Technische Universität München Physik Department Lehrstuhl für Biophysik E22 Entwicklung einer neuen mikromechanischen Methode zur Messung der Biegesteifigkeit von einzelnen Mikrotubuli Christian Wolfgang Maier Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Physik der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Prüfer der Dissertation: Univ.-Prof. Dr. M. Kleber 1. Univ.-Prof. Dr. E. Sackmann 2. Hon.-Prof. Dr. P. Fromherz Die Dissertation wurde am 12.7.2001 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Physik am 4.9.2001 angenommen.
Berichte aus der Biophysik Christian Maier Entwicklung einer neuen mikromechanischen Methode zur Messung der Biegesteifigkeit von einzelnen Mikrotubuli. Shaker Verlag Aachen 2001
Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme Maier, Christian: Entwicklung einer neuen mikromechanischen Methode zur Messung der Biegesteifigkeit von einzelnen Mikrotubuli / Christian Maier. Aachen : Shaker, 2001 (Berichte aus der Biophysik) Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 2001 ISBN 3-8265-9496-7. Copyright Shaker Verlag 2001 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN 3-8265-9496-7 ISSN 1439-7897 Shaker Verlag GmbH Postfach 1290 52013 Aachen Telefon: 02407 / 95 96-0 Telefax: 02407 / 95 96-9 Internet: www.shaker.de email: info@shaker.de
Für Claudia
Vorwort Diese Arbeit ist das Ergebnis einer Vielzahl von Leuten, denen ich an dieser Stelle meinen herzlichsten Dank aussprechen möchte für ihre Kollegialität, ihre Hilfe und den Beitrag, den sie für dieses Werk geleistet haben. Mein besonderer Dank gilt... Prof. Dr. Erich Sackmann, für die Möglichkeit, bei E22 zu promovieren und damit eine großartige Arbeitsatmosphäre genießen zu dürfen, die einen stets motiviert hat und den Spaß an der Arbeit nicht hat vergessen lassen.... Dr. Rudi Merkel, für die ausgezeichnete Betreuung während meiner gesamten Zeit am Lehrstuhl, für seinen unerschöpflichen Wissensvorrat, seinen großen Ideenreichtum und nicht zuletzt auch für die vielen Freiheiten, die er mir gelassen hat.... Andreas Schneider, für sein Wissen und die vielen Tipps rund um das Thema Algen & Axoneme. Ohne seine Unterstützung und seine Hilfsbereitschaft bei der Kultivierung der Chlamydomonas-Zellen würde ich jetzt wahrscheinlich immer noch mit Kaliumspritzen in Seeigeln herumstochern...... Karl Eberle, Rudolf Lehrhuber und Erwin Plötz für viele feinmechanische Meisterstücke, die aus einer Messidee erst einen Versuchsaufbau gemacht haben und den werkstattlichen Beistand bei unzähligen kleinen Tüfteleien.... Hulda Kirpal, für ihre unentbehrliche Hilfe bei der gesamten Tubulinpräparation, die ein von biochemischen Arbeitsmethoden ahnungsloser Physiker wie ich sonst wohl nie geschafft hätte.... Christian Hamm vom Alfred-Wegener-Institut für eine sehr interessante und unterhaltsame Woche mit Thalassiosira punctigera.... Marius DJ Dichtl, für die Eichmessung am Konfokalen Mikroskop und für die gemeinsame Leidens zeit am Ende der Promotion.... Reinhard Galneder und Valentin Kahl für die Durchführung der Elektrophorese-Experimente an den BSA-Vesikeln.... Stefan Herr Doktor, denn so viel Zeit muss sein Kaufmann, nicht nur für seine Hilfe bei allen chemischen Fragen, sondern auch für viele fußballerische Fachdiskussionen, die jedes Phrasenschwein hätten platzen lassen.
... den Mitstreitern im Labor Claudia, Doris, Felix, Ingrid, Jörg, Katrin, Markus & Markus, Melanie, Michael & Michael, Norbert und Tobias für eine unvergessliche Zeit mit PuyoPuyo-Beta-Testing, Wasserspendern, Re-Volt, Internet-Gewinnspielen, Sänftenbau, Döhnlöhds, Sokoban, schlecht programmierten Zufallsgeneratoren, Haribo, Mensagängen, Xool und vielen dummen Sprüchen ( Oft weiß man s einfach überhaupt nicht... ). Auch die frustrierendsten Messtage machen Spaß, wenn man solch nette Kollegen wie Euch hat.... allen ehemaligen und jetzigen Mitarbeitern von E22 für ihre ständige Hilfsbereitschaft und das etwas andere Arbeitsklima.... allen, die ich an dieser Stelle vergessen habe. Ihr mögt es mir bitte verzeihen. Mein ganz spezieller Dank geht an meine Eltern und meine Freunde, auf die ich mich jederzeit verlassen kann und die immer da sind, wenn ich sie brauche.
Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung 3 3 Theoretische Grundlagen 9 3.1 Elastizitätstheorie zur Biegung langer, dünner Stäbe... 9 3.2 Hydrodynamik der Bewegung eines langen, dünnen Körpers parallel zu einer flachen Wand bei kleinen Reynolds-Zahlen.. 15 4 Materialien 23 4.1 Mikrotubuli... 23 4.1.1 Isolation von Tubulin... 24 4.1.2 Polymerisation von Tubulin zu Mikrotubuli... 24 4.2 Axoneme... 25 4.2.1 Kultivierung von Algenzellen... 27 4.2.2 Isolation von Axonemen... 29 5 Methoden 31 5.1 Versuchsaufbau... 32 5.1.1 Messkammer... 32 5.1.2 Mikromanipulation... 32 5.1.3 Lichtmikroskopie und Bildverarbeitung... 34 5.2 Versuchsvorbereitung... 37 5.2.1 Probenpräparation... 37 5.2.2 Herstellung von Mikroglasnadeln... 37 5.3 Versuchsdurchführung... 39 5.4 Versuchsauswertung... 39 5.4.1 Bestimmung der Filamentkontur... 40 5.4.2 Messung der Viskosität der Pufferlösung... 41 vii
5.4.3 Eichung des Mikromanipulators... 43 5.4.4 Ermittlung des Strömungsfelds um die Glasnadelspitze 44 5.5 Fehlerabschätzung... 47 5.5.1 Einzelfehler... 47 5.5.2 Gesamtfehler... 49 6 Ergebnisse 53 6.1 Biegesteifigkeit von einzelnen Mikrotubuli... 53 6.2 Bruchversuche an Mikrotubuli... 56 7 Diskussion 59 7.1 Gültigkeit der theoretischen Modelle... 59 7.1.1 Elastizitätstheorie... 59 7.1.2 Hydrodynamik... 60 7.2 Beschaffenheit der Mikrotubuli... 61 7.2.1 Länge des Mikrotubulus... 61 7.2.2 Anzahl der Protofilamente... 62 7.3 Abschätzung charakteristischer Eigenschaften... 63 7.3.1 Elastizitätsmodul... 63 7.3.2 Persistenzlänge... 64 7.3.3 Bruchmoment... 65 7.4 Vergleich mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen... 67 8 Ausblick 71 A Fehlerrechnung 73 B Isolation von Tubulin 75 C Isolation von Axonemen 79 D Programm zur Auswertung der Biegesteifigkeitsmessungen 83 viii
E Firmen- und Herstellerverzeichnis 93 F Abkürzungsverzeichnis 97 Literaturverzeichnis 99 Eigene Veröffentlichungen 105 Lebenslauf 107 ix