Die gramnegative Zellhülle. Gram+ vs. Gram-

Transkript

1 Gram+ vs. Gram- Durch die zusätzliche Membranhülle erwerben Gramnegative ein zusätzliches Zellkompartiment, das Periplasma. Die gramnegative Zellhülle Die äußere Membran ist keine Einheitsmembran. Ihre innere Schicht besteht zwar aus Phospholipiden, die äußere aber aus Lipopolysaccharid. Die äußere Membran Lipopolysaccharid (LPS) Das Lipopolysaccharid-Molekül läßt sich in drei Abschnitte gliedern: - Das hydrophobe Lipid A bildet die innerste Schicht der inneren Lage der äußeren Membran - Das Core-Polysaccharid enthält 7er und 8er-Zucker (Heptose, Ketodesoxyoctonsäure KDO) - Die verzweigten Zuckerketten des O-Antigenbereichs variieren zwischen verschiedenen Bakterienarten. Sie können daher zur Klassifizierung verwendet werden. LPS: Die Struktur des Lipid A Lipid A bildet die Innenseite der äußeren Lage der äußeren Membran (die ja auch ein bilayer ist). Es wirkt stark immunstimulierend und kann einen tödlichen Schock (Endotoxin) erzeugen (Problem nach Bakterien- Lyse durch Antibiotika) LPS: Die Struktur der Core-Region Die Core-Region ist bei allen Gram-negativen relativ einheitlich aufgebaut. Sie enthält eine Heptose (7er-Zucker) und eine Octose, Ketodesoxyoctonsäure (KDO). 1

2 LPS: Ungewöhliche Kohlenhydrate Zucker der Core-Region (Heptose und Ketodesoxyoctonsäure) und des O-antigenen Bereichs (Rhamnose und Abequose). LPS: O-Antigen Der O-antigene Bereich des LPS besteht aus verzweigten Kohlenhydratketten, seine Zusammensetzung variiert zwischen verschiedenen Spezies stark. Ein Kohlenhydrat- motiv aus einigen Zuckern wird mehrfach aneinandergehängt (das () n der nächsten Folie bedeutet n Wiederholungen des gezeigten Motivs in der Klammer). Das O-Antigen wirkt stark immunogen. Antikörper gegen ein O-Antigen erkennen andere O-Antigene nicht (verleihen also keine Immunität gegen andere Bakterien). Die spezifischen Antikörper lassen sich auch zur Bestimmung (Klassifizierung) von Bakterien einsetzen. Strukturen des LPS LPS-Mutanten Mutationen im LPS bei Salmonella typhimurium verändern das Aussehen der Kolonie (von glatt/smooth auf rauh/rough). Dabei sind die Polysaccharidketten unterschiedlich stark verkürzt. Membrankanäle und Porine Die Gram-negative Zellwand ist undurchlässig für hydrophobe Substanzen (durch die hydrophilen Zucker des LPS) und für hydrophile (durch die äußere Membran). Zur Stoffaufnahme durch die Membran dienen hauptsächlich Poren aus Porinprotein-Trimeren. Moleküle bis 700 Dalton können durchtreten. Für bestimmte Substanzen besitzt die äußere Membran spezifische Transporter (Vitamin B12, Trisaccharide, Eisenchelate). Das Lipoprotein (Brauns Lipoprotein, Murein-Lipoprotein) verknüpft die äußere Membran (in die es mit Fettsäureresten eintaucht) mit dem Murein (an das es kovalent gebunden ist). Es ist mit Molekülen pro Zelle das häufigste Protein von E. coli. Lipoprotein 2

3 Periplasma Das Periplasma enthält hohe Konzentrationen an Proteinen (neben Oligosacchariden, die den osmotischen Druck hochsetzen). Darunter sind Bindeproteine für Nahrung (Aminosäuren: Arg, Leu; Zucker: Galactose, Glucose, Arabinose; Vitamine: B12, Thiamin; Ionen: Phosphat, Sulfat), Verdauenzyme (Phosphatasen, Proteasen, Endonuclease I) und Entgiftungsenzyme (β-lactamasen gegen Penicilline und Cephalosporine, die sonst die Mureinbiosyntheses stören, Aminoglycosid-phosphorylierende Enzyme). Permeabilisierung der äußeren Membran Die äußere Membran läßt sich durch Behandlung mit EDTA durchlässig machen. EDTA ist ein Chelator ( Scherenartig zugreifender Komplexbildner), der Magnesium-Ionen bindet. Dadurch lockert sich die LPS-Struktur. Periplasmatische Proteine laufen aus. Das Murein wird zugänglich für zugegebene Verdauungsenzyme (Lysozym*) und kann zur Herstellung von Spheroplasten abverdaut werden. Diese sind osmotisch sehr labil, können aber die Zellwand wieder aufbauen. Definition: Protoplasten haben keinerlei Mureinhülle mehr, Sphaeroplasten (Spheroplasten) noch Reste davon. Permeabilisierung der äußeren Membran - *Lysozym Plasmolyse Bei hohem osmotischen Druck schrumpft das Cytoplasma, bleibt aber an ca. 200 Stellen mit der äußeren Membran verbunden. Diese (Bayer s Junctions; innere und äußere Membran verbunden) dienen dem Stofftransport nach außen. Lysozym, ein Enzyme, das den Mureinsacculus verdaut, dient bei höheren Tieren als erster Schritt der Bakterienabwehr. Lysozym kommt in unserer Tränenflüssigkeit vor, und im Hühnereiweiß, das die wichtigste Quelle zur Isolierung des Enzyms ist. Besondere Zellwände: Säurefeste Zellwand Mycobacterien (Gram-+; z.b. M. tuberculosis) tragen eine Wachsschicht auf dem Mureinsacculus, der aus Mycolsäureestern besteht. Die Wand ist extrem undurchlässig, dadurch sind Mycobakterien schlecht antibiotisch angreifbar. Das Wachs schützt auch vor Phagozytose (durch Freßzellen). Mycobacterien wachsen meist langsam (Generationszeit 24 h). Mit Isoniacid kann man die Mycolsäure-Biosynthese verhindern und die Mycobakterien angreifbar machen. Der hydrophobe Farbstoff Carbolfuchsin läßt sich nicht mit Salzsäure (die nicht durch das Wachs kommt) auswaschen, daher säurefeste Zellwand. Besondere Zellwände: Säurefeste Zellwand In Bezug auf die Schutzwirkung ist die Zellwand der Mycobacterien dener der Gram-negativen überlegen. 3

4 Mycolsäuren Mycolsäuren tragen sehr lange Alkanketten, sie sind über Arabinogalactan (Polysaccharid) an das Murein gebunden. Mycolsäuren Im Cord Factor sind Mycolsäuren an das Disaccharid Trehalose gebunden. Sein Vorkommen ist mit dem Wachstum in Schnurform (cord) gekoppelt, die Voraussetzung für die Infektiosität von M. tuberculosis ist (> Pathogenitätsfaktor). Mycobakterien Schnurartiges ( cord-like ) Wachstum infektiöser M. tuberculosis. Besondere Zellwände: Pseudokristalline Zellwand Selbstaggregierende Proteine werden ausgeschleust und bilden eine oder mehrere kristalline Schichten ( S-Schicht, 2-D- Kristalle) um den Mureinsacculus (bei Gram+) bzw. um die äußere Membran (bei Gram-). Sie schützen wohl vor Phagozytose.* *Bei Archaeen kann die S- Schicht die Zellwand bilden (direkt über der Cytoplasmamembran). Cytoplasma Bei Eubakterien erscheint der Bereich innerhalb der Cytoplasmamembran, das Cytoplasma oder Cytosol, im elektronenmikroskopischen Bild weitgehend unstrukturiert. Manchmal sind Membraneinstülpungen in Schichten oder Bläschen (Vesikeln) zu sehen. Auch körnige Strukturen, Einschlüsse können sichtbar sein, die u.a. als Speicher dienen ( Speichergranula ). Sie können Kohlenhydrate enthalten (Glycogen), Fette oder Polyphosphat (das direkt zur ATP-Synthese dient, es enthält auch die energiereichen Säureanhydridbindungen). Immer im EM erkennbar sind Ribosomen und das Nucleoid, wo sich das Bakterienchromosom befindet. Cytoplasma Das strukturlos erscheinende Cytoplasma besteht vorwiegend aus Wasser und Proteinen. Im Cytoplasma finden die meisten biochemischen Reaktionen der Zelle statt (der Metabolismus der Zelle: Abbau von Nährstoffen - Katabolismus, Aufbau von Zellkomponenten - Anabolismus). Katabole Reaktionen sind z.b. die Glycolyse (Energiegewinnung durch Glucoseabbau) und der Citratcyklus (Tricarbonsäurezyklus), bei dem Reduktionsäquivalente für die Zellatmung (die an der Cytoplasmamembran stattfindet) erzeugt werden. Anabol sind die Synthese von Aminosäuren, Monosacchariden (Gluconeogenese) und Polysacchariden, von Proteinen (Translation), das Verdoppeln der DNA (Replikation) und das Umschreiben der DNA in RNA (Transkription). 4

5 Nucleoid Das Bakterienchromosom ist zwar nicht wie bei Eukaryonten in einem abgetrennten Organell, sein Bereich ist aber anders zusammengesetzt als das übrige Cytoplasma. Die DNA ist dort eng gepackt, dort sind auch die Proteine für Replikation und Transkription konzentriert. Das eigentliche Bakterienchromosom ist mehrere MBp (Megabasenpaare) groß und zum Ring geschlossen. Außerdem können kleinere DNA-Ringe vorhanden sein, die Plasmide. Manche Plasmide sind so groß (Vibrio cholerae >1 MBp), daß man sie als zweites Chromosom betrachten kann. Das Bakterienchromosom ist an die Zellwand angeheftet, das ist für die Verteilung bei der Zellverdopplung wichtig. Nucleoid Durch spezielle Anfärbung (der DNA) läßt sich das Nucleoid deutlich sichtbar machen. Nucleoid Ribosomen Mit dem Elektronenmikroskop läßt sich der Unterschied von Nucleoid und übrigem Cytosol direkt sehen. (Die Linien im unteren Bild sind aufgemalt, um die Abgrenzung der Bereiche zu verdeutlichen) Ribosomen sind Komplexe aus RNA und Proteinen, an denen die Proteine synthetisiert werden. Dabei wird eine mrna als Bauvorschrift abgelesen, die einzubauenden Aminosäuren werden durch einen 3-Buchstaben-Code von Nucleotiden (Triplett-Code) bestimmt. Eine Bakterienzelle enthält bis zu Ribosomen. Ribosomen bestehen aus zwei Untereinheiten (große und kleine, beide mit Protein und RNA). Ribosomen Bakterielle Ribosomen sind etwas kleiner (und arbeiten viel schneller) als eukaryontische Ribosomen ( 70 S gegen 80 S-Ribosomen, S ist die Svedbergeinheit, die aussagt, wie schnell ein Teilchen in der Zentrifuge absinkt (sedimentiert)). Ribosomen sind ein beliebter Angriffspunkt für antibakterielle Antibiotika (Tetracycline, Erythromycin, Streptomycin, Chloramphenicol). Diese Antibiotika hemmen nur das 70 S-Ribosom, sollten also beim Patienten (Mensch, Eukaryont) keinen Schaden machen. Allerdings sind unsere Mitochondrien eigentlich Bakterien (Endosymbionten) mit 70 S-Ribosomen und werden von Chloramphenicol geschädigt (die anderen Antibiotika werden nicht in die eukaryontische Zelle aufgenommen). Endosporen Sporen als Verbreitungsformen werden von verschiedenen Organismengruppen gebildet (Pilze, Actinomyceten (grampositive Bodenbakterien) ). Die nur von einigen Grampositiven (Gattungen Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces) gebildeten Endosporen sind die wohl widerstandfähigsten Lebensformen. 5

6 Endosporen Endosporen entstehen innerhalb der Bakterienzelle. Von außen wird eine schützende Hülle gebildet. Die durch Hunger ausgelöste Sporenbildung ist in den ersten 5 Stunden noch reversibel (durch Glucosegabe rückgängig zu machen). Endosporen Endosporen werden von den Bakterien in Notzeiten (Hunger oder andere ungünstige Umweltbedingungen) als Überlebensformen gebildet. Sie überstehen Temperaturen über 100 C, starke Strahlung, Trockenheit und giftige Chemikalien und können viele hundert Jahre überleben. Das Geheimnis der Stabilität ist insbesondere die extreme Entwässerung auf <15% Wasseranteil. Endosporen: Besondere Bestandteile 10-15% der Sporen-Trockenmasse ist Calcium-Dipicolinat, es entsteht etwa parallel zum Ansteigen der Hitzeresistenz. Die Cortex (innere Sporenhülle) ist ein spezielles, wenig quervernetztes Murein, der Sporenmantel (Exosporium) besteht überwiegend aus Protein (aus viel Cystein und hydrophoben Aminosäuren) und ist so dick, daß er 80% des gesamten Sporenproteins enthält. Endosporen Wegen der Endosporen muß zur Sterilisation auf 121 C erhitzt werden. Einige Sporenbildner sind gefährliche Pathogene: Milzbranderreger B. antracis, C. tetani erzeugt Wundstarrkrampf, C. botulinum Lebensmittelvergiftung (Botulinus-Toxin ist das stärkste bekannte Gift, es führt zur Paralyse), C. perfringens Gas-Gangrän. Dipicolinsäure dienen Bakterien zur Fortbewegung. Ihr äußerer Teil (aus vielen Untereinheiten des Proteins Flagellin) ist eine starre Schraube (macht also keine Schlängelbewegungen), der von einem Rotor in der Zellwand gedreht wird. können einzeln (monotriche Bakterien), an beiden Seiten (amphitrich), in Büscheln (lophotrich) oder um die ganze Zelle herum (peritrich) auftreten. 6

7 Bei Gram-positiven ist die Flagelle mit zwei Scheiben verankert, bei Gram-negativen mit vier. Die innerste (M-Ring), in der Cytoplamamembran, ist jeweils der eigentliche Motor. Die Bewegungsenergie wird durch einen Protonenfluß aufgebracht, dazu muß die Zelle einen Protonengradienten über die Membran erzeugen und aufrechterhalten. Bakterien können zwischen Schwimmen (meist für 1-2 Sekunden) und Taumeln (Sekundenbruchteile, dabei ändert sich die Schwimmrichtung) umschalten, indem sie die Drehrichtung des Motors umkehren. Bei Schwimmen auf ein günstiges Signal zu (steigende Nährstoffkonzentration) wird die Schwimmphase verlängert. Voraussetzung für das gerichtete Schwimmen ist die Fähigkeit, Umweltsignale (Nahrung, Sauerstoff, Licht ) wahrzunehmen und zu verarbeiten. Bei Spirocheten liegen die als Axialfilamente im Periplasma. Dadurch ist die ganze Zelle schraubenförmig und dient als Rotor. Spirocheten können in besonders zähen Medien (Schlamm, Schleim) vorankommen. Treponema pallidum, der Syphilis-Erreger, ist ein Spirochete. Pili (= Fimbrien) Pili (= Fimbrien) Pili sind ebenfalls längliche Zellanhängsel aus vielen Proteinuntereinheiten (Pilinen). Sie dienen der Anheftung an andere Zellen oder an Oberflächen. Bei infektiösen Stämmen ist der Pilus oft für die Infektiosität verantwortlich (Pathogenitätsfaktor). Unterschiedliche Piline erzeugen unterschiedliche Pili. An den Pili sitzen noch ein oder mehrere Adhesinmoleküle, die für die spezifische Verankerung zuständig sind. 7

8 Pili (= Fimbrien) Neben dem Strukturgen (für Pilin) und Adhesingenen enthält das Operon für die Pili-Synthese noch Regulatorgene und Gene für Chaperones, die für die Proteinfaltung wichtig sind. Pili (= Fimbrien) Mit dem Sex-Pilus (F-Pilus) verankern sich E. colis miteinander zum Austausch von genetischem Material. 8