Next Generation Microbiology

Next Generation Microbiology Alexander Indra Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien Zentrum für anthropogene Infektionen Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH

Old Generation Microbiology Current Generation Microbiology Next Generation Microbiology - Was ist das? - Wo gibts das? - Wer kann das? - Warum braucht man das? - Wann gibt es das?

Mycobakteriendiagnostik im Labor

Old Generation Microbiology

Old Generation Microbiology phänotypische Methoden - Kultur o Wachstumsform ofarbe, Geruch, - Mikroskopie - Bestimmung der biochemisichen Eigenschaften o z.b. API20E - Bestimmung der Antibiotika-Resistenz - Phagentypisierung - Serotypisierung Quelle: Alexander Indra

Old Generation Microbiology Oxacillin testen Oxacillin sensibel ( 20 mm; 0,06 µg/ml) Oxacillin resistent ( 19 mm; 0,06 µg/ml) Pneumokokken (cave: neue Breakpoints!) Alle beta- Lactame sensibel Penicillin E- Test P sensibel ( 0,06 µg/ml) P. int. oder resi. (0,12-1µg/ml) bzw. ( 2 µg/ml) Alle beta- Lactame sensibel E-Test für andere beta- Lactame z.b. bei Meningitis: Cefotaxim S: 0,5 µg/ml R: 2 µg/ml I: 1 µg/ml Ceftriaxon S: 0,5 µg/ml R: 2 µg/ml I: 1 µg/ml Meropenem S: 0,25 µg/ml R: 1 µg/ml I: 0,5 µg/ml 24.11.20 ABS-Symposium 2009 15 6

Current Generation Microbiology

Current Generation Microbiology Genotypische Methoden - auf den Nachweis von Genen basierende Methoden o Hybridisierung o PCR Kontventionell Multiplex Realtime PCR - Fragmentanalysen o MIRU-VNTR, PCR-Ribotyping - Sequenzanalyse von DNA o 16s-Speziesbestimmung o SBT-Typing, spa-typing, MLST

Current Generation Microbiology line-probe-assay Quelle: http://www.hain-lifescience.de/uploadfiles/file/technologie/technik_dt.pdf

Current Generation Microbiology ein line-probe-assay zum Nachweis der wichtigsten Mutationen Durchführung des Tests auch aus Primärmaterial ein positives Ergebnis bedeutet mit hoher Wahrscheinlichkeit, daß es sich um einenmdr-stamm handelt

Current Generation Microbiology die Befundinterpretation ist zum Teil schwierig ein negatives Ergebnis kann nur durch kulturelle Resistenztestung bestätigt werden Bahn 2 um welche Resistenz handelt es sich?

Current Generation Microbiology Hotspot -Region im rpob-gen Musser, CM-Rev 1995

Current Generation Microbiology Das FilmArray GIPanel erlaubtden Nachweisvon 22 Pathogenen gleichzeitig -Bakterien: o Campylobacter, Clostridium difficile, Plesiomonas shigelloides, Salmonella, Vibrio, (including V. cholerae), Yersinia enterocolitica, Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC; lt/st), Enteropathogenic E. coli (EPEC), Shiga toxin-producing E. coli /STEC; stx1/stx2, including E. coli O157), Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC), -Viren: o Adenovirus F40/41, Astrovirus, Norovirus GI/GII, Rotavirus A, Sapovirus - Parasiten: o Cryptosporidium, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia

Current Generation Microbiology Spina et al. haben 709 Proben mit FilmArray GI Panel und Kultur bestimmt 128 (18.1%) der Proben waren mit konventionellen Methoden positiv 384 (54,2%) der Proben waren ein oder mehreren Erregern positiv Quelle: http://filmarray.com/wp content/uploads/2014/03/set-up-stationprotocol_faiv_web.png Warum noch anders TESTEN?

Next Generation Microbiology

Next Generation Microbiology -US clinics quietly embrace whole-genome sequencing - Published online 14 September 2010

WHOLE GENOME SEQUENCING: kurzer Geschichte 1976: Walter Fierssequenziert das Genom des MS2-RNA Phagen - 3,569bp 1977: Fred Sanger sequenziert den Phagen Φ-X174 mit - 5386bp 1995: Haemophilusinfluenzae die erste Bakterie wird sequenziert - 1.830.000bp 1998: Caenorhabditiselegans, das erste tierische Genom wird sequenziert - 100.300.000bp 2000: Arabidopsisthaliana, die erste Pflanze wird sequenziert - 157.000.000 bp

WHOLE GENOME SEQUENCING: kurzer Geschichte 1990: Start des Human Genom Projects - Ziel: oidentifizierung aller Gene des Menschen ca. 3 Milliarden Basenpaare oentwicklung neuer Technologien neuer Datenanalysemethoden» Bioinformatik 2003: Erste komplette DNA-Sequenz des Menschen - Kosten ca. 3 Mrd. Dollar

Next Generation Microbiology Was ist Next- Generation- Sequencing?

WHOLE GENOME SEQUENCING: Anwendung in der Mikrobiologie Amplikon-Sequenzierung NGS-Datenanalyse z.b. Resistenztestung Vergleich verschiedener Bakterien gleicher Spezies - Identifikation unbekannter Pathogenitätsfaktoren Identifikation unbekannter Erreger - Suche nach mikrobiologischen Verursachern Beschreibung neuer Erreger - Erkennung neuer Spezies durch Vergleich mit Sequenzen anderer Bakterien

Amplikon-Sequenzierung

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing

Amplicon Sequencing Woher kommt das?

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse Spezies Identifikation - Subtypen - Ausbruchsabklärung? Genotypische Resistenz - Sequenzdaten - Nachweis bekannter Mutationen oonline Datenbanken Pathogenitätsfaktoren - Virulenzgene

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

NGS-Data-Analyse

Vergleich verschiedener Bakterien gleicher Spezies 41

Vergleich verschiedener Bakterien gleicher Spezies Chromosom gegen Chromosom (Genome alignment) Zuverlässig, aber jedes Chromosom kann unterschiedlich sein Genetische Unterschiede bei jeder ca. 10 6 Zellteilung Zumindest 1 durchanalysiertes Genom nötig Anzahl an zu vergleichender Genome eingeschränkt Computerleistung ist beschränkt Source: Aaron E. Darling et al. PLOS Genetics. 2008 (DOI:10.1371/journal.pgen.1000128.) 42

What is compared? GenomweiteMutationsanalyse(SNP-calling) Single nucleotide polymorphism (variants) (SNP or SNV) Zwei oder mehr Chromosome unterscheiden sich in zumindest einer SNP Funktioniert am besten mit klonalen Erregern Ein komplett analysiertes Genom ist notwendig zum Vergleich Source: A. Der Vergleich muss immer gegen das gleiche Chromosom Indra erfolgen Nomanklature kompliziert Jedes Isolate ist unterschiedlich SNP finden sich nach jeder Zellteilung

Vergleich verschiedener Bakterien gleicher Spezies Allel gegen Allel Vergleich Eine MLST/SBT mit hunderten/tausenden Genen Gen Varianten (Allele) werden gegeneinander verglichen Ein neues Allel wird unabhängig der Anzahl an Mutationen im Gen definiert Eine Kern Gruppe von Genen (core-genom) die bei allen Spezies vorkommt wird verglichen Nicht so dikrematative wie SNP und Genom vergleich Die Nomenklatur ist leicht zu vereinheitlichen Source: A. Indra, 2015 44

Vergleich verschiedener Bakterien gleicher Spezies Werner Ruppitsch et al. J. Clin. Microbiol. 2015;53:2869-2876

Identifikation unbekannter Erreger

Identifikation unbekannter Erreger

Beschreibung neuer Erreger 2014 Naccache et al. This article, published in Genome Research, is available under a Creative Commons License (Attribution-NonCommercial 4.0 International),as described at http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/. 48

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WHOLE GENOME SEQUENCING: Zukunft

WHOLE GENOME SEQUENCING: Zukunft https://www.nanoporetech.com/science-technology/how-it-works https://www.nanoporetech.com/sciencetechnology/how-it-works

Danke für ihre Fragen Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit GmbH