Das Human Genom. Projekt. Sequenzierung

Das Human Genom Projekt - Sequenzierung Stephan Walter - 1 -

1 Einführung...3 2 Die DNS...3 2.1 Allgemeines...3 2.2 Aufbau der DNS bzw. RNS...3 3 Molekulare Cytogenetik...5 3.1 Allgemeines...5 3.2 in-situ-hybridisierung (ISH) und FISH...5 3.3 FISH zur Analyse von DNS in Chromosomen während der Metaphase...6 3.4 Vergleichende genomische Hybridisierung...7 4 Kartierung...7 4.1 Allgemeines...7 4.2 Genetische Karten - Kopplungsanalyse...8 4.3 Physikalische Karten...8 5 DNS-Sequenzierung...9 5.1 Historisches...9 5.2 Sechs Schritte zur Ermittlung von DNS/RNS-Sequenzen...9 5.3 Gelgestützte Verfahren...10 5.3.1 Synthese eines DNS-Strangs, Sanger-Verfahren...11 5.3.2 Basenspezifische Spaltung, Maxam-Gilbert-Verfahren...12 5.4 Gelfreie Verfahren...12 5.4.1 Hybridisierung, conformational DNA sequencing...12 5.4.2 Direkte bildgebende Verfahren...12 5.4.3 Massenspektrometrie...13 5.4.4 Sonstige Verfahren...13 5.5 Methoden...13 6 Human Genom Projekt...14 6.1 Allgemeines...14 6.2 Erste Phase...14 6.2 Zweite Phase...15 6.3 Celera und Co...16 7 Gentherapie in der Krebsforschung...16-2 -

1 Einführung In diesem Vortrag soll eine kurze Einführung in das Human Genom Projekt gegeben werden, welches das Ziel hat, die komplette Sequenz des menschlichen Erbguts zu ermitteln. Dabei werden ein paar Analyseverfahren vorgestellt: Genomanalyse mit der molekularen Cytogenetik, Erstellung genetischer und physikalischer Karten und Gensequenzierung. Am Schluß soll noch die Gentherapie vorgestellt werden. 2 Die DNS ein- und dasselbe Polypeptid trotz unterschiedlicher Reihenfolge von Nucleotiden gebildet wird. Daneben steuert die DNS durch ihre Struktur Zellvorgänge, indem Regulationsmoleküle bestimmte DNS- Sequenzen erkennen. Als genetischer Code wird die Beziehung zwischen der Sequenz der DNS und der Sequenz des entsprechenden Proteins bezeichnet. Die genetische Information steckt sowohl in der Codierung von Proteinen als auch in der Sequenz der Gene. 2.1 Allgemeines Fast das gesamte genetische Material der Zelle befindet sich im Zellkern und dort in den Chromosomen. Die Chromosomen bestehen aus zwei Chromatiden, innerhalb derer die DNS steckt, vgl. Abb. 1. Abbildung 2: Die DNS 2.2 Aufbau der DNS bzw. RNS DNS steht für Desoxyribonukleinsäure, RNS für Ribonukleinsäure: Die DNS besteht aus Nukleinsäuren, Nukleinsäuren aus Nukleotiden, letztere bestehen wiederum aus 3 Komponenten: Abbildung 1: Von der Zelle zur DNS Genetisches Material ist für den Aufbau vieler verschiedener Proteine verantwortlich. Jedes Protein besteht aus einer bestimmten Abfolge von Aminosäuren. Die DNS ist zunächst einmal von der Abfolge einzelner Nucleotide unabhängig: sie codiert die Abfolge von Aminosäuren, die ein Polypeptid bilden. Es kann aber vorkommen, daß Abbildung 3: Pyrimidine bestehen aus einem 6er-C- Ring, Purine aus einem 6er- und einem 5er-C-Ring 1. stickstoffhaltige Base (Ringmoleküle aus C- und N-Atomen) - 3 -

Abbildung 4: Die Pyrimidine Cytosin (links), Tymin (Mitte) und Uracil (rechts). a) Pyrimidine: ein sechsgliedriger Ring: Cytosin (C) und Thymin (T), vgl. Abb. 3 links und Abb. 4. Abbildung 5: Die Purine Adenin (links) und Guanin (rechts) b) Purine: ein fünf- und ein sechsgliedriger Ring: Adenin (A) und Guanin (G), vgl. Abb. 3 rechts und Abb.5. Was ist der Unterschied zwischen DNS und RNS? Beide bestehen aus den gleichen Basen, die einzige Ausnahme bildet das Thymin: in der RNS kommt an seiner Stelle das U- racil vor. 2. Pentose (ringförmiges Zuckermolekül mit Fünf C-Atomen) a) 2-Desoxyribose: kennzeichnend für die DNS b) Ribose: kennzeichnend für die RNS 3. Phosphatgruppe Unter einem Nukleosid versteht man eine mit einem Zucker verbundene Base, die Verbindung Base-Zucker-Phosphatgruppe ist ein Nukleotid. Viele Nucleotide zusammen bilden als Polynukleotidketten das Grundgerüst der Nukleinsäuren. Von James Watson und Francis Crick stammt das Doppelhelixmodell der DNS. Die Doppelhelix dreht sich ca. alle 3,4 nm einmal um sich selbst, besteht aus zwei Polynukleotidketten, wobei die Basen der Ketten nach Innen weisen. Der Anteil von Gua- Abbildung 6: Basenpaarung von Guanin und Cytosin nin entspricht immer dem Anteil Cytosin, der von Adenin dem von Thymin, vgl. Abb. 6 und 7. Guanin und Cytosin bilden drei Wasserstoffbrücken, Adenin und Thymin zwei Wasserstoffbrücken untereinander aus, was als Basenpaarung bezeichnet wird. G und C bzw. A und T sind komplementär zueinander. Abbildung 7: Basenpaarung von Adenin und Thymin 2.3 Codierung von Genen Wie werden nun einzelne Gene codiert? Drei Nukleotide bilden ein Codon, ein Codon steht für eine Aminosäure, und das Gen codiert mehrere Aminosäuren. Um eine Aminosäure zu codieren, gibt es Start- und Stopbits, sowie Abfolgen von Basenpaaren, welche aminosäurenspezifisch sind. Es gibt jedoch auch Mehrdeutigkeiten: soll beispielsweise Gly codiert werden, so kann dies über die Basensequenz GGU, GGC, GGA und GGG erfolgen, vgl. Abb. 8. - 4 -

Abbildung 8: Codierung von Aminosäuren 3 Molekulare Cytogenetik 3.1 Allgemeines In der molekularen Cytogenetik werden einzelne Nukleinsäuresequenzen nachgewiesen, so daß beispielsweise spezifische genetische Veränderungen erkannt und Genkarten erstellt werden können (s. Kapitel 4: Kartierung). Sie findet aber auch in der Tumorforschung Anwendung, bei der die vergleichende genomische Hybridisierung (comparative genomic hybridization CGH) eine wichtige Rolle spielt. 3.2 in-situ-hybridisierung (ISH) und FISH Die wichtigste Analysemethode der molekularen Cytogenetik ist dabei die in-situ- Hybridisierung (ISH), wobei bei dieser Technik wiederum die Fluoreszenz-in-situhybridisierung (FISH) die bedeutendste ist, da sie sehr schnell und genau ist. Mit Hilfe der FISH kann etwa die räumliche Anordnung von DNS-Sequenzen ermittelt werden, was zum Verständnis der räumlichen Anordnung des Genoms und seiner Funktionsweise notwendig ist. Grundlage der in-situ-hybridisierung ist die Hybridisierung einzelsträngiger Nukleinsäuren. Wird die DNS-Doppelhelix über ihre Schmelztemperatur hinaus erhitzt, so zerfällt sie in zwei Einzelstränge, was als Denaturierung bezeichnet wird. Läßt man dieses Gemisch aus Einzelsträngen wieder langsam abkühlen, so bilden sich neue Doppelhelices, vgl. Abb. 9. Eine Sonde wird mit Reportergruppen markiert, indem entweder reaktive Agenzien verwendet werden, oder es werden Nucleotide, die markiert sind, mit Hilfe von Enzymen eingebaut. Als Reportermoleküle können radioaktive Isotope oder Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) verwendet werden. Abbildung 10: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Abbildung 9: Hybridisierung Im Rahmen der FISH spricht man von direkter Markierung, wenn die Reportergruppen selbst fluoreszieren, und von indirekter Markierung, wenn diese für indirekte Nachweismethoden verwendet werden. Der Nachweis der markierten Sonden in der - 5 -

FISH erfolgt, wie der Name schon sagt, durch Fluoreszenzfarbstoffe. Die Effizienz, mit der DNS-Sequenzen nachgewiesen werden können, hängt von der Anzahl der gebundenen Reportermoleküle ab. Die Anzahl eingebauten Reportermoleküle ist wiederum von der Länge der Ziel-DNS abhängig. Beim menschlichen Genom gibt es mittlerweile sehr viele Sonden für die FISH: so können beim chromosome painting komplette Chromosome angefärbt werden, genausogut können aber auch lediglich einzelne Gene angefärbt werden. Abbildung 11: Mit FISH markierte Chromosome Die Anzahl der gleichzeitig verwendbaren Sonden hängt von der Anzahl der Fluorochromen ab, die sich noch spektral unterscheiden lassen. Es gibt jedoch Tricks, die Anzahl der Sonden über die Anzahl der (zunächst) unterscheidbaren zu erhöhen: die kombinatorische Markierung und die Verhältnismarkierung auch Ratio-Markierung genannt. Bei der kombinatorischen Markierung wird jede DNS-Sonde mit einem Fluorochrom oder mit einer bestimmten Kombination mehrerer Fluorochrome markiert, so daß sich die Sonde durch ein bestimmtes Fluorochrom bzw. eine bestimmte Kombination von Fluorochromen i- dentifizieren läßt. Bei der Verhältnismarkierung werden zwei oder mehr Fluorochrome in einem vorher festgelegten Mengenverhältnis auf eine Sonde gebracht. Zur Analyse wird mit Hilfe eines Filters ein Bild eines Fluorochrom gemacht, der Filter geändert, die zweite Aufnahme gemacht, usw.. Die Bilder werden überlagert und zu einem Bild zusammengefaßt. Alternativ kann man Multi-Bandpaß-Filter verwenden, die für mehrere Spektralbereiche durchlässig sind. 3.3 FISH zur Analyse von DNS in Chromosomen während der Metaphase Um Gene physikalisch zu kartieren, wird ein einzelner DNS-Strang als Sonde verwendet. Die Zellen sollten sich dabei in der Metaphase (Stadium während der Zellteilung, bei dem sich die Chromosomen in der Äquatorialebene der Zelle anordnen) befinden, damit sie als Chromosomensatz dieser Zelle erkennbar sind. Zunächst wird untersucht, wo auf dem Chromosom sich die Sonden-DNS befindet. Anschließend wird die Reihenfolge der bekannten und unbekannten Sequenzen in dieser Region untersucht. Diese Untersuchung wird verwendet um die Funktion eines neu isolierten Gens zu ermitteln um Multigen-Loci zu analysieren. Das sind Bereiche, in denen mehrere Gene, die teilweise aus der gleichen Genfamilie sind, gemeinsam tätig werden um integrierte DNS zu lokalisieren, z.b. Virus-DNS oder künstlich eingeschleuste DNS Neben einzelnen DNS-Strängen können auch solche DNS-Sequenzen als Sonde verwendet werden, die mehrfach im Genom vorkommen. Die Sonde markiert dann die Regionen besonders deutlich, in denen diese DNS häufig vorkommt. Manche solcher sich wiederholende Sequenzen auch junk DNS genannt - sind in allen menschlichen Chromsomen vorhanden, andere sind charakteristisch für ein bestimmtes Chromosom. Damit können z.b. zahlenmäßige Abweichungen von Chromosomen in Tumoren untersucht werden. - 6 -

Oftmals können die Abweichungen in der Fluoreszenzhelligkeit bereits im Mikroskop beobachtet werden. Zur genauen Analyse werden jedoch quantitative Verfahren eingesetzt. Abbildung 12: zahlenmäßige Abweichungen in den Chromosomen Abbildung 13: Strutkurelle Abweichungen in den Chromosomen Werden ganze Chromosomen oder Teilregionen von Chromosomen markiert, können Fehler erkant werden: sowohl zahlenmäßige Abweichungen (Monosomie, Triesomie, vgl. Abb. 12) als auch strukturelle Fehler (Deletion, Inversion und Translokation, siehe Abb. 13). 3.4 Vergleichende genomische Hybridisierung Die gesamte DNS derjenigen Zellen, die untersucht werden sollen, z.b. Tumorzellen, wird als FISH-Sonde gegen den Chromosomensatz von normalen Zellen hybridisiert. Diejenigen Bereiche der zu untersuchenden Chromosomen, welche über- bzw. unterrepräsentiert sind, erscheinen im Vergleich zur Kontroll-DNS heller bzw. dunkler gefärbt. Die vergleichende genomische Hybridisierung macht nur DNS-Anreicherung bzw. Verringerung kenntlich. Andere Abweichungen können mit ihr nicht aufgespürt werden. Da es in der Tumorforschung aber gerade auf die Zu- und Abnahme genetischen Materials ankommt, ist die CGH dort von großer Bedeutung. 4 Kartierung 4.1 Allgemeines So genannte Genkarten spielen in der Medizin und den Biowissenschaften ein wichtige Rolle und sind Grundalge für die Gentherapie. Mit ihrer Hilfe können Erbkrankheiten, deren verantwortlichen Gene bekannt sind, bereits vor der Geburt erkannt werden. Grundsätzlich unterscheidet man genetische und physikalische Genkarten. Genetische Karten geben Auskunft über die Rekombinationshäufigkeit zwischen Markern, physikalische Karten über die absolute Distanz zwischen Markern. - 7 -

4.2 Genetische Karten - Kopplungsanalyse Köperzellen, auch somatische Zellen genannt, teilen sich bei der Mitose: dabei verdoppelt sich der Chromosomensatz vor der Teilung, so daß die beiden Tochterzellen je eine Kopie besitzen. Abbildung 14: Crossing over Bei der Teilung der Keimbahnzellen, der Meiose, wird die Chromosomenzahl auf den einfachen Satz reduziert, wobei es zu mehrfachem Austausch genetischen Materials zwischen Nicht-Schwesterchromatiden 1 kommen kann, dem so genannten Crossing over (Abb. 14). Die Wahrscheinlichkeit, daß es zwischen zwei Punkten zum Crossing over kommt, ist dabei von der Distanz zwischen diesen beiden Punkten abhängig: je größer der Abstand, desto wahrscheinlicher werden sie getrennt. Zwei sehr nahe aneinanderliegende Gene werden sehr wahrscheinlich abermals nebeneinander liegen, man spricht vom genetic linkage. Bei der Erstellung genetischer Karten. Man spricht auch von Kopplungsanalyse, versucht man herauszufinden, ob Gene häufiger gemeinsam vererbt werden, als wenn sie auf zwei unterschiedlichen Chromosomen liegen Bei der genetischen Kartierung steht man aber vor Problemen, wenn genetische in physikalische Karten umgerechnet werden sollen: werden zu große Distanzen vermessen, so kann es zu zwei Crossing over 1 Kurz vor der Zellteilung verdoppeln sich die Chromosomen in Längsrichtung in die Chromatiden kommen, so daß die ursprüngliche Verteilung der Gene wiederhergestellt wird. Längere Anschnitte müssen als in mehreren Zwischenschritten untersucht werden. Ebenso schwankt die Rekombinationshäufigkeit verschiedener Bereiche des Genoms: in manchen Regionen ist sie gering, in anderen sehr hoch. Mit Hilfe genetischer Karten können Gene, welche für eine Krankheit verantwortlich sind, schnell identifiziert werden, bzw. können umgekehrt auch ausgeschlossen werden. Viele gefährliche Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen,..., hängen jedoch von vielen verschiedenen Genen und auch von Umweltfaktoren ab. Dann ist immerhin eine gewisse Risikoabschätzung möglich, ob es zum Ausbruch einer bestimmten Krankheit kommt, bzw. Vorsorgemaßnahmen können getroffen werden. Abbildung 15: Genetische und physikalische Karten 4.3 Physikalische Karten Die Verfahren zur Erstellung physikalischer Karten können in zwei Gruppen eingeteilt werden: top-down- und bottom-up- Verfahren. Top-down-Verfahren liefern große Sequenzabschnitte, besitzen aber nur eine geringe Ortsauflösung und können nur bei nicht zu umfangreichem Genmaterial verwendet werden. Bei der Analyse großer Gnome muß man sich deshalb auf kleinere Ausschnitte konzentrieren. Beim bottom-up-verfahren wird die zu untersuchende DNS geklont und in einer Klon- Bibliothek zusammengefaßt. Einzelne Klone werden dann isoliert, Überlappungsstellen ermittelt und sich überlappende Klone zu - 8 -

Contigs (continous sets of clones) zusammengefaßt. Die Contigs besitzen eine hohe Ortsauflösung, umfassen jedoch nur einzelne Chromosomenabschnitte. Zur Erzeugung von physikalischen Karten werden deshalb das topw-down- und das bottom-up-verfahren miteinander verknüpft. 5 DNS-Sequenzierung 5.1 Historisches Fred Sanger entwickelte 1975 eine enzymatische Sequenzierungsmethode zur Analyse der Primärstruktur der DNS. Anfangs konnten lediglich fünf Basen innerhalb einer Woche analysiert werden. Viren und Bakterien bestehen aus 10 5 bis 10 8 Basenpaaren (Bp), der Mensch aus 10 12 Bp. Je nach Analysemethode muß jedoch das zehnfache an Basen untersucht werden, um Ergebnisse zu erlangen. Neben Fortschritten bei den Sequenzierungsverfahren wurden Klonierungsmethoden entwickelt, bei denen DNS-Fragmente bis zu einer Größe von 2 kbp vermehrt werden konnten, als auch Verfahren zur Erzeugung von Einzelstrang DNS, welche sich sehr viel leichter sequenzieren läßt. Da in einem Sequenzierungsverlauf nicht die gesamte Sequenz bestimmt werden kann, wurden unterschiedliche Methoden entwickelt, um die Gesamtsequenz zu ermitteln. Analysefortschritte: 1977: Sequenz des 5386 Bp langen Phagens ϕx174 1982: Sequenz des menschlichen Mitochondriums (Kraftwerk der Zellen): 16 569 Bp 1984: Sequenz des Eppstein-Barr- Virus: 172 282 Bp 1996: in der EMBL-Nucleotid- Sequenzdatenbank werden so viele Daten erfaßt, wie die Summe der Sequenzen der vorangegangen 13 Jahre. 2001: Das Humangenomprojekt veröffentlicht 90% der Sequenz des menschlichen Genoms: 10 12 Bp 5.2 Sechs Schritte zur Ermittlung von DNS/RNS-Sequenzen Um die Sequenz von DNS bzw. RNS zu bestimmen, sind im allgemeinen sechs grundlegende Schritte notwendig 2 : 1. Isolierung der Nukleinsäure: die zu untersuchende DNS wird extrahiert, wobei die Methoden je nach Zielorganismus unterschiedlich sind. RNS wird meist nicht direkt sequenziert, sondern eine cdns-kopie erzeugt und diese sequenziert. 2. Klonierung oder PCR- Amplifikation: die in Schritt 1 gewonnen DNS kann noch nicht zur Sequenzierung verwendet werden: sie ist zu lang, um sie mit den bisherigen Verfahren bearbeiten zu können. Im günstigsten Fall können heutzutage 1 kbp Sequenz in einem Schritt erzeugt werden. Für die Sequenzierung reicht allerdings die Anzahl der Kopien nicht aus: die Nachweisgrenze in Sequenzierungsautomaten liegt bei ca. 10 000 Molekülen. Längere DNS- Sequenzen werden kloniert, bei kürzeren Sequenzabschnitten wird auf die PCR (polymerase chain reaction) zurückgegriffen. Bei der PCR werden die Eigenschaften der DNS- Polymerase, welche für die Verdopplung der DNS zuständig ist, geschickt ausgenutzt. Unter günstigen Bedingungen können innerhalb weniger Stunden aus lediglich einem Nukleinsäureabschnitt 10 12 identische Moleküle erzeugt werden. 3. Reinigung: Damit die Länge der Sequenzabschnitte, die auf einmal analysiert werden können, nicht durch Verunreinigungen verkürzt wird, werden störende Proteine, Kohlehyd- 2 entnommen aus F. Lottspeich, H. Zorbas: Bioanalytik, Spektrum Verlag 1998-9 -

rate und Salze durch entsprechende Reinigungsverfahren entfernt. 4. DNS-Sequenzierung und E- lektrophorese: Mittels Elektrophorese (Wanderung von Teilchen im e- lektrischen Feld) werden die bei der eigentlichen Sequenzierungsreaktion erhaltenen DNS-Fragmente aufgetrennt. Das dabei erhaltene Bandmuster wird erfaßt und analysiert, vgl. Abb. 16, 17 und 19. 5. Rekonstruktion der ursprünglichen Sequenz: Da die in einem Schritt erzeugte Sequenz meist kürzer als die Gesamtsequenz ist, müssen die einzelnen Fragmente zur Gesamtsequenz zusammengesetzt werden, was mittlerweile automatisiert und computergestützt abläuft. 6. Fehlerkorrektur: Zum Schluß werden die gewonnen Daten einer Fehlerkorrektur unterzogen. Um Fehler zu reduzieren, werden die DNS- Sequenzen unabhängig voneinander sequenziert, wobei auch der Komplementärstrang analysiert wird. Anschließend wird untersucht, ob die Sequenz durch Fremd-DNS verunreinigt wurde. Mittels Tabellenwerke wird nach Sequenzierungsfehlern gesucht. Schließlich liegt die Sequenz vor. Abbildung 17: Radiogramm. In den einzelnen Spalten enden die Fragmente auf unterschiedliche Basen (hier: von links nach rechts Tymin, Guanin, Cytosin und Adenin). Von den kurzen zu den langen Fragmenten hin erhält man die Sequenz der Probe: TGCAGGTC... 5.3 Gelgestützte Verfahren Gelgestützte Verfahren werden am häufigsten zur DNS-Sequenzierung verwendet. Dabei werden DNS-Fragmente erzeugt, die mit spezifischen Basen enden, und die mittels Elektrophorese nach ihrer Größe sortiert werden. Die DNS-Fragmente werden entweder durch die Synthese eines DNS- Stranges (Sanger-Verfahren) oder durch basenspezifische Spaltung (Maxam-Gilbert- Verfahren erzeugt. Die Elektrophorese findet entweder in äußerst dünnen Gelen statt, deren Dicke weniger als 0,35 mm beträgt, oder in Kapillaren, wobei die Kapillartechnik u.a. Probleme bei der Befüllung auftreten und die Leseweite nicht sonderlich hoch ist. Erst in jüngster Zeit wurden auf diesem Gebiet gewisse Fortschritte erzielt. Abbildung 16: Die zu untersuchenden Proben werden auf ein Gel aufgetragen. Anschließend wird ein elektrisches Feld angelegt. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Größe wandern die einzelnen Fragmente unterschiedlich schnell. - 10 -

1. Das natürliche Desoxynukleotid (dntp) geht mit dem DNS-Strang eine Verbindung ein., wobei Phosphat freigesetzt wird. Der DNS- Strang wird dabei um genau eine Base verlängert. Bei der nächsten Reaktion kann es abermals zu einer der beiden Reaktionen kommen. 2. Alternativ kommt es zu einer Verbindung aus dem künstlichen Didesoxynukleotids (ddntp) und dem DNS-Strang. Im Unterschied zur vorherigen Reaktion kann nach dem Einbau des ddntp s der DNS- Strang nicht mehr verlängert werden. Abbildung 18: Sanger-Verfahren 5.3.1 Synthese eines DNS-Strangs, Sanger-Verfahren Man beginnt mit einer bekannten Startfrequenz, fügt einen Primer, ein Gemisch aus Nucleotiden und DNS-Polymerase hinzu, um den komplementären DNS-Strang zu synthetisieren. Die Reaktionsprodukte werden durch radioaktive Isotope oder mittels Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen. Der Primer dient einerseits dazu, eine Startstelle zu definieren, andererseits ist er für den Beginn der DNS-Synthetisierung notwendig. Der Synthetisierungsprozeß wird in vier parallelen Prozessen gestartet, welche sich lediglich durch das verwendete Nukleotidgemisch unterscheiden. Das Nukleotidgemisch enthält wiederum die natürlichen Desoxynukleotide und je einen von vier verschiedenen künstlichen Terminatoren, die Didesoxynukleotide (weshalb man das Verfahren auch als Didesoxy-Verfahren bezeichnet): ddatp, ddctp, ddgtp und ddttp (A, C,G und T). Während sich der neue DNS-Strang ausbildet, kann es zu zwei verschiedenen Reaktionen kommen: Abbildung 19: Ermittlung der Sequenz. Die Fragmente enden (von links nach rechst) auf A, G, C oder T. Die kürzesten Fragmente (also die, die am weitesten durch das Gel wanderten) befinden sich unten im Bild. Die Leserichtung zur Sequenzermittlung verläuft von unten nach oben. Man erhält ATGTC... In den vier parallel Ablaufenden Reaktionsketten entstehen DNS-Stücke, welche sich um je eine Base in der Länge unterscheiden, und die zudem nur auf einen bestimmten Basentyp enden: Adenin A, Cytosin C, Guanin G oder Thymin T. Die so erzeugten DNS-Fragmente werden durch Elektrophorese in einem Gel ihrer Größe nach aufgetrennt. Dabei entstehen verschiedene Banden, welche sich um je eine Base unterscheiden. Traditionell werden die DNS-Fragmente radioaktiv markiert. Alternativ können sie auch mit Fluoreszenzfarbstoffen versehen werden, wobei zur Analyse die Intensitäten der Banden ermittelt werden, siehe Abb. 20 und 21. - 11 -

Abbildung 20: FISH-markierte DNS-Fragmente Sanger-Methode aus verschiedenen Gründen nicht funktioniert. Dazu werden die Enden der DNS-Fragmente markiert und anschließend in vier unabhängigen Reaktionen basenspezifisch gespalten. Die Spaltungsvorgänge sind jedoch nicht immer nur für eine Base spezifisch, sondern manchmal auch für zwei, so daß erst durch die Kombination aller Spuren eines DNS- Fragments eine eindeutige Sequenz ermittelt werden kann. 5.4 Gelfreie Verfahren Da die Gelelektrophorese die Menge der auf einmal sequenzierbaren DNS-Fragmente begrenzt, werden Alternativmethoden entwickelt, die jedoch größtenteils noch im Experimentierstadium sind. Abbildung 21: Die FISH-markierten Probe wird mit einem Laser bestrahlt. Ausgewertet werden die unterschiedlichen Lichtintensitäten. Das von Sanger entwickelte Reaktionsprinzip wird, abgesehen von kleineren Modifikationen, heutzutage noch verwendet. Beispielsweise wurden in den 80er Jahren Online-DNS-Sequenzierungssysteme in Europa und den USA entwickelt. Heutzutage können durch die gleichzeitige Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe ca. 2000 Basen Sequenz pro Spur und Reaktion erhalten werden, d.h. 200kBp pro Gerät und Lauf. Parallel dazu wurden die Probenvorbereitungen automatisiert. Beides zusammen führte zu enormen Leistungssteigerungen bei der Analyse von DNS-Sequenzen. 5.3.2 Basenspezifische Spaltung, Maxam-Gilbert- Verfahren Dieses Verfahren wird heutzutage nur noch selten verwendet, wenn beispielsweise die 5.4.1 Hybridisierung, conformational DNA sequencing Auf der Oberfläche aus Glas- oder Silizium befinden sich Nukleotide, welche in Matrizenform angeordnet sind. Um die Sequenz zu ermitteln, werden die zu untersuchenden DNS-Fragmente markiert und hybridisiert. Anhand der Hybridisierungsmuster, welche sich durch Unterschiede der markierten DNS-Fragmente in Position und Signalintensität unterscheiden, wird die Sequenz ermittelt. Schwierigkeiten bei der Hybridisierung: die Versuchsbedingungen müssen so genau reproduzierbar sein, daß zwischen der Hybridisierung von n und n-1 Basen unterschieden werden kann. Sequenzen, die sich stark wiederholen, können nur sehr schwer analysiert werden, zudem steigt der Computeraufwand bei längeren zu untersuchenden Sequenzen stark an. Bei kurzen DNS-Fragmenten, Mutationen in der medizinischen Diagnostik und zur Kartierung ist die Hybridisierung jedoch geeignet. 5.4.2 Direkte bildgebende Verfahren Mittels mikroskopischer Methoden wie Tunnelelektronenmikroskopie oder Kraftmikroskopen soll ein direktes Abbild der - 12 -

DNS gemacht werden. Schwierigkeiten bei der Präparation der Proben machen derzeit ein eindeutiges Ergebnis unmöglich. 5.4.3 Massenspektrometrie Massenspektroskopische Methoden funktionieren bereits und liefern bis zu 100 Bp Sequenzdaten. Die Reaktionsprodukte werden dabei mit der Sequenzierungsmethode von Sanger erzeugt, die Auswertung erfolgt dagegen gelfrei. Auch hier treten noch Schwierigkeiten bei der Präparation der Proben auf, was zu einem schlechten Signal- Rausch-Verhältnis führt. 5.4.4 Sonstige Verfahren Andere Methoden versuchen durch Analyse der Nebenprodukte, beispielsweise der bei der Sanger-Methode entstehenden Phosphate, die Sequenz zu bestimmen. Bei der Minisequenzierung wird lediglich eine fluoreszenzmarkierte Base untersucht und deren Stelle ermittelt. Diese Verfahren eignet sich beispielsweise dazu, Mutationen aufzudecken, und wird in der Medizin getestet. 5.5 Methoden Shot-Gun-Methode: das Genom wird möglichst statistisch in kleine Fragmente von 1kBp Länge zerkleinert. Anschließend wird kloniert und die Sequenz wie in einem Puzzle ermittelt. Vorteil ist die schnelle Analyse der Fragmente, die Ermittlung der Gesamtsequenz bedarf dagegen e- normen Computeraufwandes, um anhand von Überlappungen die Gesamtsequenz zu erhalten. Primer Walking: das zu sequenzierende DNS-Stück wird von beiden Enden her in je einem Schritt sequenziert. An jedem der Enden wird ein Primer ein DNS-Fragment von ca. 20 Nucleotiden Länge - in gleicher Leserichtung plaziert, so daß nach und nach ein längerer Sequenzabschnitt ermittelt werden kann. Vorteile: Position und Laufrichtung der Sequenz sind jederzeit bekannt. Durch die zusätzliche Anbringung von Primern in Gegenrichtung kann der komplementäre Sequenzstrang bestimmt werden, was im Idealfall einer Redundanz von 2 ergibt. Nachteil: die Sequenzdaten können nur Schritt für Schritt erhalten werden, außerdem muß für jede Reaktion ein neuer Primer synthetisiert werden Nested Deletion: Hier wird nur ein Standard-Primer benötigt. Durch Erzeugung bestimmter Übergänge, Anund Umlagerung, sowie Verkürzung (Deletion) wird die DNS-Sequenz ermittelt. Mit diesem Verfahren können Fragmente bis zu einer Länge von 3 kbp untersucht werden. Soll wie beim Primer Walking der komplementäre DNS-Strang untersucht werden., muß das Verfahren wiederholt werden. Delta-Restriktionsklonierung: das zu untersuchende Fragment wird zerstückelt und auf einem Gel analysiert. Alle Klone, welche mit bestimmten Enzymen koppeln können, werden um ein Stück verkürzt. Mittels der Lage der Verkürzungen kann unter Verwendung von Standardprimern (s. auch Primer Walking Methode) die Sequenz ermittelt werden. RANDI: Random-Directed Methode. Bei diesem Verfahren sollen die Vorteile zufälliger und zielgerichteter Methoden zu kombinieren, um Klonierung, Walking, Primer- Synthese und Sequenzierung effektiver zu gestalten. Dabei werden sowohl zufällige wie auch geordnete Klone erzeugt. Man bestimmt die Endsequenz von 100 Zufallsklonen und ca. 15 gerichteten Klonen, wobei letztere als Raster beim Zusammenfügen der Zufallsklone dienen. Eventuell auftretende Lücken müssen durch die Primer Walking Methode geschlossen werden. Die RANDI Methode hat eine recht hohe - 13 -

Redundanz und ermöglicht die schnelle Bestimmung von Sequenzen. 6 Human Genom Projekt 6.1 Allgemeines Ziel des Humangenomprojekts ist es, die genaue Sequenz der menschlichen Erbsubstanz zu ermitteln. Dabei wird nur der euchromatische Teil des menschlichen Genoms untersucht, also derjenige Bereich, der keine Wiederholungen enthält. Regionen, welche aus langen Aneinanderreihungen von sich ständig wiederholender DNS auch junk DNS - bestehen, werden heterochromatisch genannt. Sie enthalten nur sehr wenig genetische Information und werden deshalb außer acht gelassen. Das Humangenomprojekt ist international: weltweit beteiligen sich mehr als 1000 Wissenschaftler. Die Kosten für die 1. Phase betrugen ungefähr 300 Mio. US-Dollar, wovon die Hälfte von den USA aufgebracht wurden. Insgesamt werden die Kosten des Humangenomprojekts auf 3 Milliarden US- Dollar veranschlagt, welche sich jedoch auf 15 Jahre (1990-2005) erstrecken und wovon nur ein Bruchteil auf die Sequenzierung fällt. Im Rahmen des Projekts werden nämlich auch verschiedene menschliche Krankheiten und Modellorganismen wie Mäuse, Fliegen, Bakterien,..., erforscht (s. Abb. 21), neue Techniken für die Biologie und Medizin entwickelt sowie ethische, rechtliche und soziale Fragen der Gentechnik besprochen. Die Sequenzinformationen, die vom Humangenomprojekt ermittelt wurden, werden sofort nach ihrem Bekanntwerden veröffentlicht und ohne Einschränkung für jedermann zugänglich gemacht. Bisher wurden Zehntausende Gene ermittelt, davon 30, welche eine direkte Rolle bei Krankheiten spielen. Nicht alle veröffentlichen die gewonnen Daten jedoch für viele Biotechfirmen steht der Kommerz im Vordergrund. (s. Abschnitt 6.3 Celera und Co). Abbildung 22: Einige der untersuchten Genome (Übersicht von Nature, Stand: November 2001) 6.2 Erste Phase Am 12. Februar 2001 veröffentlichte das Humangenomprojekt die Daten der Arbeitssequenz, welche 90% des menschlichen Genoms umfasst. Bereits am 26. Juni 2000 waren 90% der Buchstaben des Buch des Lebens bekannt, doch konnten jetzt erst - 14 -

viele verhältnismäßig kleine Sequenzabschnitte zu größeren Gesamtabschnitten zusammengefaßt werden. Dennoch weist die Gesamtsequenz immer noch einige Lücken auf, die nach und nach geschlossen werden sollen. Im folgenden sollen ein paar Ergebnisse dieses ersten Entwurfs vorgestellt werden. Die Gesamtzahl der menschlichen Gene steht noch nicht endgültig fest, wird jedoch auf 30 000 bis 35 000 geschätzt Das ist nur etwa doppelt so viel wie die Zahl der Gene bei Würmern oder Fliegen und entspricht nicht den Erwartungen (man vermutete, dass ein so komplexes Wesen wie der Mensch aus wesentlich mehr Genen bestehen müsste). Es zeigte sich jedoch, dass der Mensch nicht nur, wie bei vielen Arten, ein Eiweiß pro Gen herstellt, sondern drei Eiweiße pro Gen. Die Gesamtheit menschlicher Eiweiße, das Proteom, ist sehr viel komplexer als bei Wirbellosen. Wie andere Wirbeltiere wird beim Mensch alte Eiweißstruktur zur Erstellung neuer Konstruktionen verwendet. Im menschlichen Genom befinden sich mehr als 200 Gene, deren engste Verwandte sich in Bakterien befinden, und die vermutlich erst nach dem Auftreten der Wirbeltiere Teil des menschlichen Genoms wurden. Vermutlich fanden mehrere voneinander unabhängige Genübertragungen von verschiedenen Bakterien statt. Die junk DNS gibt Aufschluß über den Verlauf der menschlichen Evolution. Es ist möglich, einzelne Wiederholungssequenzen nach dem Zeitpunkt ihres evolutiven Auftretens zu sortieren, sowie ihr Schicksal in unterschiedlichen Regionen innerhalb des menschlichen Genoms, aber auch in anderen Arten zu untersuchen. Die Wiederholungssequenzen sind teilweise für die Entstehung neuer Gene und für die Veränderung und Vermischung existierender Gene verantwortlich. Der Anteil der junk DNS beträgt beim Menschen ca. 50% des Genoms. In anderen gut untersuchten Lebewesen ist er sehr viel geringer: Senfgras enthält nur 11%, der Wurm 7% und in der Fliege sind nur 3% des Genoms junk DNS. Vor 50 Millionen Jahre ging die Aktivität der Wiederholungen im menschlichen Genom zurück, bei Nagetieren hält sie nach wie vor an. Die Häufigkeit von Mutationen in der Keimbahn ist bei Männern und Frauen unterschiedlich: die relative Mutationshäufigkeit in Y- Chromosomen ist zweimal so hoch wie die in X-Chromsomen, was vermutlich auf die größere Zahl von Zellteilungen, die zur Spermaproduktion notwendig sind, zurückzuführen ist (zur Eireifung werden weniger Zellteilungen benötigt). Mittlerweile wurden 1,4 Millionen Unterschiede, die in nur einem Buchstaben der DNS auftreten, die single nucleotide polymorphisms (SNPs), registriert und deren genaue Lage innerhalb des Genoms katalogisiert. Der öffentlich zugängliche Katalog kann sowohl zur Erfassung von Krankheiten als auch zum Verständnis der menschlichen Evolution herangezogen werden. 6.2 Zweite Phase Das Hauptziel des Humangenomkonsortiums ist die Veröffentlichung der kompletten menschlichen Gensequenz ohne Lücken mit einer Genauigkeit von 99,99%. Die bisherigen Daten, die in der 1. Phase veröffentlicht wurden, reichen für die Forschung in der Biomedizin zwar weitgehend aus, dennoch sollen bis 2003 Zweideutigkeiten aufgeklärt und sämtliche Lücken in der Sequenz geschlossen werden. Im Jahr 2000 schritt die Analyse der Gensequenz schlagartig voran: allein 90% der Se- - 15 -

quenz wurde innerhalb von 15 Monaten ermittelt. Deshalb wird die zweite Phase wohl sehr viel schneller vorankommen, als ursprünglich angenommen. Neben der Sequenzierung des menschlichen Genoms sollen parallel dazu andere Arten sequenziert werden, um aus dem Vergleich unterschiedlicher Arten Erkenntnisse über die für das Überleben wichtigen Elemente zu gewinnen, welche dann zur Entwicklung neuer Therapien herangezogen werden sollen. Auch soll ein Katalog erstellt werden, der die Varianten der menschlichen Bevölkerung enthält, sowie die Gene identifiziert werden, welche einzelne Individuen anfälliger gegenüber bestimmten Krankheiten macht. Mit der funktionellen Genetik soll die genaue Funktion der Gene systematisch untersucht werden, z.b. Gene, die bei der Entwicklung eines Organismuses oder bei der Zellteilung eine Rolle spielen. Bei Pflanzen erhofft man sich, mit Hilfe des analysierten Pflanzengenoms ertragreichere Varianten zu züchten, oder die Schädlingsresistenz zu erhöhen. 6.3 Celera und Co Im Frühjahr 1998 kündigte Craig Venter an, die Sequenz des menschlichen Genoms drei Jahre vor dem internationalem Konsortium zu veröffentlichen. Venter gründete zusammen mit der Firma Perkin Elmer Corporation die Firma Celera. Im Gegensatz zum internationalem Genomprojekt verwendet Celera die shotgun-methode, mit der das Genom zerstückelt wird, die erhaltenen Fragmente wahllos sequenziert und dann mit gewaltigem Computeraufwand anhand von Überlappungen zusammengefügt werden sollen. Die medizinisch relevanten Informationen werden von Celera dann verkauft. Celera benutze dabei sowohl eigene Daten, griff aber auch auf die Daten des öffentlichen Humangenomprojekts zurück. Neben Celera versuchen auch andere Firmen, mit der Gensequenz Geld zu verdienen. Die Firma Incyte Pharmaceuticals beispielsweise hat das Patent für fast 400 Gene und das Patent für weitere 6500 beantragt (Stand: März 2000). Der Einblick in die Datenbank beispielsweise durch ein Pharmaunternehmen geht einher mit der Verpflichtung, Incyte Pharmaceutics am Gewinn zu beteiligen. Die Firma Human Genom Scieneces erwartet dabei 10% Gewinnbeteiligung. Sie selbst hat ihren Aktienkurs erheblich gesteigert, nachdem sie vorgab, sie habe das Patent für ein Gen, welches der Aidsvorbeugung dienen könnte, erhalten. Verschwiegen wurde dabei, daß noch andere Firmen dieses Patent für sich beanspruchen. In Amerika geht die Patentvergabe sogar so weit, daß ein Gen selbst dann patentiert werden kann, wenn seine Funktion noch unbekannt ist, oder es gar nur fragmentarisch vorliegt. Selbst Bill Clinton und Tony Blair forderten die Industrie auf, wenigstens die Rohdaten zum Wohl der Forschung offenzulegen, und nicht sofort das Patent einzureichen. 7 Gentherapie in der Krebsforschung Bei der Gentherapie in der Krebsforschung wird versucht, Erbsubstanz in eine Körperzelle künstlich einzuschleusen. Dadurch soll die Krebszelle so verändert werden, daß sie abstirbt, mit Medikamenten besser behandelt oder vom Immunsystem besser erkannt wird. Werden Zellen des Immunsystems gezielt gegen Krebszellen gerichtet, spricht man von somatischer Gentherapie (soma=körper). Derzeitige Studien beschäftigen sich hauptsächlich mit drei unterschiedlichen Ansätzen: 1. Verbesserung der Immuntherapie 2. Erweiterung der Möglichkeiten der Behandlung mit Medikamenten 3. Korrektur der genetischen Defekte, die für die Krebsentstehung verantwortlich sind Bei der Immuntherapie wird beispielsweise tumorinfiltrierenden Lymphozyten (Unterart - 16 -

der weißen Blutkörperchen) das Gen für bestimmte ZYTOKINE, z.b. Interleukin 2, eingebaut und dann dem Patienten geimpft, die so genannte Krebsimpfung. Dadurch soll das Immunsystem Krebszellen besser erkennen und bekämpfen können. Bei Hirntumoren steht man allerdings vor dem Problem, daß diese mit Medikamenten nur sehr schwer bekämpft werden können, da das Gehirn durch die Blut-Hirn-Schranke vor Krankheitserregern geschützt wird. Nervenzellen sind aber sehr empfindlich gegenüber Viren bzw. deren Erbmaterial. Auch teilen sich Gehirnzellen bei Erwachsenen kaum noch, so daß neues Erbmaterial fast nur in den Krebszellen eingebaut wird. So kann beispielsweise der genetische Bauplan für das Enzym Thymidinkinase in die Krebszellen eingeschleust werden, welches bei Infektionen mit dem Herpesvirus eine Rolle spielt. Dadurch können Krebszellen dann mit normalen Medikamenten gegen das Herpesvirus bekämpft werden. Noch können mit diesem Ansatz keine dauerhaften Heilungserfolge erzielt werden, und zudem treten Nebenwirkungen auf. Im Idealfall würde man mit der Gentherapie herausfinden, welches Gen für Krebs verantwortlich ist, und das fehlerhafte bzw. fehlende Stückchen DNS durch ein intaktes ersetzen. Bei den meisten Krebsarten sind aber mehrere Gene für den Krebs verantwortlich, die Ursachen sind (noch) nicht bekannt. Es gibt allerdings auch erfreuliche Nachrichten: bei Ovarialkarzinomen wurden mittels Gentherapie Defekte am Tumor- Suppressorgen 3 p53 behoben, wodurch Patientinnen weniger häufig Rückfälle hatten. Schwierigkeiten bei der Gentherapie ist die zielgerichtete und vor allem dauerhafte Einbringung von Erbinformation in die gewünschten Zielzellen. Meist werden dazu, wie bei dem oben erwähnten Beispiel von Gehirntumoren, Viren verwendet, die so verändert wurden, daß sie für den Patienten ungefährlich sind. Da sich Krebszellen sehr schnell teilen, ist es wichtig, daß die eingebrachte Erbinformation auch dauerhaft in den Zielzellen verbleibt, da sonst nur vorübergehende Besserung eintritt. Ob die Viren tatsächlich ungefährlich sind, ist aber noch umstritten. Andere Methoden, allerdings nicht so ausgereifte Methoden sind die Einschleusung von Erbinformation mittels künstlicher Fettkügelchen, oder der Beschuß mit Goldpartikeln, an die Gene gekoppelt wurden. Vor allem die als Genfähren oder Gentaxis dienenden Viren können heftige Immunreaktionen hervorrufen. In die Kritik geriet die Gentherapie nach dem Tod eines Patienten, der einer unnötigen Gentherapie unterzogen wurde. Durch im Anschluß durchgeführte Untersuchungen wurden zahlreiche Unregelmäßigkeiten entdeckt, von denen die meisten nicht gemeldet worden waren. In Deutschland wird die Gentherapie sehr kritisch betrachtet, nicht zuletzt aufgrund der bekannt gewordenen Zwischenfälle, ungeklärten Risiken der als Genfähren verwendeten Viren und die Möglichkeit, daß die auf Tumorzerstörung angelegte Gentherapie Ei- und Samenzellen verändern könnte (in Deutschland ist die Keimbahntherapie, d.h. die Veränderung an Samen- oder Eizellen, verboten). 3 Tumor-Suppressorgene spielen eine wichtige Rolle bei der Krebsentstehung, sind jedoch nicht unbedingt für eine bestimmte Krebsart verantwortlich - 17 -

Quellen: F. Lottspeich/H. Zorbas: Bioanalytik, Spektrum Verlag 1998 Deutsches Human Genom Projekt (http://www.dhgp.de/) Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg (http://www.krebsinformation.de/) Benjamin Lewin: Molekularbiologie der Gene, Spektrum Verlag 1998 Einige Bilder wurden im Internet gefunden, konnten aber keiner Quelle mehr zugeordnet werden - 18 -