BEISPIEL-Ergebnisblatt (November 2014)

BEISPIEL-Ergebnisblatt (November 2014) Bestimmung des Absorptionskoeffizient von 2-Nitrophenol unter den gegebenen Bedingungen 1. Stoffmenge ONPG in 200 µl ONPG-Lösung (0,05 M): n = 10 µmol 2. Stoffmenge Nitrophenol bei vollständigem Umsatz: n = 10 µmol 3. Gesamtvolumen des Ansatzes (ohne Berücksichtigung des Na2CO3): V = 2000 µl 4. Stoffmengenkonzentration an Nitrophenol: c = 0,005 µmol/µl 5a. Gemessene (gemittelte) Absorbanz bei 405 nm: A = 0,698 5b) Multiplikation von A mit Verdünungsfaktor F = 20 (F = 10 bis 20) AØ, rechnerisch = 13,96 6. Berechnen des Absorptionskoeffizienten (4., 5. => Lactaseaktivität e = A d c ): ε = 2792 µl µmol cm 7. Durchschnittliche Masse an Lactasepräparat in der Kapsel: m1 = 510000 µg 8. Masse Lactase in 100 µl Enzymlösung (Verdünnungen berücksichtigen!): m2 = 1,7 µg 9. Verdünnungsfaktor (7., 8. => F = m1/m2): F = 300000 10. Gesamtvolumen der Ansätze (ohne Berücksichtigung des Na2CO3): V = 2000 µl 11. Gemessene gemittelte Absorbanz bei 405 nm: AØ = 0,8156 12. Berechnung der Nitrophenolkonzentration (6., 11. => ): c = 0,0002924 µmol/µl A c = d e 13. Berechnung der gebildeten Nitrophenolstoffmenge (10., 12.) n = 0,585 µmol 14. ochrechnung der Nitrophenolmenge im gesamten Kapselinhalt (9., 13. =>) n = 175465 µmol 15. erunterrechnung von 10 Minuten auf 1 Minute Rkt.zeit (14.=> Dreisatz) n = 11698 µmol => Enzymaktivität in FCC-Units pro Kapsel (= 15.!) E-Aktivität = 11700 FCC-U (nominell: 12000 U), das Ergebnis ist also durchaus realistisch

Datum: Biologielaboranten Name: ggf. Laborpartner: Carl-Engler-Schule Karlsruhe Gesamtnote: Bestimmung der Lactase-Aktivität und enzymatische Bestimmung von Lactose Grundlagen Lactose (Milchzucker) gehört zu den Disacchariden und ist in großen Mengen in Milchprodukten zu finden. Der Zucker kann nicht als Disaccharid im Darm resorbiert werden, sondern muss vor der Resorption mithilfe des Enzyms Lactase in D-Glucose und D-Galactose gespalten werden. O O O O O O O O Lactose O O O + O 2 Lactase O O O O O O D-Galactose + O O O O O O D-Glucose Beide Monosaccharide (D-Glucose und D-Galactose) können anschließend von den Darmzellen problemlos resorbiert werden. Viele Erwachsene besitzen nicht genügend Lactase um die aufgenommene Lactose zu spalten. Es resultiert eine Lactoseintoleranz: Beim Verzehr von Milchprodukten kann es zu Blähungen und Durchfällen kommen, da die unverdaute Lactose durch Darmbakterien vergoren wird. Damit diese Personen nicht auf Milchspeisen verzichten müssen, gibt es als Nahrungsergänzungsmittel Lactase -Kapseln, die mit der Milchspeise eingenommen werden. Die hierfür benutzte Lactase wird aus lebensmitteltechnisch zugelassenen Bakterien- oder Pilzkulturen isoliert. Streng genommen wird nur das Säugetierenzym Lactase genannt, alle anderen Enzyme mit gleicher Funktion, die jedoch anderen Ursprungs sind, werden unter dem Begriff β- Galactosidase zusammengefasst. Lactase -Kapseln enthalten also eigentlich β-galactosidase. Die Enzymaktivität ist ein Maß dafür, wie schnell eine Enzymportion die Substrate zu Produkten umsetzt, sie entspricht also der Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion. Die Enzymaktivität hängt dabei nicht nur von der Stoffmenge an Enzym ab, sondern auch von der Versorgung mit Substrat, Temperatur, p-wert etc. Für die Bestimmung der Lactase-Aktivität im Labor wird statt des natürlichen Substrats (Lactose) ein chromogenes Substrat eingesetzt, also ein Substrat, das zu einem Farbstoff umgewandelt wird. O O O O O O NO 2 + 2O Lactase O O O O + O O O NO 2 chromogenes Substrat: ONPG Farbstoff: 2-Nitrophenol Der Farbstoff lässt sich leicht fotometrisch quantifizieren. Je höher die sich bildende Farbstoffmenge, desto höher ist die Enzymaktivität. Die Enzymaktivität wird in Form von Enzymeinheiten angegeben. Eine gängige Einheit für die Enzymaktivität bei Lactase ist folgendermaßen definiert: Saure Lactase-Einheiten (FCC Acid Lactase units): One FCC Acid Lactase Unit (ALU) is defined as the quantity of enzyme that will liberate one micromole of o-nitrophenol per minute at 37 C and a p of 4.5. It is based on a 15 -minute hydrolysis of an o-nitrophenol-beta-d-galactopyranoside substrate. Durch Aufnahme eines Lineweaver-Burk-Diagramms kann die Michaeliskonstante der Lactase bzgl. des Substrats ONPG ermittelt werden.

Durchführung Bestimmung des Lactase-Aktivität von Lactase-Kapseln Materialien: Essigsäure, NaO oder NaO-Lsg., Lactasekapseln (nominal: 12000 FCC-U), Na2CO3 10 2O, Reagenzgläser, Fotometer, Mikroliterpipetten + Spitzen, Vortexer Puffer: Evtl. schon vorhanden. Lehrer fragen! Falls nötig: Stellen Sie aus Essigsäure und NaO(-Lsg) oder Natriumacetat 0,1-molaren Puffer mit p 4,5 her. Pro Zweiergruppe werden 100 ml Puffer benötigt. erstellung der ONPG-Lösung: Stellen Sie aus ONPG und dem Puffern als Lösungsmitteln 50 ml ONPG- Lösung (0,05 M) her. Pro Zweiergruppe werden maximal 3 ml benötigt. M(ONPG) = 301,2 g/mol. Die 50 ml reichen also für die gesamte Klasse. erstellung des Enzymkonzentrats und der Enzymlösung: Der durchschnittliche (!) Inhalt einer Lactasekapsel (gemischt und gemittelt aus 4-5 Lactasekapseln) wird in einem großen Erlenmeyerkolben auf ca. 1000 ml 2O suspendiert und gut gemischt (Enzymkonzentrat). 5 ml des Enzymkonzentrats/Suspension werden in einem 150 ml-erlenmeyerkolben auf 150 ml mit 2O verdünnt (d.h. Verdünnungsfaktor F = 30, Enzymlösung Das Enzymkonzentrat und die Enzymlösung reichen für die gesamte Klasse und werden auf Eis gekühlt gelagert. Na2CO3-Lösung: Aus Soda ist eine Lösung mit w(na2co3 10 2O) = 15% herzustellen. 250 300 g reichen für die gesamte Klasse. Weitere Aufgaben (jeweils für 2er-Gruppen): Aus dem Biolabor und ggf. anschließen. 2 Wasserbäder (37 C), für alle Zweiergruppe Mikroliterpripettern und Spitzen holen; alle Fotometer holen, 1. Bestimmung der Enzymaktivität in einer durchschnittlichen Lactase-Kapsel Pipettierschema und Messung: In Reagenzgläser oder Zentrifugengläser werden in folgender Reihenfolge pipettiert. Es wird eine Doppelbestimmung durchgeführt. + 1700 µl des Puffers + 200 µl ONPG-Lösung ca. 5 Minuten im Wasserbad (37 C) inkubieren + 100 µl Enzymlösung. Zeitmessung starten. nach genau 15 Minuten im Wasserbad (37 C): + 1000 µl Na2CO3-Lösung [zum Abstoppen der enzym. Reaktion] Absorbanz bei 405 nm messen. Referenz: Wasser 2. Bestimmung des Absorptionskoeffizient von 2-Nitrophenol unter den gegebenen Bedingungen Es wird eine Doppelbestimmung durchgeführt. + 1700 µl des Puffers + 200 µl ONPG-Lösung ca. 5 Minuten im Wasserbad (37 C) inkubieren. Wenn kein Platz: Trockenschrank nutzen + 100 µl Enzym-Konzentrat!. nach ca. 60 Minuten im Wasserbad: + 1000 µl Na2CO3-Lösung [zum Abstoppen der enzym. Reaktion] Mit Faktor 10 20 verdünnen. Dann Absorbanz bei 405 nm messen. Referenz: Wasser

3. Substratsättigungskurve und Lineweaver-Burk-Diagramm In Reagenzgläsern oder Zentrifugengläsern pipettieren: Bezeichnung: Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6 Nr. 7 Nr. 8 Nr. 9 Puffer [µl] 2300 2300 2300 2300 2300 2300 2300 2300 2300 ONPG-Lsg. [µl] 5 10 15 20 30 50 60 80 100 2O [µl] 95 90 85 80 70 50 40 20 0 Vortexen. ca. 5 Minuten im Wasserbad inkubieren. Danach leicht zeitversetzt fortfahren! Enzymlsg. [µl] 100 100 100 100 100 100 100 100 100 sofort vortexen. Nach genau 10 Minuten im Wasserbad sofort abstoppen und vortexen Na2CO3 (15%) [µl]: 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 Absorbanz (405 nm) Substratsättigungskurve und Lineweaver-Burk-Diagramms Die Auswertung erfolgt digital! Substratsättigungskurve: Tragen Sie die Absorbanzen (y-achse) gegen die ONPG-Volumina (x-achse) auf. Lineweaver-Burk-Diagramm: Tragen Sie die reziproken Absorbanzen (y-achse) gegen die reziproken ONPG- Volumina (x-achse, in ml -1 ) auf. Ermitteln Sie aus diesen Daten vmax zuerst als Absorbanz. Mithilfe von εspez, dem Lösungsvolumen (ohne Berücksichtigung von Na2CO3) und der Reaktionszeit können Sie vmax in µmol pro Minute (= units), umrechnen (siehe Auswerteblatt). Ermitteln Sie aus dem Diagramm den KM-Wert zuerst in µl. Dieser Wert kann dann in µmol/l umgerechnet werden. 1/A (Einheit: -) 1/ONPG-Lsg. (Einheit: 1/mL)

Ergebnisblatt und Auswertung (dem Protokoll beizulegen) Bestimmung des Absorptionskoeffizient von 2-Nitrophenol unter den gegebenen Bedingungen 1. Stoffmenge ONPG in 200 µl ONPG-Lösung (0,05 M): n = µmol 2. Stoffmenge Nitrophenol bei vollständigem Umsatz: n = µmol 3. Gesamtvolumen des Ansatzes (ohne Berücksichtigung des Na2CO3): V = 2000 µl 4. Stoffmengenkonzentration an Nitrophenol (ohne Na2CO3): c = µmol/µl 5a). Gemessene (evtl.) gemittelte Absorbanz bei 405 nm: AØ, gemessen = 5b) Multiplikation von A mit Verdünnungsfaktor F = (F = 10 bis 20) AØ, rechnerisch = 6. Berechnen des Absorptionskoeffizienten (4., 5b. => e = A ): ε = µl d c µmol cm Lactaseaktivität 7. Durchschnittliche Masse an Lactasepräparat in der Kapsel: m1 = µg 8. Masse Lactase in 100 µl Enzymlösung (Verdünnungen berücksichtigen!): m2 = µg 9. Verdünnungsfaktor (7., 8. => F = m1/m2): F = 10. Gesamtvolumen der Ansätze (ohne Berücksichtigung des Na2CO3): V = 2000 µl 11. Gemessene gemittelte Absorbanz bei 405 nm: AØ = 12. Berechnung der Nitrophenolkonzentration (6., 11. => A c = ): c = µmol/µl d e 13. Berechnung der gebildeten Nitrophenolstoffmenge (10., 12.) n = µmol 14. ochrechnung der Nitrophenolmenge im gesamten Kapselinhalt (9., 13. =>) n = µmol 15. erunterrechnung von 15 Minuten auf 1 Minute Rkt.zeit (14.=> Dreisatz) n = µmol => Enzymaktivität in FCC-Units pro Kapsel (= 15.!) E-Aktivität = FCC-U

Linewaver-Burk-Diagramm Bezeichnung: Nr. 1 Nr. 2 Nr. 3 Nr. 4 Nr. 5 Nr. 6 Nr. 7 Nr. 8 Nr. 9 gemessene Absorbanz Absorbanz -1 ONPG-Volumen in µl 5 10 15 20 30 50 60 80 100 ONPG-Volumen in ml (ONPG-Vol.) -1 in ml -1 => Kalibriergerade erstellen (Absorbanz) -1 = y-achse. (ONPG-Volumen in ml) -1 = x-achse 16. vmax 1 (aus Diagramm ablesen) vmax -1 = 17. vmax als Absorbanz (Kehrwert bilden) vmax = A = 18. vmax in µmol/µl (6., 17. aus Abs. die Konz (c) berechnen) vmax = c = (in 10 Minuten) 19. vmax in µmol (Volumen berücksichtigen, ohne Na2CO3-Vol.) vmax = (in 10 Minuten) 20. vmax in µmol/min (von 10 Minuten auf 1 Minute runterrechnen) vmax = µmol/min (= units) 21. KM -1 (aus Diagramm ablesen, in ml -1 ) KM -1 = V -1 ml -1 22. KM in ml (Kehrwert bilden und in Mikroliter umrechnen) KM = V = µl 23. Vorhandene Stoffmenge ONPG am K M-Wert, n(onpg) n(onpg) = µmol 24. KM in µmol/ml (Gesamtvolumen in ml berücksichtigen, ohne Na2CO3) KM = [S] = µmol/ml