SDS- PAGE und Western Blot LiSSA Methodenseminar 16.09.2015 Doreen Braun InsCtut für Biochemie und Molekularbiologie doreen.braun@uni- bonn.de
Grundstruktur von Aminosäuren H H H 2 N C R + H 3 N C R COOH L- Aminosäure COO - wässrige Lösung, ph7 NH 2 COOH H R Aminogruppe Carboxylgruppe Wasserstoff variabler Rest
Primärstruktur PepCdbindung H H H O H H 2 N C COOH + H 2 N C COOH H 2 N C C N C COOH + H 2 O R 1 R 2 R 1 H R 2 Sekundärstruktur TerCärstruktur Wechselwirkung des PepCdrückgrats Wechselwirkung zwischen Aminosäureseiten- ke_en α- Helices β- Faltblä_er
SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) - Komponenten - 5% PAA > 7% PAA Sammelgelpuffer (Tris- HCl ph6,8; SDS) Trenngelpuffer (Tris- HCl ph8,8; SDS) PAA - Polyacrylamid Laemmli- Puffer Tris- HCl, ph6,8 SDS ß- Mercaptoethanol oder DTT Glycerin (Beschweren der Probe) Bromphenolblau (Farbe) Laufpuffer SDS Glycin Tris
Natriumdodecylsulfat - SDS Enjaltung von globulären Proteinen Überdeckung der Eigenladung des Proteins Einheitliche negacve Ladung
ß- Mercaptoethanol oder DTT - RedukConsmi_el - H Cystein H 2 N C CH 2 SH + HS H 2 C H C Cystein COOH - 2H + - 2e - COOH NH 2 H CysCn H H 2 N C CH 2 S S H 2 C C COOH COOH NH 2
Sammelgel ph8,3 Cl - - Ionen (Sammelgelpuffer) ph6,8 große Porengröße ph8,8 Glycin H + H 3 N C H Zwi_erion bei ph6,8 (Laufpuffer) COO - neg. Ladung bei ph8,3 & ph8,8
Sammelgel Elektrisches Feld Cl - - Ionen wandern schnell voraus (Leit- ionen) Glycin als Zwi_erion wandert langsam hinterher (Folgeionen) Cl - - Ionen werden aufgrund der posi- Cven Ladung des Glycinat zurück- gehalten Protein- SDS- Komplexe wandern als Stapel (stack) zwischen Leit- und Folgeionen mit koncnuierlicher Ge- schwindigkeit
Trenngel Elektrisches Feld ph6,8 ph8,8 ph8,3 große Porengröße geringere Porengröße Trenngel- Sammelgel- Grenze Änderung ph- Wert Änderung Porengröße ph- Wert: 8,8 Glycin verliert zwi_erionischen Charakter negacve Ladung überwiegt à Zu- nahme Mobilität Trenngel - Sammelgel- Grenze Änderung ph- Wert Änderung Porengröße
How to prepare a SDS- PAA- gel: Putzen Glaspla_en, Kamm, Spacer 70% Ethanol (Enjernung von Staub, PAA- Resten...) Zusammenbauen und Einspannen auf Dichtheit testen Trenngel gießen Zusammensetzung siehe Tabelle 2 mit Isopropanol (Wasser, Ethanol...) überschichten Sammelgel gießen (doppelte Kammlänge) Isopropanol enjernen und mit Wasser spülen (Reste mit Filterpapier enjernen) Zusammensetzung siehe Tabelle 2 Kamm einsetzen
Tabelle 1: Puffer
Tabelle 2: Zusammensetzung SDS- PAA- Gel Trenngel: 20 ml 7,5 % 10 % 12,5 % 15 % dh 2 O 7,5 ml 5 ml 2,5 ml - Trenngelpuffer 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml Gellösung (20%) 7,5 ml 10 ml 12,5 ml 15 ml Temed 20 µl 20µl 20 µl 20 µl APS (10%) 200 µl 200µl 200 µl 200 µl Sammelgel: 10 ml 5 % dh 2 O 5 ml Sammelgelpuffer 2,5 ml Gellösung (20%) 2,5 ml Temed 10 µl APS (10%) 100 µl % Acrylamid MW (kda) 7,5 25-200 10 15-100 12,5 10-70 15 12-45
Tabelle 3: Kämme (Peqlab- Gele)
TroubleshooCng - Hall of Shame h_p://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds- page/sdsgoofs.html
TroubleshooCng - HycultBiotech weitere Beispiele verfügbar h_ps://www.hycultbiotech.com/media/wysiwyg/troubleshoocng_sds- PAGE_1.pdf
Western Blot SDS- PAA- Gel, Comassie- Färbung Western Blot, Nitrocellulosemembran
Tabelle 4: Ladungskontrollen
Western Blot - Auxau Übertragung der negacv geladenen SDS- Protein- Komplexe auf Membran. Blo_en bei konstanter Einstellung der Stromstärke: 2-5 ma/cm 2 Zeit Transferpuffer (ph 8,3) Glycin Tris Methanol (SDS)
H 2 O à H + + OH - OH - Die entstehenden Ionen werden über die Filterpapiere abgeleitet. ph- Wert des Transferpuffers nicht einstellen! Änderung des ph- Wertes führt zur vermehr- ten Bildung von Ionen und Hitzeentwicklung. Die Filterpapiere können das Übermaß an Ionen nicht kompensieren à braun- ver- brannte Membran H +
Methanol und SDS Methanol verhindert Schwellen des Gels à unscharfe Banden erhöht AbsorpCon der Proteine an NC- Membran verringert Porengröße SDS verbessert Transfereffizienz großer Proteine bei kleinen Proteinen nachteilig (equi- librieren des Gels in Transferpuffer)
Membran PVDF stabiler à Stripping geeignet hydrophobe Membran für hydrophobe Proteine (z.b. Membranproteine) höhere Bindungskapazität: 150-160 µg/cm 2 NC schnellere Bindung Stripping ungeeignet Bindungskapazität: 80 µg/cm 2 Porengröße: 0,45µm > 20 kda 0,2µm < 15kDa
Diskon@nuierliches Puffersystem Semi- Dry Blot Filterpapiere in Kathoden- und Anodenpuffer getränkt höhere Transferleistung Transfer hydrophober Proteine Natriumcarbona_ransferpuffer, ph9,9 (nach Dunn) 10x (1l): 8,4 g NaHCO 3 & 3,2 g Na 2 CO 3 ph- Wert des Puffers sollte 2 ph- Einheiten höher liegen als IEF
Nach dem Blo_en - Anfärben der Membran Ponceau- S- Rot (0,1 % in 5 % Essigsäure) Überprüfung des Transfers bindet reversibel an posicv geladene Aminogruppen von Proteinen
Nach dem Blo_en - Blockieren Absä~gen unspezifischer Bindungsstellen AnCkörper = Proteine Magermilchpulver preiswert ungeeignet für DetekCon von Phospho- Protein enthält Casein (Phospho- Protein) à Hintergrund BSA Milch, BSA ß- AcCn ß- AcCn ß- AcCn Membran
Nach dem Blo_en - AnCkörper
Nach dem Blo_en - AnCkörper Waschen Viel hil viel.
Nach dem Blo_en - DetekCon ECL - enhanced chemiluminescence Luminol + Peroxid à [angeregtes Intermediat] à 3- Aminophthalat + Licht (Emmisison bei 428nm) HRP: 2 H 2 O 2 à O 2 +2 H 2 O
TroubleshooCng - Western blot doctor (BioRad)
Danke und guten AppeCt