Gerhart Drews Mikrobiologisches Praktikum für Naturwissenschaftler Mit 51 Abbildungen Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH
Professor Dr. Gerhart Drews Institut für Mikrobiologie der Universität Freiburg i. Brsg. Das Umschlagbild zeigt einen Streptococcus faecalis infiziert mit Bde11ovibrio bacteriovorus Alle Rechte vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH übersetzt oder in irgendeiner Fonn vervielfaitigt werden. by Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1968. Ursprünglich erschienen bei Springer Verlag Berlin Heidelberg New York 1968. Library of Congress Catalog Card Number 68 56102. ISBN 978-3-540-04077-4 ISBN 978-3-662-00644-3 (ebook) DOI 10.1007/978-3-662-00644-3 Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinn der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedennann benutzt werden dürften. Tite1-Nr. 1535
Vorwort In den letzten Jahrzehnten hat man auf vielen Gebieten der Grundlagenforschung und in angewandten Disziplinen den Mikroorganismen steigende Beachtung geschenkt. An Mikroorganismen als relativ einfach gebauten lebendigen Systemen mit kurzer Generationsdauer und hoher Reproduktionsleistung wurden grundsätzliche Erkenntnisse auf biochemischem, molekularbiologischem und genetischem Gebiet gewonnen. Mikroorganismen sind auch industriell bedeutsame Stoffproduzenten geworden, mit deren Hilfe Antibiotica und andere pharmazeutisch wichtige Stoffe sowie in der Lebensmittelindustrie verwendete Substanzen wie z. B. Glutaminsäure, Citronensäure, Essigsäure, Äthanol und viele Enzyme produziert werden. Ökologische Untersuchungen über den Stoffumsatz in der Natur können an den Mikroorganismen nicht vorübergehen und haben taxonomische, physiologische und populationsgenetische Arbeiten angeregt. Es ist daher notwendig, daß die Mikrobiologie im naturwissenschaftlichen Unterricht der Gymnasien und Hochschulen eine gebührende Berücksichtigung findet. Das vorliegende Bändchen soll eine Lücke im deutschsprachigen Schrifttum füllen und allen helfen, die sich mit den Objekten, Problemen und Methoden der Mikrobiologie vertraut machen wollen. Das Buch ist in Anlehnung an die im Rahmen des Biologiestudiums an der Universität Freiburg i. Br. durchgeführten mikrobiologischen Praktika entstanden. Es enthält sowohl Versuche für einen halbtägigen Anfängerkurs als auch für ein ganztägiges Fortgefichrittenenpraktikum. Selbstverständlich konnten nicht alle Aspekte der Mikrobiologie Berücksichtigung finden. Sie werden in ergänzenden Lehrveranstaltungen behandelt. Die Auswahl an Organismen, Methoden und Themen geschah nach didaktischen Gesichtspunkten. Eine Vollständigkeit im Sinne einer Methodensammlung wurde nicht angestrebt. Ich möchte allen danken. die mir mit ihrer Erfahrung bei der kritischen Durchsicht des Textes und der Ausarbeitung der Arbeitsvorschriften halfen. Mein besonderer Dank gilt den Herren Kollegen Schlegel und Kandler. die mir aus ihrem Kursprogramm ausgearbeitete Skripten zur Verfügung stellten. Mein Dank gilt auch dem Verlag für sein Verständnis und Entgegenkommen bei der Ausstattung und Drucklegung. Freiburg. im Juli 1968 G. Drews
Inhaltsverzeichnis 1. Die wichtigsten Voraussetzungen für das Arbeiten mit Mikroorganismen 1 1. Nährböden. 1 a) Allgemeine Gesichtspunkte 1 b) Kohlenstoffquelle. 2 c) Stickstoffquelle 5 d) Anorganische Ionen 5 e) Nährbodenzusätze. 6 f) ph-wert, Pufferung 7 g) Gelierungsmittel. 8 h) Standardnährböden für Bakterien und Pilze 9 2. Kulturgefäße und ihre Verschlüsse 10 3. Sterilisation 12 a) Sterilisation durch trockene Heißluft 12 b) Sterilisation im Dampf 13 c) Sterilisation durch Filtration 16 d) Andere Sterilisationsverfahren 17 4. Prinzipien des sterilen Arbeitens 18 5. Kulturtechnik. 22 a) Aerobe Verfahren. 22 b) Anaerobe Verfahren 28 Literatur. 31 H. Die Anreicherung und Isolierung von Mikroorganismen 32 1. Anreicherung von Bakterien und Blaualgen 33 2. Anreicherung von Pilzen 54 3. Anreicherung von Bacteriophagen 56 4. Isolierung aminosäurebedürftiger Mutanten von Escherichia coli 57 5. Reinkultur 62 a) Kochsches Plattengußverfahren und Plattieren auf Agaroberflächen 62 b) Isolierung und Reinkultur von Anaerobiern 65 c) Das Lindnersche Tröpfchenverfahren 69 d) Der Mikromanipulator 70
- VI - e) Pipettier- und Waschmethode Literatur. 70 72 111. Die Untersuchung der Morphologie und Cytologie von Mikroorganismen 73 1. Mikroskopische Beobachtungen an der lebenden Zelle 73 a) Phasenkontrastverfahren 73 b) Herstellung von Objektträger-Agarkulturen 75 2. Beobachtungen an makroskopisch sichtbaren Zellansammlungen. 78 3. Die Untersuchung fixierter und gefärbter Objekte 80 a) Herstellung von Ausstrichpräparaten 80 b) Durchführung der Färbungen 81 Literatur. 89 IV. Methoden zur Identifizierung von Bakterien 90 1. Verschiedene Nachweise 90 a) Bewegungsfähigkeit von Bakterien 90 b) Verwertbarkeit von Zuckern 91 c) Indolnachweis. 94 d) H2S-Nachweis. 94 e) Ureasenachweis 94 f) Nachweis proteolytischer Exoenzyme 95 g) Voges-Proskauer-Reaktion 95 h) Amylasen 96 i) Denitrifikation 96 2. Bestimmung von Athiorhodaceae nach morphologischen Merkmalen und dem in-vivo-spektrum 97 Literatur. 101 V. Die Messung von Wachstum und Vermehrung 102 1. Direkte Bestimmung der Zellzahl (Gesamtkeimzahl) 102 a) Thomakammer 102 b) Membranfiltermethode 104 2. Plattieren auf Nähragar (Lebendkeimzahlbestimmung) 106 3. Methoden zur Bestimmung der Bakterienmasse (Nephelometrie) 107 a) Lichtstreuungsmessung 107 b) Trübungsmessung. 107 4. Bestimmung des Trockengewichtes 5. Proteinbestimmung 6. Bestimmung der Wachstumsrate 7. Das Wachstum mycelbildender Organismen Literatur. 109 110 111 115 115
- VII - VI. Bacteriophagen 116 1. Nachweis und quantitative Bestimmung von Phagen 116 2. Wirtskreis 118 3. Einschritt-Wachstumskurve 119 Literatur 121 VII. Bdellovibrio bacteriovorus 122 Literatur 123 VIII. Nachweis und quantitative Bestimmung von Stoffen mit Hilfe von Mikroorganismen 124 Literatur. 127 IX. Antibiotica und Desinfektionsmittel 128 1. Nachweis der Antibioticaproduktion bei isolierten Streptomyceten (qualitativer Test) 128 2. Quantitative Bestimmung der Antibiotica 130 a) Agardiffusionstest 130 b) Reihenverdünnungstest 134 3. Desinfektionsmitteltest. 136 4. Produktion von Penicillin durch Penicillium chrysogenum (notatum) 137 5. Versuche zur Wirkung von Antibiotica 139 a) Penicillin 139 b) Chloramphenicol. Streptomycin und Puromycin 143 Literatur. 145 X. Serologische Methoden 146 1. Agglutination. 147 2. Präcipitation. 149 a) Präcipitation in der Interphase....... 149 b) Bestimmung des Äquivalenzbereiches (Titerbestimmung) 149 c) Agarge1diffusionstest 150 3. Komplementbindungsreaktion-Immunhämolyse 151 4. Hämagglutinationshemmungsreaktion (Neutralisation) 153 Literatur. 154 XI. Isolierung und Untersuchung von Zellstrukturen 155 1. Homogenisation von Bakterien. 155 2. Isolierung von Bakterien-Thylakoiden. 157 3. Aufnahme eines in-vivo-spektrums von Thylakoiden 160
- VIII - 4. Photophosphorylierung 162 5. Nachweis der Succinat-Dehydrogenase in Thylakoiden von R. rubrum 166 6. Isolierung und Analyse von Zellwänden 167 Literatur. 171 XII. Versuche zum Gasstoffwechsel 172 1. Nitratatmung bei Micrococcus dinitrificans 172 2. Oxydative Phosphorylierung bei Mycobacterium phlei 177 3. Gärung, Atmung, Pasteur-Effekt 184 Literatur 187 XIII. Versuche zur Regulation der Enzymaktivität und Enzymsynthese 189 1. Induktion der Synthese von p-galactosidase in E. coli 189 2. Regulation der Threonindehydratase aus Hefe 191 3. Versuche zur induktiven Synthese der Enzyme im Mandelsäureweg bei Pseudomonas putida. 193 4. Versuche zur Regulation der Bacteriochlorophyllsynthese bei R. rubrum. 196 a) Induktion der BChl.-Synthese durch Änderung des Sauerstoffpartialdruckes in aeroben Dunkelkulturen und Hemmung durch Actinomycin 197 b) Regulation der BChl.-Synthese durch Änderung der Lichtintensität 199 Literatur. 199 XIV. Versuche zur Phototaxis bei Bakterien und Blaualgen 200 Literatur. 202 XV. Produktion von Citronensäure durch Aspergillus niger 203 Literatur. 207 Zeitplan für einen einsemestrigen Kurs (5 Wo. Std.) 208 Namen- und Sachverzeichnis 210