Promotionsprogramm Translationale Medizin Projektvorschlag 2013-34 Projektleiter/Betreuer: PD Dr. med. Anne Krug Klinik/Institut: II. Medizinische Klinik und Poliklinik Promotionsberechtigung: Hochschullehrer Thema: Autoregulation des viralen RNA-Sensors Retinoic acid inducible gene I Beschreibung: Retinoic acid inducible gene I (RIG-I) detektiert virale RNA im Zytoplasma der Wirtszelle. Das RIG-I Protein besteht aus zwei CARDs (caspase recruitment and activation domain) am N-Terminus, der zentralen Helikase-Domäne und der C-terminalen Domäne (CTD). Nach Virusinfektion bindet virale 5t -Triphosphat-RNS spezifisch an die CTD, was zu einer Konformationsänderung und Interaktion mit IPS-1 (Interferon-SS promoter stimulator protein 1) über die CARDs führt. IPS-1 löst über die nachgeschaltete Signalkaskade die antivirale Typ I IFN Antwort aus. Die Expression von RIG-I wird durch Typ I IFN induziert. Dies verstärkt die Typ I IFN Antwort. Bisher nicht genau aufgeklärte Regulationsmechanismen im RIG-I Signalweg führen nachfolgend zur Reduktion der RIG-I vermittelten Typ I IFN Induktion und verhindern eine überschiessende innate Immunantwort. Wir haben eine kurze Form des RIG-I Moleküls identifiziert, die durch Typ I IFN in humanen Zellinien und Primärzellen induziert wird. In der Kurzform von RIG-I fehlt die CARD-Region fast vollständig und dieses Molekül hat eine regulierende Funktion auf den RIG-I Signalweg. Unsere bisherigen Untersuchungen deuten darauf hin, dass die Kurzform von RIG-I durch eine proteolytische Spaltung entsteht. In diesem Projekt soll: 1) der Mechanismus der proteolytischen Spaltung von RIG-I genauer untersucht werden, 2) die genaue Spaltstelle identifiziert werden, und 3) die posttranslationalen Modifikationen, die für die Spaltung und regulatorische Funktion der RIG-I Kurzform notwendig sind, charakterisiert werden. 1) Die Induktion der RIG-I Kurzform durch Typ I IFN wird in Gegenwart verschiedener Protease- und Proteasom-Inhibitoren mittels Western Blot in HEK293 Zellen und dendritischen Zellen untersucht. Die direkte Spaltung von RIG-I wird durch in vitro Assays mit aufgereinigtem RIG-I und Protease/Proteasom untersucht (Kollaboration
mit Prof. M. Groll, Biochemie, TUM). 2) Durch Insertion von Punktmutationen in das RIG-I-Molekül kann die Spaltstelle exakt charakterisiert werden. Die Herstellung von Zellinien, denen Wildtyp RIG-I fehlt (HEK293/RIG-I-KO), und die die RIG-I Mutanten stabil exprimieren, erlaubt deren funktionelle Charakterisierung, z. B. durch IFN-SS- Promoter Luciferaseassay nach Stimulation mit RIG-I-Ligand oder Virusinfektion (VSV- M51R). 3) Das spezifische Ubiquitinierungsmuster und weitere mögliche posttranslationale Modifikationen der RIG-I Kurzform werden mit Western Blot untersucht. Umfang (falls anders als 1 Jahr Vollzeit und 2 Jahre studienbegleitend): 1 Jahr Vollzeit, 2 Jahre studienbegleitend Bezug zu drittmittelgeförderten Projekten: DFG-Einzelantrag KR2199/7-1 t t Regulation of RIG-I signaling by a a novel interferon-inducible short form of RIG-It t Die vorgeschlagene Doktorarbeit wird durch die Projektleiterin und durch die Postdoktorandin Dr. rer. nat. Katharina Eisenächer, die über den DFG-Antrag gefördert wird, betreut. Relevante eigene Publikationen: Yoneyama, M. et al. (2004). The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat.Immunol. 5, 730-737. Hornung, V. et al. (2006). 5t -Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science 314, 994-997. Cui, S., Eisenächer, K. et al. (2008). The C-terminal regulatory domain is the RNA 5t -triphosphate sensor of RIG-I. Mol.Cell 29, 169-179. Kowalinski E. et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 2011 Oct 14;147(2):423-35. Eisenächer K., Krug A. Regulation of RLR-mediated innate immune signaling - It is all about keeping the balance. Eur J Cell Biol (2011) 91:36-47 Maelfait J., Beyaert R.
Emerging role of ubiquitination in antiviral RIG-I signaling. Microbiol Mol Biol Rev. (2012) 76:33-45 Krüger E., Kloetzel P.M. Immunoproteasomes at the interface of innate and adaptive immune responses: two faces of one enzyme. Curr Opin Immunol. (2012) 24:77-83 Betreute Promotionen der letzten 5 Jahre: Dr. rer. nat. Emina Savarese, Funktion von TLR7 für die Aktivierung dendritischer Zellen durch das Autoantigen U1snRNP und die Pathogenese des Systemischen Lupus Dr. med. Christian Steinberg, Funktion von IRF3 und IRF7 im Infektionsmodell mit murinem Zytomegalievirus Dr. rer. nat. Katharina Eisenächer, Functional analysis of cytosolic sensors of viral nucleic acids and their role for innate antiviral immune defense Dr. rer. nat. Jakob Loschko, Antigen Targeting to plasmacytoid dendritic cells induction of tolerance or immunity Dr. rer. nat. Andreas Schlitzer, Development and Plasticity of murine plasmacytoid dendritic cells Dr. rer. nat. Alexander Heiseke, The role of CCL17 in murine experimental colitis Daniela Hackl (Cand.rer. nat., Urkunde noch nicht erteilt), Influence of toll-like receptor ligands on the generation and function of regulatory T cells Publikationen aus betreuten Promotionen: Savarese E. et al. Krug A. U1 small nuclear ribonucleoprotein immune complexes induce type I interferon in plasmacytoid dendritic cells via TLR7.
Blood (2006) 107:3229-34. Savarese E., Steinberg C. et al. Krug A. TLR7 is required for pristane-induced snrnp antibody production and development of lupus nephritis. Arthritis and Rheumatism (2008), 58:1107-15. Cui S.*, Eisenächer K.*, at al. Krug A., Hopfner K.-P. *contributed equally The C-terminal regulatory domain is the RNA 5-triphosphate sensor of RIG-I. Molecular Cell (2008), 29:169-79. Steinberg C., Eisenächer K., et al. Krug A. The IRF7-dependent type I IFN response is not essential for early resistance against MCMV infection. European Journal of Immunology (2009) 39:1007-18. Eisenächer K. and Krug A. Regulation of RLR-mediated innate immune signaling - It is all about keeping the balance. European Journal of Cell Biology (2011) 91:36-47 Hackl D., Loschko J. et al. Krug A. Activation of dendritic cells via TLR7 reduces Foxp3 expression and suppressive function in induced Tregs. European Journal of Immunology (2011), 41:1334-43. Loschko J., Heink S., Hackl D. et al. Korn T., Krug A. B. Antigen targeting to plasmacytoid dendritic cells via Siglec-H inhibits Th cell-dependent
autoimmunity. The Journal of Immunology (2011), 187:6346-56. Schlitzer A., Loschko L. et al. Krug A. Identification of CCR9- murine plasmacytoid DC precursors with plasticity to differentiate into conventional DCs. Blood (2011), 117:6562-70. Loschko J., Schlitzer A. et al. Krug A. Antigen delivery to plasmacytoid dendritic cells via BST2 induces protective T cell mediated immunity. The Journal of Immunology (2011), 186:6718-25. Schlitzer A., Heiseke A. F. et al. Krug A. B. Tissue-specific differentiation of a circulating CCR9- pdc-like common dendritic cell precursor. Blood (2012), 119:6063-71. Heiseke A. F., et al. Krug A.*, Reindl W.* contributed equally CCL17 drives intestinal inflammation and counteracts regulatory T cell mediated protection from colitis in mice. Gastroenterology (2012), 142:335-45.