Algorithmus zur Diagnostik gastrointestinaler Infekte. Labor Dr. Mustafa, Dr. Richter OG Salzburg, Austria

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1 Algorithmus zur Diagnostik gastrointestinaler Infekte Labor Dr. Mustafa, Dr. Richter OG Salzburg, Austria

2 Diarrhea Passage of three or more loose or liquid stools per day Individuals with fever,bloody or mucoid diarrhea severe abdominal crampings (WHO Definition Infectious Diseases Society of America Infectious Diarrhea Guidelines) Duration of diarrheal diseases Acute diarrhoea Diarrhoea lasts several hours to days (up to 13 days) Persistent diarrhoeas any diarrhoeas with a duration > 14 days Prolonged diarrhoea no unambigous definition, but sometimes used to describe diarrhoea, that lasts betweem >7 and < 14 days Chronic diarrhoea - no unambigous definition, persisting symptoms > 30 days

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7 Aufgaben des extramuralen Bereich Zusammenhang zwischen Erkrankung und Pathogen herstellen Erregeridentifikation Information an die Gesundheitsbehörden Weitere Ansteckung vermeiden Quelle identifizieren um Ausbruch zu verhindern

8 Aufgaben des Labors Diagnostik aus einer einzigen Stuhlprobe Ausreichende Sensitivität und Spezifität der Testmethode Gezielte Erregerauswahl durch stufenweises Vorgehen unter Berücksichtigung der klinischen Angaben Rasche Befundergebnisse Unterstützung bei der Identifikation einer möglichen Quelle Unterstützung der Gesundheitsbehörden

9 Rasche Befundergebnisse Abschätzung des Erkrankungsverlaufes Geeignete Therapie Wenn notwendig gezielte Antibiose Vermeidung weitere Ausbreitung Unterstützung der Gesundheitsüberwachung

10 Stand 2014

11 Nachweis von pathogenen Erregern aus dem Stuhl 2014/2015 Fallzahl in Deutschland 2015 (W1-30) Fallzahl in Deutschland 2014 (W1-30) Anteil aller gefundenen pathogenen Keime Medilab Salzburg 2014 % der gefundenen Erreger im Kollektiv aller gefundenen pathogenen Keime Campylobacter Salmonellen Shigellen Yersinien nur EHEC (nicht HUS) Enteropathogene E.coli Aeoromonas sp Plesiomonas 3 0 Vibrio ch. Kryptosporidien C.diff

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14 Auswahl der Pathogene für die PCR bei flüssig/blutigen Stuhl Yersinien

15 Auswahl der Pathogene für die PCR bei flüssig/blutigen Stuhl Bei den Erregern Campylobacter species, Salmonella, Shigella wurden positive PCR Ergebnisse kulturell bestätigt und aus epidemiologischen Überlegungen Resistenztestungen durchgeführt. Entreropathogene E. coli wurden durch die AGES bestätigt.

16 Enteric Agar n: nliche Kolonien mit entrum (Bildung urchscheinende Hektoen Enteric Agar Salmonellen: Farblose/grünliche Kolonien mit schwarzem Zentrum (Bildung von H 2 S) Kultur Shigellen: Grünliche, durchscheinende Kolonien Erregernachweis Bakterien PCR akterien: ien (Lactose+, der Salicin+) sch:. 38 Campylobacter sp. Coliforme Bakterien: Gelbe Kolonien (Lactose+, Sucrose + oder Salicin+) Problematisch: Proteus, etc. Salmonella typhimurium Shigella flexneri Einzel PCR/ Multiplex PCR Stufenweises Vorgehen Toxinnachweis Kultur/Elisa Resistenztestung Antigennachweis POC/Elisa Gardia Amöben Cryptosporidien Viren Parasiten Einzel PCR/ Multiplex PCR Einzel PCR/ Multiplex PCR

17 Erregernachweis - Präanalytik Bakterien 3 Stuhlproben 1 Stuhlprobe Kultur PCR Probengewinnung-Probenverarbeitung Erregermenge Vorgeschädigte Erreger ( Therapie) DNA bis zu 5 Tagen nachweisbar Erfasst auch geringe Erregermenge Vorangegangene Therapien spielen keine Rolle POC/Elisa Probengewinnung-Probenverarbeitung Erregermenge Viren RNA bis zu 24h nachweisbar Erfasst auch geringe Erregermenge Probengewinnung-Probenverarbeitung Erregermenge Parasiten DNA bis zu 5 Tagen nachweisbar Erfasst auch geringe Erregermenge

18 Erregernachweis Enteric Agar n: nliche Kolonien mit entrum (Bildung urchscheinende akterien: ien (Lactose+, der Salicin+) sch:. 38 Campylobacter sp. Hektoen Enteric Agar Salmonellen: Farblose/grünliche Kolonien mit schwarzem Zentrum (Bildung von H 2 S) Kultur Shigellen: Grünliche, durchscheinende Kolonien Coliforme Bakterien: Gelbe Kolonien (Lactose+, Sucrose + oder Salicin+) Problematisch: Proteus, etc. Salmonella typhimurium Shigella flexneri Toxinnachweis Kultur/Elisa Resistenztestung Antigennachweis POC/Elisa Bakterien Viren Parasiten PCR Erreger DNA Adhäsionsgene, Virulenzgene, Toxingene Campylobacter sp., Salmonella, Shigella sp. weden kulturell bestätigt und eine Resistenztestung angeschlossen, meldepflchtige Erreger werden aus epidemiologischen Überlegungen an die AGES Weitergeleitet. Erreger DNA/RNA Erreger DNA Unterscheidung zwischen apathogenen und pathogenen Formen möglich

19 Erregernachweis Limit of Detection Enteric Agar n: nliche Kolonien mit entrum (Bildung urchscheinende akterien: ien (Lactose+, der Salicin+) sch:. 38 Campylobacter sp. Hektoen Enteric Agar Salmonellen: Farblose/grünliche Kolonien mit schwarzem Zentrum (Bildung von H 2 S) Kultur Shigellen: Grünliche, durchscheinende Kolonien Coliforme Bakterien: Gelbe Kolonien (Lactose+, Sucrose + oder Salicin+) Problematisch: Proteus, etc. Salmonella typhimurium Toxinnachweis Elisa Shigella flexneri Eine Kolonie- ca Organismen Antigennachweis POC/Elisa Bakterien Viren Parasiten Analytical Inclusivity A variety of BD MAX Enteric Parasite Panel assay target isolates or genomic DNA were included in this study to evaluate the ability of the assay to detect organisms representing a range of geographic diversity. Twenty-two (22) isolates representing the three assay targets were tested, including isolates from public collections and well-characterized clinical isolates. PCRAdditionally, genomic DNA and prepared genomic DNA libraries were also evaluated. Inclusivity testing included 11 isolates of Giardia lamblia and Giardia intestinalis, 10 isolates of Entamoeba histolytica, 1 isolate of Cryptosporidium hominis. The isolates were tested either as target pools containing Einzel two assay PCR targets je each nach or individually Hersteller at 2X the LOD theoretisch for assay in unpreserved bis zu stool matrix. One genomic DNA representative of each BD MAX Enteric Parasite Panel target was included at 2X the LOD einer for the Copie assay. Due möglich to the lack of availability of Cryptosporidium parvum and Cryptosporidium hominis organisms, commercially available genomic DNA libraries prepared from 9 distinct Cryptrosporidium Multiplex parvum isolates PCR were also evaluated. derzeit The assay je nach correctly identified Erreger all of the und materials Testsystem tested. 10Analytical Sensitivity The analytical sensitivity (Limit of Detection or LOD) for the BD MAX Enteric Parasite Panel was determined as follows: Stock organisms were purified and quantified for inclusion in this study. Individual inoculating loops were dipped into each organism preparation and were then transferred to a Sample Buffer Tube, already containing fecal matrix (unpreserved or 10% formalin-fixed) that was pre-determined to be negative for all the targets detected by the BD MAX Enteric Parasite Panel. Each organism was tested with a minimum of 30 replicates per specimen type (unpreserved or 10% formalin-fixed), by a single operator, using 3 different production lots of the BD MAX Enteric Parasite Panel. Analytical sensitivity (LOD), defined Einzel PCR je nach Hersteller theoretisch bis zu einer Copie möglich organisms per loop for 10% formalin-fixed specimens (refer to Table 8). Multiplex PCR copies/ml as the lowest concentration at which greater than 95% of all replicates are expected to test positive with 95% confidence, ranged from 7.41 to organisms per loop for unpreserved specimens and 11.1 to Isolate Table 8: BD MAX Enteric Parasite Panel Limit of Detection Cryptosporidium parvum Giardia lamblia Entamoeba histolytica a SBT: Sample Buffer Tube Specimen Type LOD [Organisms/mL in SBT a (95% CI)] Unpreserved (96.93, ) 10% formalin-fixed (99.3, 263.1) Unpreserved 7.41 (5.25, 10.29) 10% formalin-fixed 11.1 (5.9, 16.3) Unpreserved (11.97, 23.38) 10% formalin-fixed 15.5 (11.0, 21.8)

20 Infektiöse Dosis Campylobacter jejuni Salmonella spp. Shigella spp. Yersinia enterocolitica Plesiomonas shigelloides Vibrio cholerae (O1/O139) Enterotoische E.coli (ETEC) Enteropathogene E.coli (EPEC) Enterohemorrhagische E.coli (EHEC) Enteroinvasive E.coli (EIEC) Norovirus (Genotypus I/II) Rotavirus Giardia lamblia Entamoeba histolytica Cryptosporidium parvum 10 4 cells; in Studie an Freiwilligen 500 cells < 10 3 cells cells organism >10 6 organism >10 6 organism > cells low in children, > cells in adults cells cells 1 10 Virus particles 1 10 Virus particles one or more cysts <10 cysts cyst

21 Infectious Dose????? Contamination Pathogenic capacity of bugs Bad Bug Book Host Handbook of Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Toxine Adhäsine Introduction Food safety is a complex issue that has an impact on all segments of society, from the general public Lysine to government, industry, and academia. The second edition of the Bad Bug Book, published by the Center for Food Safety and Applied Nutrition, of the Food and Drug Administration Virulenzfaktoren (FDA), U.S. Department of Health and Human Services, provides current information about the major known agents that cause foodborne illness. The information provided in this handbook is abbreviated and general in nature, and is intended for practical use. It is not intended to be a comprehensive scientific or clinical reference. Under the laws administered by FDA, a food is adulterated if it contains (1) a poisonous or otherwise harmful substance that is not an inherent natural constituent of the food itself, in an amount that poses a reasonable possibility of injury to health, or (2) a substance that is an inherent natural constituent of the food itself; is not the result of environmental, agricultural, industrial, or other contamination; and is present in an amount that ordinarily renders the food injurious to health. The first includes, for example, a toxin produced by a fungus that has contaminated a food, or a pathogenic bacterium or virus, if the amount present in the food may be injurious to health. An example of the second is the tetrodotoxin that occurs naturally in some organs of some types of pufferfish and that ordinarily will make the fish injurious to health. In either case, foods adulterated with these agents are prohibited from being introduced, or offered for introduction, into interstate commerce.

22 Erregernachweis Dauer bis zum Befundergebnis Kultur Bakterien PCR 2 Tage 3 Stunden Antigennachweis POC Elisa Viren 3 Stunden 20 min 1 Tag Parasiten 1 Tag 3 Stunden

23 Stuhldiagnostik 2017 ( Woche 1 43 ) PCR Kultur POC Campylobacter., Salmonella spp. Shigella spp. Yersinia Plesiomonas Vibrio cholerae ETEC/EAEC/EIEC EPEC VTEC/EHEC Norovirus ( Genotypus I + II ) 1012 Rotavirus (39)** Adenovirus 505 Giardia lamblia Entamöba hist. Kryptisporidium sp Clostridium diff. 858

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25 Mehrfachinfektionen Die häufigsten Erregerkombinationen: Erreger 1 Erreger 2 Häufigkeit Campylobacter VTEC Campylobacter Norovirus 4 Shigella VTEC 4 Campylobacter Salmonella 3 Salmonella Giardia lamblia 3 negativ Einfachinfektion Doppelinfektion Dreifachinfektion

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27 Nachweis von pathogenen Erregern mittels PCR 2017 (Woche 1 43) Fallzahl in Deutschland Fallzahl Medilab Salzburg % der gefundenen Erreger im Kollektiv aller gefundenen pathogenen Keime Campylobacter Salmonellen Shigellen Yersinien 2062 nur EHEC (nicht HUS) VTEC/EHEC (enteric. Bact. Panel) Enteropathogene E.coli ETEC/EAEC/EIEC/EPEC Plesiomonas Vibrio ch C.diff (schwerer Verlauf)

28 Nachweis von pathogenen Erregern mittels PCR 2017 ( Woche 1 43) Fallzahl in Deutschland Fallzahl Medilab Salzburg % der gefundenen Erreger im Kollektiv aller gefundenen pathogenen Keime Rotavirus Norovirus Adenoviren 44 Enteroviren Entamöba 0 Giardia Kryptosporidien

29 Angaben für die Erregerauswahl Alter nach Antibiotikatherapie nach Hospitalisierung Immunsuppressive Therapie Chemotherapie nach Organtransplantation Akute Diarrhoe < 14 Tage Persistierende Diarrhoe Tage Chronische Diarrhoe >30 Tage Fieber Erbrechen schwere Bauchkrämpfe Stuhl geformt Stuhl flüssig Stuhl blutig

30 Angaben für die Erregerauswahl Alter nach Nahrungsaufnahme nach Auslandsaufenthalt nach Kontakt mit Erkrankten Tätig in Gemeinschaftseinrichtungen Akute Diarrhoe < 14 Tage Persistierende Diarrhoe Tage Chronische Diarrhoe >30 Tage Fieber Erbrechen schwere Bauchkrämpfe Stuhl geformt Stuhl flüssig Stuhl blutig

31 Diarrhoe Passage of three or more loose or liquid stools per day or individuals with fever,bloody or mucoid diarrhea sever abdominal crampings Acute/persistent Diarrhea Chronic Diarrhea KInder <6a Yersinia Rotavirus Giardia l. Wässrige Diarrhoe Campylobacter sp. Salmonella Shigella Enteropathogene E.coli Norovirus Reise anamnese + + Yersinien Plesiomonas Vibrio sp. Protozoen nach Antibiose Hospital + Clostridien Immunsupp. Chemotherapie Organtransplant + *Protozoen Yersinien Mikrosporidien Mykobakterien Fakultativ path.keime Viren,Pilze Diarrhoe mit Blut Campylobacter sp. Salmonella Shigella Enteropathogene E.coli Clostridium KInder <6a Yersinia Rotavirus Adenovirus Cryptosporidium Reise anamnese + + Yersinien Plesiomonas Vibrio sp. *Protozoen Campylobacter sp. Salmonella Shigella Enteropathogene E.coli (EAEC,EPEC,ETEC) *Protozoen * Entamöba histolytica Giardia Lamblia Cryptosporidium p.

32 Zusammenfassung Der direkte Erregernachweis von pathogenen Keimen im Stuhl mittels PCR hat sich in der täglichen Laborablauf bewährt. Die Ergebnisse mit der Kultur sind sehr gut vergleichbar. Die Befunderstellung konnte deutlich beschleunigt werden Offene Fragen: Mehrfach Infektionen, optimaler Algorithmus, wie sensitiv muss die PCR sein?

33 Dr. H. G. Mustafa Dr. Maria Elisabeth Mustafa Labor Dr. Mustafa Dr. Richter OG Bergstraße Salzburg Tel.: Fax.: office@medilab.at Herzlichen Dank für ihre Aufmerksamkeit