mit Poly-N-(2-aminoäthyl)-acrylamidund

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1 Diss. ETH Nr KovalenteVerknüpfung von Oligodesoxyribonukleotiden mit Poly-N-(2-aminoäthyl)-acrylamidund Erzeugungvon DNS mit zufälligen Basenfolgen mit Hilfe der ntransferase ABHANDLUNG zur Erlangungdes Titels Doktor der Naturwissenschaften der EIDGENÖSSISCHENTECHNISCHEN CHSCHULE ZÜRICH vorgelegt von Matthias R. Voser Dipl. Natw. ETH geboren am 21. April 1966 von NeuenhofAG Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. P. L. Luisi, Referent Prof. Dr. S. A. Benner,Korreferent Zürich 2002

2 ZUSAMMENFASSUNG Als erstes wurde ein Verfahren entwickelt, um synthetisch hergestellte Oligodesoxyribonukleotide über ein Verbindungsstück an deren 5'-Ende kovalent mit einem Festkörper, bestehend aus Poly-N-(2'-aminoäthyl)- acrylamid (13), zu verbinden. Ausgehend von der einfachen Verbindung 1,2,6-Hexantriol (1) wurde nach Einführen einer zyklischen Kohlensäure-Schutzgruppe an der Glykolgruppe ein Phosphoramidit 7 hergestellt, welches als gewissermassen letztes "Nukleotid" unter wasserfreienbedingungen in Acetonitril auf einem "DNS- Synthesizer" an ein DNS-Oligo geknüpft werden konnte. Nach dem Entfernen der Schutzgruppen und Abtrennen vom Trägermaterial Standardbedingungen unter (konzentriertes Ammoniak, 16 Std. bei 60 C) erhielt man ein Oligodesoxyribonukleotid 9, welches am 5'-Ende eine 5,6- Dihydroxyhexylphosphatgruppeaufwies (Fig. I). Y-o y-o / CN 0*P*N^ 1 A DNS-Synthesizer 10 IO O..0 P DNS ph 7 DNS NaBH3CN ph OwP,p p: DNS Fig. I: Synthese eines Oligonukleotides 9 mit einerdiolgruppe am 5'-Ende und Verknüpfung von 9 mit einem Festkörper 13 (Poly-N-(2'-aminoäthyl)-acrylamid). Die Glykolgruppe von 9 Hess sich unter wässrigen Bedingungen in Gegenwart von 15 mm Natriumperiodat zum Aldehyd oxidieren, welcher mit den Aminogruppen des festen Poly-N-(2'-aminoäthyl)-acrylamids (13) zu einer Schiffschen Base reagiert. Unter milden sauren Bedingungen (ph 5) Hess sich die Schiffsche Base in Gegenwart von 60 mm Natriumcyanoborohydrid reduzieren. Die Ausbeuten an immobilisierterdns 28 wurden durch 3'- Endmarkierung von 9 mit 32P bestimmtund lagen bei %.

3 - ebenfalls am Die Eigenschaften des Enzyms " Transferase" (Desoxyribonukleotidyl-exotransferase, E.C ) ermöglichten in einem zweiten Teil die Entwicklungeines Verfahrenszur Erzeugung von einzelsträngiger DNSmit zufälligen Basenfolgen. Die Abschnittemit den zufälligen Basenfolgensind von definierten Primerbindungsstellenbegrenzt ( Seql" am 5'-Ende, Seq2" am 3'- Ende) und wurden Randomere" genannt. Man Hess ein Oligodesoxyribonukleotid von 24 nt Länge ( Seql", 35) mit einer äquimolaren Mischung aus den vier natürlichen Desoxyribonukleotidtriphosphaten in Gegenwart von r Transferase reagieren. Es zeigte sich, dass sich Polydesoxyribonukleotide mit Längen von etwa 200 bis 600 nt herstellenlassen. Eine besondere Schwierigkeit stellte das Anfügen der Primerbindungsstelle ("pseq2", 38) an das 3'-Endeder zufälligen Basenfogendar. Hierfürmusste erst - mit Hilfe der n Transferase, sowie dgtp 3'-Ende der zufälligen Basenfolgen von 36 eine kurze oligo-dg-folge (ca. 10 nt lang) erzeugt werden, damit die Ligation mit Hilfe eines Verbindungsstückes möglich 39 war (Fig. II). 5' 3' dntp dgtp (Seql)? (Seql)-NNN...NNN *~ (Seql)-NNN...NNNGG..GG 35 Transferase 3g Transferase 37 c. o D Ligation (Seql)-NNN...NNNGG..GG-(Seq2) -* (Seql)-NNN...NNNGG..GG p(seq2) CC..CC-(Sea2) Fig. II: Synthese von Polydesoxyribonukleotiden mit zufälligenbasenfolgen mit r Transferase,ausgehend von einem Oligonukleotid 35 (24 nt lang). N steht für irgend eines der vier natürlichen Desoxyribonukleotide, Seql" und Seq2" bilden Primerbindungsstellen definiertenbasenfolgen. mit Die zweite Primerbindungsstelle 38 ( pseq2") wird mit Hilfe eines Verbindungsstückes 39 ( Splint") mit 37 ligiert. Die Produkte 40, die aus einer Sammlungvon etwa 1014 unterschiedlichen Polynukleotidenbestanden, wurden mittels PCR vervielfacht, nach dem Schrotschuss"-Verfahren in E. co/z'-zellen kloniert und sequenziert. Die erfolgreich sequenziertenstichprobenwurden auf Zufälligkeithin untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Purinbasen-Nukleotide gegenüber den Pyrimidinbasen-Nukleotidenleicht bevorzugt wurden. Das Ausmass der Bevorzugung der Purine gegenüberder Pyrimidine betrug Faktor Die Auftritthäufigkeiten der Dimere wurden ebenfalls untersucht. Die Kombination AA scheint etwas bevorzugt, AC und CA hingegen unterdrückt etwas zu werden. Die Abweichungen von den erwarteten Häufigkeiten betrugen höchstens % (AA) bzw % (CA).

4 Somit kann gesagt werden, dass sich mit Hilfe der n Transferase unter den gewählten Reaktionsbedingungen(8.0 mm MgCl2, 4.0 mm C0CI2, je 0.25 mm datp, dctp, dgtp, TTP, 200 mm Cacodylat,25 mm Tris-HCL0.25 mg/ml acetyliertes BSA, 37 C) Oligo- oder Polydesoxyribonukleotide erzeugen lassen, deren Basenfolgen in hohem Masse zufällig, d. h. die vier Basen stochastischverteilt sind.

5 10 SUMMARY In the first part of this dissertation work, a procedure was developed for the synthesis of a phosphoramidite, suitable for incorporation into automateddna synthesis, that attaches to the 5'-end of a DNA molecule a protected diol. This later allowed the immobilizationof the DNA on a solid support. Starting from the simple Compound 1,2,6-hexanetriol(1) the phosphoramidite 7 was synthesized after protecting the diol group by forming a cyclic carboic acid di-ester (3). The phosphoramidite 7 then was added as the last nucleotide" during automateddna synthesis. >- Vq / CN 1 A /DNA-synthesizer 10 O.O.p; 10 O.,0 p O' O DNA ph 7 DNA NaBH3CN ph Q>,P,p.p; DNA Fig. I: Synthesis of an oligonucleotide (9) carrying a linker with a diol group on its 5'-end and immobilization on a solid supportby oxidyzing the diol group of 9 followed by reactionwith the primary amines of the support 13 (poly-n-(2'-aminoethyl)-acrylamide). Following Standard deprotectionconditions (concentratedammonia, 16 hrs at 60 C), the diol-dna 9 was generated. Its diol group was oxidized in 15 mm periodate to form an electrophilicaldehydegroup. This group can react with the primaryamino groups of a solid phase to form a Schiff base, which can be reduced in 60 mm NaBHsCN to yield DNA immobilizedcovalently to a solid support (Fig. I). An example is provided whereby a specific sequence immobilized was on modified Polyacrylamidebeads (poly-n-(2'-aminoethyl)- acrylamide (13)). To determine the yields of the immobilization reaction the oligonucleotide 9 was 3'-endlabelled with 32P, and the amount of radioactivity remaining on the support 28 was measured by Cherenkov-counting. The yields vary from %. In a second part of the dissertation, the properties of the enzyme terminal transferase" (deoxyribonucleotidyl-exotransferase, E.C ) allowed the development of a procedure for synthesizing single stranded DNA with quasi-

6 11 random sequence. The randomsequences were flanked by primer binding sites of defined sequences ( Seql" at the 5'-end, Seq2" at the 3'-end) and were called randomers". A single Strand DNA molecule 24 nucleotides in length (,,Seql",35) incubated was in the presence of an equimolar mixture of the four Standard nucleotide triphosphates and terminal transferase. The procedure yielded polydeoxyribonucleotidesof nucleotides in length. The additionof the second primer binding site ( pseq2",38) at the 3'-end of the random sequence turned out to be quite tricky. First, an oligo-g sequence was added by incubatingthe randomizedoligonucleotide 36 with dgtp in presence of terminaltransferase.then the phosphorylated pseq2"(38) was ligated to 36 with the help of a splint (39) (Fig. II). 5' 3' dntp dgtp (Seql)? (Seql)-NNN...NNN? (Seql)-NNN...NNNGG..GG 35 Transferase 3g Transferase 37 c-, J Ligation -* (Seql)-NNN...NNNGG..GG-(Seq2) (Seql)-NNN...NNNGG..GG p(seq2) CC..CC-(Seq2) Fig. II: Synthesis of single Strand random DNA with terminal transferase starting with the oligonucleotide35 (24 nt in lengh). N Stands for any of the four Standard deoxyribonucleotides, Seql" and Seq2" are the primerbinding sites with defined sequences. The products 40, a pool of approximately 1014 differentdna molecules,were PCR amplified and shot-gun cloned in E. coli. 11 clones were successfully sequenced, and the sequences analyzed for randomness.slight biases in favour of da and dg were observed, the factor of the preferenceof the purines the pyrimidines over was ; otherwise, the products were random. The randomness of the dimers was analyzed as well. A slight preference of the dimer AA was observed, whereas the dimers AC and CA were slightly suppressed.the aberrations from the expected frequencies were at most % (AA) respectively % (CA). These results suggested that the terminal transferase procedure under these particular conditions (8.0 mm MgCl2, 4.0 mm CoCl2, 0.25 mm each datp, dctp, dgtp, TTP, 350 mm cacodylate, 25 mm tris-hcl, 0.25 mg/ml acetylated BSA, 37 C) turned out to be a favorable tool for synthesizing highly randomizedsingle Strand DNA, amplifiable by PCR.