Mustervorschrift Versuch

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1 Mustervorschrift Versuch N-Acetylierung von D-/L- Methionin (1.Stufe) 5.20 g (34.86 mmol) D-/L- Methionin (racemisch) werden in g (48.80 ml, 349 mmol) reiner Essigsäure (Eisessig) gelöst 1. Zu der so hergestellten klaren Lösung werden 7.42 g (6.87 ml, mmol) Essigsäureanhydrid gegeben. Bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch weitere 2.5 h gerührt 2. Das Reaktionsgemisch wird am Rotationsverdampfer eingeengt. Das erhaltene gelbe Öl wird anschließend mit 5.00 g Wasser versetzt und zur Kristallisation im Kühlschrank stehen gelassen 3. Die Kristalle werden über einer Fritte abgesaugt, mit 10 ml kaltem Wasser, mit 5 ml kaltem Diethylether gewaschen und im Exsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet 4. Die Ausbeute beträgt %. Enzymtest (Schnelltest) Für den Einsatz von Enzymen im Praktikumsversuch ist es wünschenswert, kurz vor dem Gebrauch des Enzyms dessen prinzipielle Aktivität ohne großen Aufwand zu testen. Bei der Entwicklung eines Schnelltest für die Aminoacylase bot sich die Markierung des freien L-Methionins als aussichtsreiche Möglichkeit an. Bei der Analyse der N-terminalen Aminosäure von Peptidsequenzen kann man diese gezielt durch fluoreszierende Reagenzien wie Dabsylchlorid, Dansylchlorid etc. markieren und identifizieren. Dieses Prinzip, die freie Aminogruppe des deacylierten L-Methionins als Indikator für die Aktivität der Aminoacylase zu markieren, bot sich als gute Möglichkeit für einen Schnelltest an, da sich die derivatisierte Aminosäure mittels Dünnschichtchromatographie analysieren lässt. Das N-acyl-D/L-Methionin- Racemat kann dabei keine Reaktion mit dem Markierungsreagenz eingehen, da es keine freie Aminogruppe besitzt. Die folgenden Lösungen werden benötigt: 1. Substrat-Lösung (0.1M N-acyl-D/L-Methionin) i) Lösen von 0.48g N-acyl-D/L-Methionin in 10ml Wasser und 2ml 1M NaOH ii) Der ph-wert wird mit 1/10N NaOH auf ph=8 eingestellt. iii) Mit Wasser auf 25 ml verdünnen M Phosphat-Puffer, ph=8 i) 14.2 g di-natriumhydrogenphosphat in 1000 ml Wasser lösen ii) mit NaOH auf ph=8 einstellen 1 Damit sich alles löst kann der Ansatz unter Rühren langsam auf bis zu 80 C erwärmt werden. 2 Zur Reaktionsvervollständigung wird der Ansatz über Nacht stehen gelassen. 3 Die Kristallisation kann unter Umständen einige Tage dauern; dazu können verschiedene Methoden, wie Kratzen an Glaswand oder Kristallisationskeime verwendet werden. 4 Die Kristalle sollten rein weis sein und können bei Bedarf in wenig Wasser umkristallisiert werden. Ebenfalls bietet sich Ethylacetat zum Waschen der Kristalle an.

2 mm Cobalt-(II)-Chlorid i) 118 mg CoCl 2 6H 2 O zu 1 ml Lösung mit Wasser auffüllen 4. Enzym-Lösung i) 0.50 g Enzym in wenig Wasser lösen ii) Auf 500ml Wasser auffüllen iii) 5 ml dieser Lösung nochmals auf 100 ml Lösung verdünnen M NaHCO 3 i) 1.68 g Natriumhydrogencarbonat auf 100 ml Wasser Für den Schnelltest der Reaktivität der Aminoacylase wird die freie Aminogruppe des deacylierten L-Methionins zur Markierung mit Dansylchlorid und somit zum Nachweis der Reaktion genutzt. Hierzu geht man wie folgt vor: 1. Im Reagenzglas werden 2 ml Phosphat-Puffer (ph=8), 1 ml Cobaltchlorid-Lösung und 1 ml Enzymlösung gegeben. 2. Anschließend wird für 5 min bei 37 C gerührt, mit 1 ml Substratlösung versetzt und nach weiterem Rühren bei 37 C nach 30 min eine Probe entnommen. 3. Die entnommene Probe wird 3 min in kochendem Wasser erhitzt (zur Denaturierung des Enzyms). 4. Nach der Denaturierung wird die Probe mit 0,1 ml einer 0,2 M NaHCO 3 -Lösung und 0,05 ml Dansylchlorid-Lösung in Aceton versetzt und 30 min bei 40 C gerührt. Die Probe wird nun zusammen mit einer Referenzlösung des N-acyl-D/L-Methionin- Racemats auf eine DC-Platte aufgebracht. Laufmittel: n-butanol/eisessig/wasser 4/1/1. Enzymtest (Quantitativer Aktivitätstest) Da eine quantitative Aussage über die Aktivität von Enzymen für deren Einsatz in Bezug auf Menge und Reaktionszeit von großem Interesse ist, gilt es neben dem Schnelltest auch noch einen Test zu entwickeln, der ein quantitatives Ergebnis liefert. Die Literaturrecherche lieferte drei von Enzymherstellern angebotenen Aktivitätstest für die Aminoacylase aus Aspergillus mellus, von denen im Rahmen des Praktikums einer als ohne Probleme durchführbar erachtet wurde. Bei allen drei Tests nutzt man die Absorption eines aus zwei Ninhydrineinheiten über in situ hergestellten Ammoniak aus L-Methionin verbrückten, blauvioletten Farbstoffes bei 570 nm aus, um auf die Aktivität zu schließen (siehe Schema 2).

3 Es werden die folgenden Lösungen benötigt 5 : 1. Substrat-Lösung (0.1M N-acyl-D/L-Methionin) i) Lösen von 0.48g N-acyl-D/L-Methionin in 10ml Wasser und 2ml 1M NaOH ii) Der ph-wert wird mit 1/10N NaOH auf ph=8 eingestellt. iii) Mit Wasser auf 25 ml verdünnen 2. Ninhydrin-Lösung i) Lösen von 1.00 g Ninhydrin in 25ml Ethylenglycolmonoethylether ii) 25 ml der Puffer-Lösung (3) zugeben iii) In einer dunklen Flasche aufbewahren 3. Puffer-Lösung, ph=5 i) 21.0 g Zitronensäure in 200 ml 1N NaOH-Lösung ii) Verdünnen mit Wasser auf 500 ml 4. Zinn-(II)-Chlorid-Lösung i) 0.20 g SnCl 2 2H 2 O in 12.4 ml Puffer-Lösung (3) geben. ii) Wichtig: Erst kurz vor Gebrauch herstellen 5. 50% n-propanol-lösung i) Lösung aus 50% n-propanol und 50% Wasser herstellen M Phosphat-Puffer, ph=8 i) 14.2 g di-natriumhydrogenphosphat in 1000 ml Wasser lösen ii) mit NaOH auf ph=8 einstellen mm Cobalt-(II)-Chlorid 5 Die benötigten Lösungen müssen soweit es die Praktikumsausrüstung zulässt so genau wie möglich hergestellt werden. Alle Abweichungen verändern natürlich die ermittelte Aktivität des Enzyms.

4 i) 118 mg CoCl 2 6H 2 O zu 1 ml Lösung mit Wasser auffüllen 8. Enzym-Lösung i) 0.50 g Enzym in wenig Wasser lösen ii) auf 500ml Wasser auffüllen iii) 5 ml dieser Lösung nochmals auf 100 ml Lösung verdünnen Durchführung des Aktivitätstests: 1. In fünf Reagenzgläsern werden jeweils 2 ml Phosphat-Puffer (ph=8), 1 ml Cobaltchlorid-Lösung und 1 ml Enzymlösung gegeben 2. Vier Reagenzgläser werden für 5 min bei 37 C gerührt und anschließend mit 1 ml Substratlösung versetzt und für weitere 30 min 6 bei 37 C gerührt Es werden 0.25 ml in ein weiteres Reagenzglas überführt und 3 min in kochendem Wasser erhitzt (zur Denaturierung des Enzyms) 4. Die Lösung wird anschließend auf Raumtemperatur gekühlt und mit 1 ml Ninhydrin-Lösung und 0.1 ml Zinnchlorid-Lösung versetzt. 5. Um die Farbe zu entwickeln wird das Reaktionsgemisch für 20 min in kochendem Wasser erhitzt 6. Nach dem Abkühlen wird die Lösung mit 20 ml 50% n-propanol verdünnt. 7. Für die Referenzlösung wird aus dem verbliebenen Reagenzglas sofort nach den Versetzen mit 1 ml Substrat-Lösung 0.25 ml in ein anderes Reagenzglas überführt und mit Punkt 3 fortgefahren 8. Es wird jeweils ein Absorptionsspektrum der Lösungen gegen die Referenzlösung gemessen (Maximum bei 570 nm). 8 Berechung der Enzymaktivität 9 Eine unit ist definiert als die Menge an Enzym, die in 30 Minuten ein µmol L- Methionin unter den oben genannten Bedingungen produziert. Acylaseaktivität [units/g]= E a t E Absorption bei 570 nm a Verhältnis von hergestellter Lösung (Punkt 1 und 2) zu entnommener Lösung (Punkt 3). 10 t Enzymreaktionszeit Die Reaktionszeit kann variiert werden und dementsprechend in die unten stehende Formel eingesetzt werden. Allerdings ist die Vorschrift für 30min optimiert und es sollte daher nicht zu sehr von dieser Zeitangabe abgewichen werden. 7 Die Temperatur muss unbedingt konstant gehalten werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten (Thermostat). 8 Sinnvoller Messbereich: 700nm 500nm 9 Auf Grund der zu erwartenden Messungenauigkeiten stellt die berechnete Enzymaktivität nur einen Richtwert dar. Deshalb sollte bei der anschließenden Reaktion zur Sicherheit von einer geringeren Enzymaktivität ausgegangen werden. 10 Standardmäßig ist a=20, da 0.25ml Lösung von 5ml entnommen werden 11 Standardmäßig ist t=30min, kann aber variiert werden

5 Enzymatische Racematspaltung von N-Acetyl-D/L-Methionin (2.Stufe) In einem 25mL Rundkolben mit Rührfisch werden 2.00g N-Acetyl-D/L-Methionin (10.5mmol) in 10mL einer 0.05molaren Phosphatpufferlösung 12, gelöst 13. Dem Ansatz werden 0.01g Cobalt(II)chlorid-Hexahydrat und 25mg Aminoacylase (FLUKA, Aktivität 1-2U/mg) zugegeben und der ph-wert des Reaktionsgemisches unter ständigem Rühren durch vorsichtige Zugabe von gepulvertem NaOH auf ph 8 eingestellt 14. Der Ansatz wird für 7d bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei nach 3-5d das Ausfallen der ersten Kristalle beobachtet werden kann. Nach Beendigung der Reaktion wird die Kristallbildung durch Zugabe von 10mL kaltem Ethanol vervollständigt und für weitere 2h stehengelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert, 3x mit 5mL kaltem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es werden 0.62g (40%) eines farblosen, flockigen Feststoffes erhalten. Dieser kann bei ungenügender Reinheit aus einem Wasser/Ethanolgemisch 15 umkristallisiert werden. Anhang: IR Spektren N-Acteyl-D/L-Methionin g Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat in 50mL Wasser. 13 Zum schnelleren Lösen kann die Mischung im Wasserbad, oder mit einem Fön/Heissluftpistole vorsichtig erhitzt werden. 14 Alternativ kann auch gesättigte Natronlauge verwendet werden. 15 Das Rohprodukt wird zunächst in sehr wenig Wasser gegeben, auf ca. 80 C erhitzt und durch tropfenweise Zugabe von Ethanol durch den Rückflusskühler zum vollständigen Lösen gebracht.

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