioaktive Sequenzierung, automatische Sequenziergeräte 197 8.1.3 Schrotschuss-Sequenzierung............................. 199 8.1.4 Kurioses zum Thema Sequenzieren: Octamere............... 199 8.1.5 Minisequenzierung..................................... 200 8.1.6 Pyrosequenzierung zum Ersten........................... 202 8.1.7 Pyrosequenzierung zum Zweiten.......................... 203 8.1.8 Weitere Methoden der Massen-Parallelsequenzierung......... 205 8.1.9 Die Zukunft der Sequenzierung........................... 210 8.2 Methoden zur Analyse von DNA auf Mutationen................... 212 8.2.1 Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP)........ 212 8.2.2 Single-strand conformation polymorphism (SSCP)........... 213

XII Inhalt 8.2.3 Denaturierende Gradientengelelektrophorese (DGGE).........215 8.2.4 Temporal temperature gradient electrophoresis (TTGE).........217 8.2.5 Heteroduplexanalyse (HA)................................218 8.2.6 Amplification refractory mutation system (ARMS)............218 8.2.7 Enzymatische Spaltung von Fehlpaarungen (EMC)............218 8.2.8 Protein truncation test (PTT)..............................220 9 Untersuchung der Funktion von DNA-Sequenzen...................222 9.1 Untersuchung der Transkription in Geweben.......................223 9.1.1 Ribonuclease protection assay (RPA).......................223 9.1.2 Real-time quantitative PCR (RTQ-PCR).....................224 9.1.3 in-situ-hybridisierung...................................224 9.1.4 Chromosomale Lokalisierung eines Gens (FISH).............227 9.1.5 in-situ-pcr............................................229 9.1.6 Microarrays...........................................229 9.1.7 Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP).....................235 9.2 Mutagenese.................................................237 9.3 in-vitro-translation...........................................247 9.4 Expressionssysteme...........................................249 9.4.1 Bakterielle Expressionssysteme............................249 9.4.2 Baculovirus-Expressionssysteme...........................250 9.4.3 Weitere Expressionssysteme..............................252 9.4.4 Heterologe Expression in Säugerzellen......................253 9.4.5 Transfektionsmethoden..................................255 9.4.6 Kotransfektion mehrerer Gene.............................263 9.4.7 Transiente und stabile Transfektionen.......................264 9.4.8 Reportergene..........................................265 9.5 Transgene Mäuse.............................................273 9.5.1 Methoden des Gentransfers...............................274 9.6 Regulation der Transgenexpression...............................279 9.6.1 Das Tet-System........................................279 9.6.2 Das Ecdyson-System....................................281 9.7 Gentherapie.................................................281 9.8 Genomik...................................................283 10 Tipps für die Karriereplanung, oder: Der ganz kleine Macchiavelli für Jungforscher.....................287 11 Zu guter Letzt................................................296

Inhalt XIII 12 Anhang...................................................... 298 12.1 Nützliche Tabellen........................................... 298 12.2 Standardlösungen.......................................... 299 12.3 Glossar.................................................... 301 13 Wer, was, wo?................................................ 305 13.1 Lieferanten / Adressen........................................ 305 13.2 Literatur................................................... 309 Register........................................................ 311