Mitt. Österr. Ges. Tropenmed. Parasitol. (6) 6 HygieneInstitut der Universität Wien (Vorstand: Prof. Dr. H. Flamm) () Neurologische Abteilung des WilhelminenSpitals der Stadt Wien (Vorstand: Prof. Dr. E. Sluga) (2) IIFTundELISAinder serologischen Diagnose der LymeBorreliose G. Stanek, A. Hirschl, W. Kristoferitsch 2 Einleitung Die LymeBorreliose ist eine durch Borrelia burgdorferi (JOHNSON et al., 4) verursachte, systemische Infektionskrankheit, die durch den Stich von Zecken oder Insekten übertragen wird. Die Erkrankung verläuft in Stadien, die durch verschiedene klinische Manifestationen gekennzeichnet sind (Tabelle ). TABELLE : Klinische Manifestationen der LymeBorreliose Haut Stadium : etwa bis zu Monat nach der Infektion ( Nervensystem Muskeln/Skelett Leber Niere Augen Testes Nervensystem Herz Muskeln/Skelett Gelenke Nervensystem Haut Erythema chronicum migrans () Lymphadenosis cutis benigna Lymphadenopathie, regional oder generalisiert Cirkumskripte Sklerodermie, Morphea) Kopfschmerz, milde Nackensteifigkeit Myalgien oder Arthalgien SGOTt, Hepatomegalie Mikrohaematurie oder proteinurie Conjunctivitis Testikularschwellung Stadium 2: etwa bis 7 Monate nach Krankheitsbeginn Meningopolyneuritis (MPN), Radiculoneuritis AVBlock, Myopericarditis, Pancarditis migratorische Schmerzen der Muskeln, Gelenke, Bursae, Sehnen und Knochen Stadium : 5 oder mehr Monate nach Krankheitsbeginn intermittierende Attacken oligoartikulärer Arthritis, symmetrischer Polyarthritis oder chronische Arthritis chronischer Befall einschließlich Myelitis Acrodermatitis chronica atrophicans (ACA) Infektion in utero Abortus, Totgeburt, Myopericarditis des Neugeborenen
Der Krankheitserreger wurde 2 von W. Burgdorfer in der Schildzecke Ixodes dammini entdeckt (BURGDORFER et al. 2), von A. Barbour in einem flüssigen Kulturmedium angezüchtet (BARBOUR et al. ) und als Antigen für serologische Untersuchungen aufbereitet (WILKINSON 4). In kurzer Zeit wurde die extreme Verbreitung der LymeBorreliose über ganz Nordamerika sowie über Europa bis hin nach Ostsibirien erkannt (STANEK et al. 6). Eine wesentliche Diagnosehilfe ist der Nachweis von Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi in Serum und Liquor von Patienten. Der Wert der serologischen Diagnose bei den einzelnen Stadien der LymeBorreliose wird in dieser Studie erläutert. Material und Methoden Seren: Es wurde Seren von Patienten mit Erythema chronicum migrans (, 72 Seren), Meningopolyneuritis (MPN, 6 Seren) und Acrodermatitis chronica atrophicans (ACA, 50 Seren) aus Serumproben, die zur serologischen Routinediagnostik im Jahr 5 an das HygieneInstitut der Universität Wien eingesandt worden waren, ausgewählt. Die Seren wurden vor der AntikörperBestimmung mit dem ReiterTreponemenAbsorbens Sorbens" (biomerieux) absorbiert. Bestimmung von Antikörpern der IgG und IgMKlasse: IIFT (Indirekter Immunfluoreszenztest): Der IIFT wurde mit dem Äthanolinaktivierten Stamm von B. burgdorferi B durchgeführt. Als Konjugate dienten FITCgekoppeltes AntihumanIgG und IgM (biomerieux bzw. Atlantic Antibodies). ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay): Als Antigen wurde ebenfalls der Stamm B. burgdorferi B verwendet. Die Bakterienzellen wurden mittels Ultraschall aufgetrennt, das Sonikat dialysiert und das gelöste Antigen in einer Konzentration von 0 bis 20 ig Protein/ml im Test eingesetzt. Der ELISA wurde analog zu dem an anderer Stelle beschriebenen Verfahren durchgeführt (STANEK et al. ). Auswertung der serologischen Tests: In Voruntersuchen wurden an Seren von Patienten mit verschiedenen dermatologischen und neurologischen Erkankungen sowie von iciction («2 2.0.0 p 0. V cutoff 2 «5 6 ELISA (log2 \ i\ _»N \> ACA MPN 7 0 0Titer) I ELISATitrationskurven zur Ermittlung der Iog 2 Titer gesunden Personen die Schwellenwerte (2 Standardabweichungen über dem Mittelwert der Antikörpertiter der entsprechenden Kontrollseren) für IgGund IgMAntikörpertiter festgelegt. Für den IIFT sind diese :2 und :64 für IgG bzw. IgMAntikörper. Zur Auswertung der ELISAMeßwerte wurde die von F. Ambrosch und Mitarbeitern beschriebene Methode herangezogen (AMBROSCH et al. 4). Hiezu wurden die Titrationskurven im einfachen logarithmischen System dargestellt. Im Bereich eines linearen und parallelen Kurvenverlaufs wurde willkürlich ein cut off" bei einer Extinktion von 0,2 (42 nm) festgelegt (Abbildung ). Die Schwellenwerte für ELISAIgG undigm sind bei Verdünnungsstufen von log 2 7,5 + 0 bzw. 6,5 + 0 ermittelt worden.
Antikörpertiter im zeitlichen Verlauf von und MPN: Die über 6 bzw. mehr als 20 Wochen nach dem Beginn von und MPN bestehenden Antikörpertiter der IgG und IgMKlasse wurden ermittelt. Vergleich von IIFT und ELISA: IIFT und ELISAlgGAntikörpertiter wurden miteinander verglichen und die Korrelationskoeffizienten errechnet. Aufgrund der unterschiedlichen Auswertung der Tests wurden die errechneten Schwellenwerte als Bezugspunkte des Vergleichs verwendet. Ergebnisse und Diskussion IIFTErgebnisse: Tabelle 2 zeigt die mit dem IIFT erzielten Ergebnisse. In Seren von Patienten mit sind über den Schwellenwert erhöhte IgG und IgMAntikörpertiter 7 bzw. 2 mal nachzuweisen. Bei MPNSeren werden diese in 65 bzw. Seren festgestellt. Alle Seren von Patienten mit ACA weisen positive IgG, jedoch keine IgMAntikörpertiter auf. TABELLE 2: Ergebnis der Antikörpertiterbestimmung mittels IIFT an Seren reziproker IIFTTiter (n = 72) IgG MPN (n = 6) IgG ACA (n 50) IgG > 6 25 26 2 2 2 4 2 64 IV) 4 2 26 22 27 6 25 24 42 2 0 5 Veränderungen der Antikörpertiter im zeitlichen Verlauf von und MPN zeigt Abbildung 2. Erst bis 6 Wochen nach Erkrankungsbeginn ist bei sowie bei MPNSeren ein signifikanter Abfall der IgMTiter festzustellen. Beim liegt eine IgMTiterbewegung praktisch ausschließlich unter dem Schwellenwert vor. IgGTiter liegen beim ebenfalls in der Mehrzahl unter dem Schwellenwert, während bei MPN ab der 5. Woche nach Erkrankungsbeginn IgGTiter nur noch über dem Schwellenwert gefunden werden.
Anzahl Serer n = 72 MPN A nzah) Seren n _ 6 => > ::: J ::: : : : :. : Tiler) 2 64 2 64 ::: " _! _"* _ _ : i 2 6 p i f i : : : : i... 2 6 II * W 00 < 6 g... ooo l... o < 6 00 V 45 2 6 45 2 6 >20 t IgM Schwellenwert W O C H E N Abb. 2: IIFTIgG und IgMAntikörpertiter im zeitlichen Verlauf von und MPN Vergleich von IIFT und ELISAErgebnissen: Abbildung zeigt die Korrelation von IIFT und ELISAlgGTitern. Die Korrelationskoeffizienten für, MPN und ACASeren sind r = 0,5, 0, bzw. 0,65. Unterschiede in der Bewertung positiv oder negativ mittels beider Tests sind in Tabelle zusammengefaßt. Der prozentuelle Anteil positiver Ergebnisse mittels IIFT und ELISA zeigt weitgehend übereinstimmende Werte. MPN ACA II P r r 4 ^25 0 + 2 2 / 5 26 2 y /+ g 7 L ^ 0 a/ ^ / 2 2 / LISA ^ / 5 ^2 2 7 Schwe llenwert IIFT Abb. : Korrelation von IIFT und ELISA (Iog 2 Titer)
TABELLE : Anzahl (%) positiver serologischer Ergebnisse durch IIFT und ELISA n (%) mit positivem Test Erkrankung Anzahl Patienten IIFT ELISA igg igg IgM MPN ACA 72 6 50 7 (2,6) 65 (4,2) 50(00) 0,4) (,6) 0 (0) 5 (20,) 6 (,) 50(00) 0 (0) 0(4,) (6) Der IIFT sowie der ELISA mit B. burgdorferi als Antigen erweisen sich für die serologische Diagnose der LymeBorreliose als geeignete Tests. Die serologische Bestätigung der Diagnose hängt allerdings vom Stadium der Erkrankung ab. Nur in 2,6% (IIFT) und 20,% (ELISA) der 72 Seren von Patienten mit wurden über den Schwellenwert erhöhte IgGTiter gefunden. Bei Seren von Patienten mit neurologischen Komplikationen wurden positive IgGTiter bereits in 4,2% (IIFT) und,% (ELISA) nachgewiesen. In allen Seren von Patienten mit ACA wurden mit beiden Tests positive IgGTiter ermittelt. Da Titerbewegungen bei neurologischen Manifestationen und ACA nur sehr langsam erfolgen, sollten nach einer geeigneten Therapie serologische Verlaufsuntersuchungen im Abstand von und 24 Wochen durchgeführt werden. Zusammenfassung Mit einem Indirekten Immunfluoreszenztest (IIFT) und einem ELISA wurden Antikörpertiter der IgG und IgMKlasse gegenüber Borrelia burgdoferi in Seren von Patienten mit verschiedenen Manifestationen der LymeBorreliose bestimmt. Die Ergebnisse mit beiden Tests zeigten keine signifikanten Unterschiede. In Abhängigkeit vom Stadium der Erkrankung wurden über einen kalkulierten Schwellenwert erhöhte IgGTiter in 2,6 und 20% (IIFT bzw. ELISA) bei Erythema chronicum migrans, in 4,2 und,% bei neurologischen Manifestationen und in 00% bei Acrodermatitis chronica atrophicans bestimmt. Summary IFA and ELISA for the serological diagnosis of Lyme Borreliosis Antibodies of the IgG and IgMclass have been measured by Indirect Immunofluorescence Test (IFA) and ELISA on sera of patients with various manifestations of Lyme Borreliosis. The results of both tests did not show any relevant differences. IgGtiters above a calculated thresholdlevel could be determined by IFA and ELISA in sera of patients with Erythema chronicum migrans, in some neurological manifestations and in Acrodermatitis chronica atrophicans in 2.6% and 20.%, 4.2% and.% and 00%, respectively.
Literatur AMROSCH, F., WIEDERMANN, G., MÜLLER, H. (4): Eine neue Mikromethode zur Bestimmung der TetanusAntikörper. Zbl. Bakt. Hyg. A 25, 72. BARBOUR, A. G., BURGDORFER, W., HAYES, S. F., PETER, O., AESCHLIMANN, A. (): Isolation of a cultivable spirochete from ixodes ricinus ticks of Switzerland. Current Microbiology, 226. BURGDORFER, W., BARBOUR, A. G., HAYES, S. F., BENACH, J. L, GRUNWALD, E., DAVIS, J. P. (2): Lyme disease A tickborne spirochetosis? Science 26, 7. JOHNSON, R., SCHMID, G. P., HYDE, F. W., STEIGERWALDT, A. C, BRENNER, D. J. (4): Borrelia burgdorferi sp.nov.: Etiologic agent of lyme disease. Int. J. Syst. Bact. 4, 4647. STANEK, G., BARBOUR, A. G., BURGDORFER, W., FLAMM, H. (6): Lyme Borreliosis.. Auflage, Gustav FischerVerlag, Stuttgart/New York, (im Druck). STANEK, G., HIRSCHL, A., LESSKY, E., WEWALKA, F., RUCKDESCHEL, G., WEWALKA, G. (): Indirect immunofluorescence assay (IFA), microagglutination test (MA) and enzymelinkedimmunosorbentassay (ELISA) in diagnosis of legionellosis. Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 255, 04. WILKINSON, H. W. (4): Immundiagnostic test for lyme disease. Yale J. Biol. Med. 57, 567572. KORRESPONDENZADRESSE: Dr. med. Gerold Stanek HygieneInstitut der Universität Kinderspitalgasse 5 A05 Wien