Springer-Lehrbuch
Ulrich Kück (Hrsg.) Praktikum der Molekulargenetik unter der Mitarbeit von A. Bunse, H. Holländer-Czytko, S. Jeske, C. Klämbt, R. Klapper, I. Kubigsteltig, F. Meinhardt, J. Nickelsen, M. Nowrousian, S. Pollmann, S. Pöggeler, T. Strasser, E. Weiler, G. Wolff, K. Wolff Mit 83 Abbildungen und 40 Tabellen ABC
Professor Dr. ULRICH KÜCK Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik ND 7/131 Süd Fakultät für Biologie E-mail: ulrich.kueck@ruhr-uni-bochum.de ISBN 3-540-21166-7 Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über <http://dnb.ddb.de> abrufbar. Dieses Werk ist urheberrechtlich geschützt. Die dadurch begründeten Rechte, insbesondere die der Übersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der Vervielfältigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben auch bei nur auszugsweiser Verwertung vorbehalten. Eine Vervielfältigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland vom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulässig. Sie ist grundsätzlich vergütungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer ist ein Unternehmen von Springer Science+Business Media springer.de Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2005 Printed in Germany Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dass solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürften. Produkthaftung: Für Angaben über Dosierungsanweisungen und Applikationsformen kann vom Verlag keine Gewähr übernommen werden. Derartige Angaben müssen vom jeweiligen Anwender im Einzelfall anhand anderer Literaturstellen auf ihre Richtigkeit überprüft werden. Satz: Druckfertige Vorlagen G. und K. Wolff Einbandgestaltung: deblik Berlin Titelbilder: Arabidopsis thaliana (links); Sordaria macrospora: Meiosporen (rechts) 29/3150WI - 5 4 3 2 1 0 - Gedruckt auf säurefreiem Papier
Vorwort Die molekulare Genetik ist heute fester Bestandteil einer modernen universitären Ausbildung in den Biowissenschaften. Ihre Entwicklungen und Erfolge bei der Beantwortung aktueller Fragen der Lebenswissenschaften sind eng mit dem Einsatz genetischer Modellorganismen verknüpft. Das Praktikum der Molekulargenetik stellt beispielhaft molekulargenetische Experimente mit pro- und eukaryotischen Modellorganismen dar, bei denen konventionelle und molekulare Methoden zur Anwendung kommen. Die Verbindung von Lehrbuchtext und Experimentalanleitungen bietet eine Einführung in die Grundlagen der pro- und eukaryotischen Genetik für Studierende des Grund- und Hauptstudiums verschiedener Fachrichtungen. Neben der Biologie zählen hierzu die Fächer Biochemie, Biotechnologie, Medizin sowie Geo-, Agrar- und Ernährungswissenschaften. Dieses Praktikumsbuch ist zum Aufbau eines Experimentalkurses im Diplom- bzw. Bachelor-/Masterstudiengang gut geeignet, da die Mehrheit der molekulargenetischen Experimente mit vertretbarem Aufwand innerhalb eines modular aufgebauten Studienganges etabliert werden kann. Bei der Konzeption des Buches wurden besonders geeignete Modellorganismen ausgewählt, an denen die hier beschriebenen molekulargenetischen Techniken optimal dargestellt werden können. Das Spektrum reicht von den Bakterien Escherichia coli und Bacillus subtilis, über die Pilze Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa und Sordaria macrospora, die Alge Chlamydomonas reinhardtii, die höhere Pflanze Arabidopsis thaliana bis zur Taufliege Drosophila melanogaster. Um den Bezug zu den verschiedenen Modellorganismen zu erleichtern, wurden Abbildungen und Tabellen durchgängig dreistufig nummeriert. Einführend wird die Biologie der Experimentalorganismen behandelt und durch formalgenetische Experimente ergänzt. In den anschließenden Kapiteln werden folgende Themen behandelt: DNA-Transformation zur Herstellung und Analyse transgener Organismen, PCR- und RNA-Analytik, Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen, heterologe Genexpression, Einsatz von Reportergenen und Bioinformatik sowie eine Auswahl von Standardmetho-
VI Vorwort den der Molekulargenetik. Das Buch schließt mit einem Glossar, Angaben zu weiterführender Literatur und Internetadressen zu Bezugsquellen und relevanten Sachthemen. Die Realisierung dieses Buchprojektes war nur durch die Mithilfe vieler Personen möglich. Wir bedanken uns bei all denen, die zum Gelingen des Buches beigetragen haben, besonders bei E. Jung, G. Frenßen-Schenkel, E. Szczypka und E. Köster sowie bei B. Bongartz, I. Engh, S. Glanz, B. Hoff, J. Kamerewerd, B. Klinkert, K. Kopke, S. Mayrhofer, N. Nolting, C. Rattay und C. Rech für die technische Umsetzung des Textes und der Abbildungen. Insbesondere danken wir auch den Mitarbeitern des Springer-Verlages, Frau I. Lasch-Petersmann und Frau E. Werner für die redaktionelle Betreuung sowie Herrn K.-H. Winter für die Unterstützung bei der Erstellung des Layouts. Bochum, im Juli 2004 Die Autoren
Autoren Dr. Astrid Bunse (Kap. 5.1, 6) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik derzeitige Adresse: QIAGEN GmbH, QIAGEN Straße 1, 40724 Hilden astrid.bunse@qiagen.com Dr. Heike Holländer-Czytko (Kap. 2.5) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie heike.holländer-czytko@ruhr-uni-bochum.de Prof. Dr. Christian Klämbt (Kap. 1.7, 2.6, 3.6, 4.5.3, 5.2, 8.4, 8.5) Dr. Robert Klapper Dr. Thomas Strasser Institut für Neuro- und Verhaltensbiologie Westfälische Wilhelms-Universität Münster Badestraße 9 48149 Münster klaembt@uni-muenster.de
VIII Autoren Dr. Ines Kubigsteltig (Kap. 3.5, 4.5.2, 8.3) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie ines.kubigsteltig@ruhr-uni-bochum.de Prof. Dr. Ulrich Kück (Kap. 1.4, 2.3, 8.1, 10) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik ulrich.kueck@ruhr-uni-bochum.de Prof. Dr. Friedhelm Meinhardt (Kap. 1.1, 1.2, 2.1, 3.1) Dipl.-Biol. Stefanie Jeske Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie Westfälische Wilhelms-Universität Münster Correnstr. 3 48149 Münster meinhar@uni-muenster.de HD Dr. Jörg Nickelsen (Kap. 1.5, 2.4, 3.4) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik joerg.nickelsen@ruhr-uni-bochum.de Dr. Minou Nowrousian (Kap. 4.1 4.4, 4.5.1, 4.5.4, 9) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik minou.nowrousian@ruhr-uni-bochum.de
Autoren IX HD Dr. Stefanie Pöggeler (Kap. 1.3, 2.2, 3.2, 3.3, 7, 8.1, 8.2) Lehrstuhl für Allgemeine und Molekulare Botanik stefanie.poeggeler@ruhr-uni-bochum.de Dr. Stephan Pollmann (Kap. 8.3) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie stephan.pollmann@ruhr-uni-bochum.de Prof. Dr. Elmar Weiler (Kap. 1.6) Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie elmar.weiler@ruhr-uni-bochum.de Dr. Gabriele Wolff (Copyediting) Dipl.-Math. Kai Wolff Oesterstraße 9 44309 Dortmund gabriele.wolff@ruhr-uni-bochum.de
Inhalt 1 Modellorganismen....................................... 1 1.1 Escherichia coli....................................... 1 1.1.1 Historisches...................................... 3 1.1.2 Lebenszyklus..................................... 6 1.1.3 Technische Entwicklungen.......................... 8 1.1.4 Biologische Fragestellungen......................... 15 1.1.5 Genetische Ressourcen............................. 15 1.2 Bacillus subtilis...................................... 17 1.2.1 Historisches..................................... 18 1.2.2 Lebenszyklus.................................... 19 1.2.3 Technische Entwicklungen......................... 20 1.2.4 Biologische Fragestellungen......................... 23 1.2.5 Genetische Ressourcen............................. 24 1.3 Saccharomyces cerevisiae............................... 25 1.3.1 Historisches..................................... 26 1.3.2 Lebenszyklus.................................... 28 1.3.3 Technische Entwicklungen......................... 30 1.3.4 Biologische Fragestellungen......................... 41 1.3.5 Genetische Ressourcen............................. 42 1.4 Neurospora crassa und Sordaria macrospora................. 43 1.4.1 Historisches..................................... 44 1.4.2 Lebenszyklus.................................... 46 1.4.3 Technische Entwicklungen......................... 49 1.4.4 Biologische Fragestellungen......................... 52 1.4.5 Genetische Ressourcen............................. 53 1.5 Chlamydomonas reinhardtii............................ 55 1.5.1 Historisches..................................... 55 1.5.2 Lebenszyklus.................................... 57 1.5.3 Technische Entwicklungen......................... 58 1.5.4 Biologische Fragestellungen......................... 64
XII Inhalt 1.5.5 Genetische Ressourcen............................. 65 1.6 Arabidopsis thaliana.................................. 66 1.6.1 Historisches..................................... 66 1.6.2 Lebenszyklus.................................... 68 1.6.3 Technische Entwicklungen......................... 70 1.6.4 Biologische Fragestellungen......................... 72 1.6.5 Genetische Ressourcen............................. 75 1.7 Drosophila melanogaster............................... 75 1.7.1 Historisches..................................... 76 1.7.2 Lebenszyklus.................................... 78 1.7.3 Technische Entwicklungen......................... 84 1.7.4. Biologische Fragestellungen......................... 86 1.7.5 Genetische Ressourcen............................. 86 2 Genetische Kreuzungen.................................. 89 2.1 Escherichia coli...................................... 90 2.1.1 Konjugation von E. coli............................ 92 2.2 Saccharomyces cerevisiae............................... 95 2.2.1 Zufallssporenanalyse bei S. cerevisiae.................. 98 2.3 Neurospora crassa und Sordaria macrospora................ 102 2.3.1 Einfaktorkreuzung mit Farbspormutanten............. 105 2.3.2 Kopplungsanalyse mit transgenen Stämmen........... 108 2.4 Chlamydomonas reinhardtii........................... 111 2.4.1 Tetradenanalyse................................. 113 2.5 Arabidopsis thaliana................................. 116 2.5.1 Kreuzung von Arabidopsis......................... 117 2.5.2 Kartierung mit CAPS-Markern..................... 119 2.6 Drosophila melanogaster.............................. 124 2.6.1 Balancer-Chromosomen.......................... 127 2.6.2 Fliegenzucht................................... 128 2.6.3 Genetische Kreuzungen mit Drosophila............... 132 3 DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen.......................................... 141 3.1 Escherichia coli und Bacillus subtilis..................... 142 3.1.1 Transformation von E. coli nach der Calciumchlorid- Methode...................................... 145 3.1.2 Natürliche Kompetenz von B. subtilis................ 148 3.1.3 Transformation von B. subtilis durch Elektroporation.... 151
Inhalt XIII 3.1.4 Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien............. 153 3.1.5 Isolation von chromosomaler DNA aus Bacillus subtilis... 157 3.2 Saccharomyces cerevisiae.............................. 158 3.2.1 Transformation von S. cerevisiae mit der Gefriermethode.. 166 3.2.2 Transformation von S. cerevisiae durch Elektroporation... 171 3.2.3 Isolierung von Gesamt-DNA aus S. cerevisiae zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation........... 172 3.3 Sordaria macrospora................................. 176 3.3.1 Transformation von S. macrospora................... 185 3.3.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Pilz-Stämmen zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation........... 188 3.4 Chlamydomonas reinhardtii........................... 193 3.4.1 Kerntransformation.............................. 198 3.4.2 Chloroplastentransformation....................... 199 3.4.3 Isolierung von Gesamt-DNA....................... 201 3.5 Arabidopsis thaliana................................. 203 3.5.1 Herstellung stabil transformierter Linien.............. 205 3.5.2 Isolierung von genomischer DNA................... 211 3.5.3 Transiente Transformation steril angezogener Keimlinge.. 212 3.6 Drosophila melanogaster.............................. 215 3.6.1 Nachweis eines markierten P-Elements............... 216 3.6.2 Genetische Kartierung einer P-Element-Insertion....... 218 3.6.3 Isolierung genomischer DNA aus Drosophila........... 219 4 PCR-Analytik........................................ 221 4.1 Das Prinzip der PCR................................ 221 4.2 Bedeutung der PCR................................ 224 4.3 Polymerasen für die PCR............................. 224 4.4 PCR-Varianten.................................... 225 4.4.1 Nested PCR, lineare PCR, RAPD-PCR............... 225 4.4.2 Die RT (reverse Transkription)-PCR................. 226 4.4.3 Die Real-Time-PCR.............................. 226 4.5 Experimentalteil................................... 228 4.5.1 PCR-Analyse von transgenen Pilz-Stämmen........... 229 4.5.2 PCR zum Integrationsnachweis eines Transgens in Arabidopsis thaliana.............................. 235 4.5.3 Inverse PCR zur molekularen Kartierung einer P-Element- Insertion bei Drosophila........................... 236 4.5.4 Nachweis eines Transkriptes mittels RT-PCR........... 241
XIV Inhalt 5 RNA-Analytik........................................ 247 5.1 Transkriptanalysen.................................. 247 5.1.1 RNA-Prozessierung bei C. reinhardtii................ 248 5.1.2 RNA-Isolierung................................. 250 5.1.3 RNA-Gelelektrophorese und Northern Blot........... 254 5.1.4 Radioaktive Markierung eines Oligonukleotids und Hybridisierung mit filtergebundener RNA............ 258 5.2 In-situ-Hybridisierungen an Drosophila-Embryonen........ 260 6 Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen............. 265 6.1 In-vivo-Analysen................................... 265 6.1.1 Hefe-HYBRID-Analysen.......................... 266 6.1.2 Die Wechselwirkung eines Tran skriptionsfaktors mit einem Promotorelement................................ 272 6.1.3 ONE-HYBRID-Analysen durch Selektion von Hefe- Transformanten auf Histidin-Prototrophie............. 273 6.1.4 ONE-HYBRID-Analysen mit Hilfe von LacZ-Tests ausgewählter Hefe-Transformanten.................. 274 6.2 In-vitro-Analysen................................... 276 6.2.1 Nachweis einer Interaktion durch Gelretentionsanalysen.. 278 6.2.2 Herstellung von Hefe-Proteinextrakt für Bindungsanalysen 280 6.2.3 Herstellung einer radioaktiv markierten Ziel-DNA (bait). 283 6.2.5 Gelretentionsanalyse............................. 286 7 Heterologe Genexpression............................... 291 7.1 Escherichia coli..................................... 292 7.1.1 Strategien zur Optimierung der Expression in E. coli..... 292 7.1.2 Heterologe Synthese eukaryotischer Proteine in E. coli.... 300 7.2 Saccharomyces cerevisiae.............................. 311 7.2.1 Strategien zur Optimierung der Expression in S. cerevisiae. 312 7.2.2 Heterologe Genexpression in S. cerevisiae und Isolierung Virus-ähnlicher Partikel........................... 317 8 Reportergene......................................... 323 8.1 Häufig verwendete Reportergene....................... 323 8.1.1 -Galactosidase................................. 324 8.1.2 -Glucuronidase (GUS)........................... 324 8.1.3 Das grün fluoreszierende Protein (GFP)............... 325 8.2 Expression des egfp-gens in Hyphenpilzen............... 327
Inhalt XV 8.2.1 Nachweis der GFP-Fluoreszenz in Sordaria macrospora... 328 8.3 Nachweis der -Glucuronidase-Aktivität in Arabidopsis thaliana.......................................... 332 8.3.1 Histochemischer GUS-Test........................ 333 8.3.2 Photometrischer GUS-Test........................ 335 8.4 X-Gal-Färbungen zur Detektion von Enhancer-trap- Insertionen in Drosophila............................. 337 8.4.1 Nachweis der -Galactosidase-Expression im Embryo.... 339 8.4.2 Nachweis der -Galactosidase-Expression in Imaginalscheiben................................ 341 8.4.3 Nachweis der -Galactosidase-Expression durch eine Antikörperfärbung............................... 342 8.5 Ektopische Expression von Genen in Drosophila melanogaster. 344 8.5.1 Experimentalstrategien zur Funktionsanalyse von Drosophila-Genen............................... 344 8.5.2 Überexpression und ektopische Expression eines Transgens 347 9 Bioinformatik........................................ 349 9.1 Homologie-Suche in Datenbanken..................... 351 9.1.1 Der BLAST-Algorithmus.......................... 353 9.1.2 Die Signifikanz von Alignments..................... 355 9.1.3 Wichtige Parameter für die Datenbanksuche........... 356 9.1.4 Beispiele zur Datenbanksuche...................... 358 9.2 EST- und Gesamtgenom-Datenbanken.................. 358 9.2.1 ESTs (expressed sequence tags)....................... 358 9.2.2 Beispiele zu ESTs................................ 359 9.2.3 Gesamt-Genom-Sequenzen am Beispiel von Neurospora crassa......................................... 360 9.2.4 Beispiele zu Arbeiten mit einer Gesamtgenomdatenbank.. 361 9.2.5 Beispiele zur Intron-Identifikation mit Hilfe von ESTs und Gesamtgenomdatenbanken........................ 363 9.3 Unbekannte Sequenz Was tun?...................... 365 9.4 Phylogenie-Analysen................................ 367 9.4.1 Grundlagen der Stammbaum-Analyse................ 368 9.4.2 Vorgehen bei der Erstellung eines Stammbaumes........ 370 9.4.3 Beispiele zur Phylogenie-Analyse.................... 371 10 Grundtechniken der molekularen Genetik.................. 375 10.1 Phenolisieren von DNA............................. 375
XVI Inhalt 10.2 Fällungen von Nukleinsäuren......................... 376 10.3 Extraktion von DNA aus Agarose gelen.................. 378 10.3.1 Phenolextraktion aus Agarose gelen.................. 378 10.3.2 Freeze-and-squeeze-Methode........................ 379 10.4 Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese............... 380 10.5 Southern Blot..................................... 382 10.6 Markierung von Nukleinsäuren........................ 383 10.6.1 Oligo-primed-labelling-Technik..................... 384 10.6.2 5 -Markierung von Oligonukleotiden................ 385 10.7 DNA-DNA-Hybridisierung.......................... 386 Referenzen................................................ 389 Literatur............................................... 389 Internetadressen......................................... 396 Hersteller und Bezugsquellen............................. 396 Stammsammlungen.................................... 397 Internetportale, Datenbanken und Programme................ 397 Glossar................................................... 401 Abkürzungen und Symbole................................... 411 Sachverzeichnis............................................ 413