Was alle wissen müssen: Färbetechniken zur systematischen Charakterisierung Christian Gram *1853, Paul Ehrlich *1854

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1 Färbetechniken zur systematischen Charakterisierung Christian Gram *1853, Paul Ehrlich *1854 Entwicklung aseptischer Methoden in der Medizin Joseph Lister *1827, Paul Ehrlich Nachweis einer bakteriellen Infektionskrankheit Robert Koch *1843, die Koch schen Postulate! Begründer der Schutzimpfung Eduard Jenner *1749, Pasteur, Behring, Koch Lebewesen entstehen nicht spontan Lazzaro Spallanzani *1729, Louis Pasteur *1822 Gärung wird durch Mikroorgansimen verursacht (Pasteur), kein spontanter Zerfall von Zucker (Liebig) Endosporen werden durch Tyndallisieren inaktiviert Tyndall *1820 Anaerobes Wachstum bei Clostridien Pasteur DNA ist Träger der Erbinformation Oswald Avery * 1877 Transformationsexperiment 1944 Begründer der Molekularbiologie Max Delbrück * 1906 Salvador Luria *1912 1

2 Systematische Unterscheidung von Prokaryonten und Eukaryonten wichtigste Unterschiede: Zellkern, Organelle Die 3 Reiche der Lebewesen: Archaea, Bacteria, Eukarya Carl Woese 1970 Archaea gliedern sich in 3 Stämme (Phyla), die alten Eubacteria in mehr als 4 Stämme, die modernen Eubacteria in mehr als 8 Stämme Biomembrane bestehen aus Lipiden und Proteinen Bilayer Singer, Nicolson 1972: Fluid mosaik bilayer Phospholipide haben einen Glycerin-Phosphatkopf und zwei Fettsäureketten Lipide und Membranproteine bewegen sich lateral in Bilayer, Flip-Flop ist selten Die Reduktionsenergie (NADH) wird in membranständigen Atmungsketten in einen Protonengradienten umgewandelt Der transmembrane Protonengradient wird für die Synthese von ATP im Cytoplasma gebraucht Die ATP Synthase ist ein rotierender Enzymkomplex, der in der Cytoplasmamembran befestigt ist 2

3 Proteine der äusseren Membrane von Bakterien haben eine ß-Faltblatt-Struktur (Porine sind sog. ß-Fässer) Proteine der inneren Membran haben eine α-helikale Struktur (sog. Transmembranhelices oder Membrananker) 3 unterschiedlichen Aufnahme-Systeme kennt man bei Bakterien: 1. Permeasen, die über Ionengradienten angetrieben sind (z. B. Lactose-Permease) 2. ABC-Transporter, die mit ATP funktionieren und aus 3 Untereinheiten bestehen 3. Phosphotransferase-System (PTS), das über eine Phosphorylierungskaskade funktioniert Die bakterielle DNA ist ein doppelsträngiger Ring und besteht aus etwa 5 Millionen Basenpaaren Seit 1995 sind einige bakterielle Genomsequenzen bekannt 3

4 Die Replikation der DNA beginnt am Origin Nach Aufschmelzen des Doppelstranges binden Einzelstrang-bindende Proteine und eine RNA-Primase Die DNA-Polymerase III verlängert die RNA-Primer in der 5-3 Richtung Die Replikation des Leitstrangs erfolgt kontinuierlich Die Replikation des Folgestrangs erfolgt diskontinuierlich in sog. Okazaki Fragmenten (ca Basen lang) Die RNA-Primer werden von der Polymerase I entfernt und durch DNA ersetzt Die Ansatzstellen der neusynthetisierten Fragmente werden durch die Ligase verknüpft Die RNA Polymerase besteht aus 6 Proteinen (ααββ ωσ) Die Transkription wird durch Bindung des Sigma-Faktors an den Promotor (-35 und TATA-Box der DNA) initiiert Spezifische Sigma-Faktoren existieren für Hitzeschock, Stickstoff-haltige Medien, Flagellen und Sporenbildung 4

5 Die RNA Polymerase ist ein molekularer Motor, wobei das α- Protein entlang des DNA-Strangs schiebt Der Rho-Faktor beendet die Transkription durch Binden an den RNA-Strang Die Transkription kann auch durch eine Haarnadel-Struktur der RNA terminiert werden Die Translation wird durch Bindung der 30S Untereinheit an die Shine-Dalgarno (AGGA) Sequenz initiiert Das Startcodon AUG bindet eine f-met-trna in der P-Stelle des Ribosoms. Alle anderen t-rnas binden an die A-Stelle Bakterien haben drei Stopp-Codons (UAG, UGA, UAA). Daran binden Terminationsproteine Bakterien ziehen Glukose anderen Zuckern vor (Diauxie) Der Glukosespiegel der bakteriellen Zellen wird durch zyklisches AMP (camp) gemessen. Glukosemangel erhöht den camp-spiegel Der camp-cap Komplex bindet an den Promotor und aktiviert die Transkription 5

6 Die trnas haben eine Kleeblatt-Struktur Synthetasen beladen die trna mit einer aktivierten Aminosäure (zweiter genetischer Code) Die Ribosomen-Struktur wurde durch Kristallisation aufgeklärt Viele Enzyme können eine aktive Konformation (R-Zustand) und eine inaktive Konformation (T-Zustand) einnehmen Bei Enzymen anabolischer Wege induziert das Produkt den T-Zustand (Endprodukthemmung) Die Transkription anabolischer Enzyme wird oft durch einen Repressor, der das Endprodukt bindet, reguliert Endprodukt = Operator Das polycistronische Lactose Operon codiert für 3 Enzyme: ß-Galactosidase, Lactose-Permease und Transacetylase Die Transkription wird durch Bindung des Lactose Repressors an die DNA (Operator) reguliert Die Lactose (Substrat) induziert die Transkription indem sie den Repressor bindet und dieser die Bindung an den Operator verliert 6

7 Flagellen sind die Fortbewegungsorgane von Bakterien Sie sind in der Zellmembran verankert Sie variieren in Anzahl und Anordnung (polar, peritrich) Sie werden durch einen Protonengradienten angetrieben Flagellen haben einen helikalen Aufbau Das Filament besteht aus einem Tubus aus Flagellin der ein Durchmesser von 20nm hat Das Filament wächst an der Spitze, wobei die Flagellin-Monomere durch den Tubus wandern Konzentrationsänderungen der Lockstoffe werden durch Methylierung der MCP registriert Andere taktische Signalketten sind Aerotaxis (E. coli), Magnetotaxis (Aquaspirillum) und Phototaxis (Rhodospirillum) 7

8 Chemotaktische Signale werden im Periplasma von den MCP-Rezeptoren detektiert Als Lockstoffe wirken bestimmte Zucker, Aminosäuren und Peptide, Nitrat; als Schreckstoffe Phenol und organische Lösungsmittel Die aktivierten MCP (gebundener Schreckstoff, nicht-gebundener Lockstoff) führen zu einem phosphorylierten CheY, das an die Flagellenmotoren bindet und ein Taumeln der Zellen hervorruft 8

9 Mutagene verändern die Basensequenz der DNA Röntgen Strahlen (X-ray), UV-Licht, Basenanaloga und Chemikalien, die mit den Basen der DNA reagieren sind mutagen Die Mutationsrate einer Substanz lässt sich mit dem Ames Test ermitteln Fehler der DNA-Polymerase können sich als spontane Mutation auswirken Eine Basenänderung kann eine neutrale Mutation, eine Missense oder eine Nonsense Mutation verursachen Rasterverschiebungen bewirken eine Sequenzänderung des nachfolgenden Proteinteils Punktmutationen -Neutrale Mutation (keine Veränderung) -Missense Mutation (andere Aminosäure) -Nonsense Mutation (Verkürzung des Proteins) -Rastermutation (andere AS-Sequenz) Genmutationen -Insertion -Duplikation -Inversion -Translocation (neuer Abschnitt eingefügt) (Abschnitt verdoppelt) (DNA Abschnitt gedreht) (Abschnitt versetzt) 9

10 Punktmutationen führen zu Nichtpaarung (Mismatch) die von MutS erkannt wird Der defekte DNA wird abgebaut (Exonuclease) und wieder neu polymerisiert (Polymerase III) Methylasen modifizieren die DNA, um diese von neusynthetisierter oder fremder DNA unterscheiden zu können Plasmide tragen oft Gene, die den Bakterien zusätzliche Eigenschaften verleihen Plasmide können Fremdgene aufnehmen und sind deshalb gentechnische Werkzeuge Mit Restriktionsenzymen lässt sich DNA sequenzspezifisch schneiden Thymin-Dimere, die durch UV Strahlung entstehen, können durch die Phr-Photolyase gespalten werden Auch durch Excisions(=Ausbau)reparatur können Thymin-Dimere repariert werden (Uvr-System) Dabei bindet UvrA an die DNA und schneidet mit UvrB,C den Einzelstrang. Exonuclease baut den TT-haltigen Strang Ab (ca 12 Basen) und die Polymerase ersetzt diesen wieder 10

11 DNA-Schäden können auch durch die Rekombinationsreparatur behoben werden Voraussetzung dafür ist die Anwesenheit einer zweiten Kopie (z.b. nach Replikation, diploides Genom) Dabei wird der schadhafte DNA-Strang durch Austausch mit der Kopie ersetzt Eine bakterielle Kultur hat verschiedene Wachstumsphasen In der exponentiellen Phase teilen sich E. coli alle 20min Das exponentielle Wachstum pro Zeit lässt sich bei einer halblogarithmischen Darstellung als Gerade aufzeichnen Der Zellzyklus beginnt nach der Teilung (new born cells) In der ersten Phase verlängern sich die Zellen durch Zellwandsynthese (Mureinsynthese) In der zweiten Phase wird die DNA repliziert und die Nucleoide teilen sich 11

12 Bakteriophagen infizieren Bakterien durch Bindung an Oberflächenrezeptoren In der ersten Phase injizieren die Phagenpartikel ihre DNA in das Zellinnere, die dann für die Vermehrung der Phagen sorgt. Mit T2-Phagen konnten 1952 Al Hershey und Martha Chase beweisen, dass die DNA der Erbträger ist. Die Phagen-DNA wird in den Zellen repliziert und Phagenproteine werden synthetisiert Die T4-Phagenpartikel werden aus Vor-Kapsiden, Schwänzen und Schwanzfibern assembliert Durch programmierte Lyse werden die Nachkommen freigesetzt Der T7-Phage codiert seine eigene RNA-Polymerase Diese erkennt nur die phagenspezifischen Promotoren und ist daher gentechnisch interessant 12

13 13 Der Phage Lambda kann sich mit einer Integrase Int in das Chromosom, an einer spezifischen Stelle (att), einbauen Für den lysogenen Zyklus blockiert der Lambda Repressor die Expression der späten Gene Für den lytischen Zyklus blockiert das Cro-Protein die Expression der frühen Gene und der Integrase Int Viele Gram+ Bakterien können Sporen bilden Die Sporen sind säure- hitze- und trockenresistent Die DNA der Sporen befindet sich kondensiert im sog. Protoplasten, umhüllt von Sporenrinde, Cortex, Sporenhülle und Exosporium Die Sporenbildung dauert ca. 8h und etwa 200 Gene sind daran beteiligt In der ersten Phase wird in der Zelle eine Vorspore gebildet und Murein aufgelagert In der zweiten Phase werden die Sporenrinde (Cortex), in die Ca ++, saure Protein (SASPs) und Dipicolinsäure einlagert werden, synthetisiert 13

14 Die Sporogenese wird durch eine Kaskade von Sigma-Faktoren reguliert Die Sporen können nach Jahren, durch Wasseraufnahme, innerhalb weniger Minuten keimen 14