In addition to fulfilling the basic service

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1 231_236_avm.qxd :52 Uhr Seite 231 Abteilung für Vergleichende Medizin Department of Comparative Medicine Neuherberg (Leiter / Head: Prof. Dr. Jörg Schmidt) Die Institute Die Abteilung für Vergleichende Medizin bearbeitete neben den Dienstleistungen im Bereich der Versuchstierzucht und -haltung wissenschaftlich-tierexperimentelle Grundlagen und Techniken. Diese wurden für die Institute der biomedizinischen Grundlagenforschung bereitgestellt. Die Durchführung eigener versuchstierkundlicher Forschungs- und Entwicklungsprogramme hatte zum Ziel, den jeweils neuesten Kenntnisstand für eine erfolgreiche Umsetzung dieser Aufgaben zu gewährleisten. Am Jahresende waren in der Abteilung 5,5 WissenschaftlerInnen, 2 Doktorandinnen, 28 Auszubildende und 78 technische MitarbeiterInnen einschließlich TierpflegerInnen (davon einer in Altersteilzeit) beschäftigt. In addition to fulfilling the basic service functions of breeding and keeping laboratory animals, the Department of Comparative Medicine investigates fundamental principles of laboratory animal science and experimental techniques. These are made available to the institutes that undertake basic biomedical research. The independent research programme in laboratory animal science is intended to ensure that the Department remains at the forefront of the knowledge needed to fulfil its tasks successfully. At the end of 2003, the Department had 5.5 scientists, 2 postgraduate students, 28 trainees, and 78 technicians and animal caretakers (one half-time pre-retirement). Forschungs- und Entwicklungsprogramm Die Charakterisierung der biologischen Funktion von Selenoproteinen in entsprechenden knockout- und transgenen Mausmodellen, Untersuchungen zur Pathogenese endogener Retroviren verschiedener Inzucht-Mausstämme sowie die Entwicklung neuer adäquater Strategien zur mikrobiologischen Sicherheit der Tierbestände und der davon in vitro verwendeten Materialien waren die zentralen Themen. Die Vertiefung versuchstierkundlicher und tierschutzrelevanter Fragestellungen und die Entwicklung alternativer in vitro-modelle zur Reduktion von Tierversuchen stellten zusätzliche Forschungsaufgaben der Abteilung dar. Dazu wurden Methoden und Bedingungen zur tierschutzgerechten Haltung und Pflege von Research and development programme The main focus is on the biological function of selenoproteins using appropriate knockout and transgenic mouse models, investigations into the pathogenesis of endogenous retroviruses in various inbred strains of mice and the development of adequate strategies to ensure the microbiological security of the animals and of material from them used in vitro. The Department also looks at more depth into questions related to laboratory animal science and those relevant for animal welfare, and investigates the development of alternative in vitro models with the aim of reducing the number of animal experiments. In addition, the methods and conditions for maintaining and caring for animals in a manner GSF 231

2 231_236_avm.qxd :52 Uhr Seite 232 Versuchstieren standardisiert und verbessert. Grundlegende Techniken der Reproduktionsbiologie und Versuchstierkunde, wie zum Beispiel Stammzell-Technologie, Mutationen der Maus-Keimbahn, Embryo- Kryokonservierung sowie in vitro-fertilisierung und Keimzell-Kryotechnik, wurden in Zusammenarbeit mit den Instituten für Experimentelle Genetik und für Entwicklungsgenetik im Rahmen der CryoGene Lehr- und Dienstleistungsgruppe etabliert und den Nutzern des Unternehmens angeboten. Im Rahmen des GSF-Knotens des Europäischen Maus Mutanten Archivs (EMMA) sowie der German Mouse Clinic (GMC) erfolgte die Hygienesanierung verschiedener Maus-Stämme und -Haltungsbereiche; dazu wurden neue Strategien und Ansätze für die IVC- und Mikroisolator-Haltung von Versuchstieren sowie reproduktonsbiologische Fragestellungen entwickelt. Die Unterstützung und Hilfe bei der Planung, Antragstellung und sachgerechten Durchführung von Tierversuchsvorhaben nach medizinischen, biologischen und tierschützerischen Grundsätzen erfolgte in regelmäßigen Beratungen mit den Nutzern. appropriate for animal welfare are standardised and improved. Basic techniques in reproduction biology and laboratory animal science, for example stem cell technologies, mutations in the mouse germ line, embryo cryopreservation, in vitro fertilisation, and stem cell cryo techniques, are established in cooperation with the Institutes of Mammalian Genetics and Experimental Genetics under the aegis of the newly-established CryoGene Teaching and Service Group, and offered to users. Under the framework of the GSF focal point for the European Mouse Mutant Archive (EMMA) and the German Mouse Clinic (GMC), the Department carried out rederivation of selected mouse strains and animal quarters areas. For this, new strategies and approaches were developed for keeping animals in separately ventilated cage units (so-called IVC racks) and microisolators, and for reproductive biological investigations. Support in the planning, application for permission, and correct implementation of animal experiments according to medical, biological, and animal protection principles is provided through regular consultations with the users. Biologische Funktion von Selenoproteinen Im Rahmen des DFG-Schwerpunktprogramms Selenoproteine und in Zusammenarbeit mit dem GSF-Institut für Klinische Molekularbiologie und Tumorgenetik wurden zur Funktionsanalyse der antioxidativen Selenoproteine Phosopholipidhydroperoxid Glutathionperoxidase (PHGPx) und mitochondriale Thioredoxinreduktase (TR2) konditionale Knockout-Mäuse hergestellt. Mit Hilfe der konditionalen Knockout-Technologie lassen sich die Proteine sowohl ubiquitär als auch Gewebe-spezifisch und induziert ausschalten. Der generelle homozygote Knockout von PHGPx und TR2 war embryonal letal. Homozygote PHGPx- Knockouts entwickelten sich bis ca. Tag 7 der Embryonalentwicklung, TR2-Knockouts bis zum Tag 13. Für das Absterben der TR2- Knockouts war ein kombinierter Ausfall der Herzfunktion und der Blutbildung verantwortlich. Um zu untersuchen, ob der Herz- Phänotyp ein primärer, direkt auf den Ausfall der TR2 im Herzen zurückzuführender Prozess ist, oder möglicherweise ein Sekundäreffekt, der auf ein Defizit in der Blutbildung folgt, wurde unter Einkreuzen Cretransgener Mäuse die TR2-Funktion Gewebe-spezifisch im Herzen ausgeschaltet. Hier wurden Tiere geboren, welche kurz nach der Geburt starben. Die Tiere litten an einem generalisierten Ödem, das auf ein beidseitiges Herzversagen zurückzuführen war. Die Herzmuskulatur zeigte einen Verlust der Querstreifung und eine starke Quellung der Mitochondrien mit Zerstörung der Cristae. Als komplementärer Ansatz zur genetischen Analyse von spezifischen Selenoproteinen wurde durch eine Selendepletion über mehrere Generationen eine Kolonie Selendefizienter weiblicher Mäuse etabliert. Damit werden nunmehr die Folgen eines Ausfalls aller Selenoproteine untersucht. Durch Einkreuzen von Männchen aus genetisch determinierten Krankheitsmodellen lassen sich 232 GSF

3 231_236_avm.qxd :52 Uhr Seite 233 ein Selenmangel und dessen Einfluss auf die Pathogenese in verschiedenen Krankheitsmodellen direkt charakterisieren. Pathogenität endogener Retroviren verschiedener Maus-Inzuchtstämme Am Modell des T-Zell-Lymphom-induzierenden SL3-3-Virus wurde die Pathogenität von sechs Virusmutanten mit Triplet-Mutationen im hochkonservierten Upstream-Bereich des viralen Enhancers in SWR-Mäusen untersucht. Dieser mutierte Bereich übt normalerweise einen negativen Einfluss auf die Regulation der Virusexpression aus, ein Effekt, der mit der Bindung des YY1-Transkriptionsfaktors in diesem Bereich in Verbindung gebracht wird. Alle 6 Virusmutanten behielten ihre Replikationsfähigkeit bei und induzierten, ähnlich wie das nicht-mutierte wildtyp SL3-3-Virus, T-Zell-Lymphome. Im Gegensatz zum wildtyp SL3-3-Virus entwickelten sich die durch die Mutanten induzierten Lymphome schneller. Diese Daten deuten darauf hin, dass das 15 bp umfassende YY1-Motif sowie seine direkte Umgebung im Enhancerbereich die Regulation der Virusexpression negativ beeinflusst. CryoGene Lehr- und Dienstleistungsgruppe In der gemeinsam von der Abteilung für Vergleichende Medizin, dem Institut für Experimentelle Genetik und dem Institut für Entwicklungsgenetik etablierten CryoGene Lehr- und Dienstleistungsgruppe wurden Ovar-, Sperma- und Embryo-Kryokonservierungen zur Langzeit-Asservierung wichtiger Mauslinien durchgeführt. Durch Embryo- Transfers und Weiterzucht der etablierten Mauslinien wurden Versuchstiere generiert, die gemäß FELASA frei von spezifizisch pathogenen Erregern waren. Diese Servicebedingten Forschungsprojekte und Dienstleistungen von CryoGene bilden die Grundlage für die erfolgreiche Durchführung der verschiedenen Tierversuchsvorhaben in den Abteilungen, Instituten und Klinischen Kooperationsgruppen. Kryokonservierung von Ovarien, Spermien und Mausembryonen Für die Langzeitkonservierung von Keimzellen der Maus wurden Ovarien von 11 Weibchen und Spermien von insgesamt Männchen eingefroren. Maus-Embryonen wurden im Zweizell- Stadium entnommen und bei 196 C in flüssigem Stickstoff gelagert. Insgesamt wurden im Jahr Embryonen aus 7 Mausstämmen neu ins Cryo-Archiv aufgenommen. Von den kryokonservierten Embryonen wurden 572 für die Revitalisierung verwendet. Insgesamt sind derzeit 23 Mauslinien mit Embryonen gelagert. Revitalisierung und Hygienesanierung von Mauslinien Die Zahl der Embryotransfers für die Erzeugung von transgenen und mutanten Mäusen, für die Revitalisierung von kryokonserviertem Sperma und Embryonen sowie für die Hygienesanierung stieg in 2003 weiter an. Die Vorgehensweise beim Embryotransfers für die verschiedenen Anwendungsgebiete ist in der Abbildung dargestellt. Durch eine in vivo-produktion von Embryonen wurden im Rahmen der Hygienesanierung von Mauslinien (Wildtyp, Mutanten, Knockouts) mit einem nicht-spf, bzw. mit unbekanntem Hygienestatus 177 Transfers in spezifisch pathogen-freie (SPF)-Rezipienten durchgeführt. In 32 Ansätzen wurden kryokonservierte 2-Zell-Embryonen aufgetaut und transferiert. Dabei wurden in 5 von 8 Fällen (62,5 %) die Mausstämme revitalisiert. Nach einer in vitro-fertilisation wurden in 145 Ansätzen Maus-Embryonen aus der in vitro 2-Zell-Embryo-Produktion insgesamt 38 Mausstämme transferiert und dadurch 31 Mauslinien (82 %) neu generiert. Hygienemonitoring-Programm Alle Bereiche der Nagerhaltung wurden über ein definiertes Sentinel-Monitoring- Programm im Abstand von 3 Monaten entsprechend den Empfehlungen der FELASA zur mikrobiologischen Überwachung von Versuchstierbeständen untersucht. Dadurch wird das Hygienemonitoring standardisiert, der Verbrauch wertvoller Versuchsmäuse für routinemäßige Hygieneuntersuchungen vermieden und eine Veränderung im Hygienestatus eines Tierbereichs zeitnah erfasst. Insgesamt wurden im Rahmen der mikrobiologischen Überwachung der Versuchstiere im Berichtszeitraum Die Institute GSF 233

4 231_236_avm.qxd :52 Uhr Seite 234 in vivo-produktion von 2-Zell-Embryonen x Tag 1: 5 I.E. PMSG Tag 3: 7.5 I.E. hcg Kryokonservierung von in vivo- 2-Zell-Embryonen Auftauen in vitro- Fertilization Tag 1: 5 I.E. PMSG Tag 3: 7.5 I.E. 14 h after hcg Eizellen + Spermien 2-Zell-Embryonen Embryotransfer Tag 0,5 pseudoträchtige Swiss-Rezipienten Eileitertransfer 20 2-Zell-Embryonen je Rezipient 1 5 Rezipient je Linie Rezipienten in individuell belüfteten Käfigen einzeln gehalten 6 12 Wochen nach dem Transfer Gesundheitsuntersuchung gemäß FELASA (1 Rezipient je Linie) Abb. 1: Embryotransfer von 2-Zell-Embryonen verschiedener Herkunft für die Revitalizierung und Rederivation von Mauslinien Sentinel-Mäuse, 28 Sentinel-Ratten, 8 Hamster und 58 Embryo-Transfer-Rezipienten untersucht. Um das Hygienemonitoring von IVC- Systemen zu optimieren, wurden die Sentinels in einem definierten Käfig der Abluft aus den übrigen Käfigen des IVCs ausgesetzt. Diese in der Abteilung entwickelte und unter dem Produktnamen VR BioScreen lizensierte Vorrichtung zur kontinuierlichen Erfassung von vorwiegend aerogen übertragbaren Keimen und Krankheitserregern erwies sich unter Praxisbedingungen als effizient für das Monitoring von MHV, dem in Europa am weitesten verbreiteten Mauspathogen. Helicobacter-Status in der Tierhaltung der GSF Seit 2002 empfiehlt die FELASA, Nagerhaltungen mindestens einmal jährlich auf Helicobacter spp. zu untersuchen. Als Methode der Wahl für diese Untersuchung gilt international der Nachweis spezifischer Helicobacter Gensequenzen in Kot- oder Dickdarmproben über eine PCR. Die Notwendigkeit, Helicobacter-freie Mäuse als Sentinels und als Rezipienten für mikrobiologische Sanierungen einzusetzen, erforderte eine Sanierung aller Zuchtlinien im Container. Der Bereich wurde deshalb geleert, desinfiziert und zum Jahresende mit reassoziierten keimfreien Mäusen neu belegt. Diese Mauskolonie dient nun zur Etablierung neuer, Helicobacter-freier Mauslinien. Aus- und Fortbildung Zum Jahresende waren 10 Tierpfleger und 18 Biologielaboranten in der Berufsausbildung. In Zusammenarbeit mit universitären und außeruniversitären Forschungseinrichtungen aus dem Münchener Raum nahmen 20 externe Auszubildende regelmäßig am innerbetrieblichen Unterricht und an Praktika teil; 12 externe Auszubildende wurden 234 GSF

5 231_236_avm.qxd :52 Uhr Seite 235 auf die Zwischen- und Abschlussprüfungen vorbereitet. Im Berichtszeitraum haben 2 Tierpflegerund 4 Biologielaboranten-Auszubildende ihre Berufsausbildung erfolgreich abgeschlossen. Im Rahmen der Ausbildung von qualifiziertem technischem Personal, Gastwissenschaftlern, Praktikanten und Studenten wurden Übungen zur Narkose, Vasektomie, Embryotransfer, Blutentnahme, Superovulation, Präparation von Eizellen und Embryonen und deren qualitative Beurteilung durchgeführt. Für Studenten der Technischen Universität wurde erstmals ein Blockpraktikum Reproduktionstechniken bei Labortieren durchgeführt. Die fachspezifische Aus- und Fortbildung von Biologen und Tierärzten erfolgte in regelmäßigen Seminaren zu aktuellen Themen der Versuchstierkunde und des Tierschutzes sowie in der praktischen Einweisung verschiedener Versuchstiertechniken. Die Abteilung ist als Ausbildungsstätte für Fachwissenschaftler für Versuchstierkunde anerkannt. Der Leiter der Abteilung ist zur Weiterbildung für die Gebiete Versuchstierkunde und Mikrobiologie ermächtigt. Dienstleistungen Die Dienstleistungen umfassen die Zucht und Haltung der Versuchstiere unter definierten Umwelt- und Hygienebedingungen und unter Berücksichtigung eines umfassenden Tierschutzes für die biologisch-medizinische Forschung und deren Bereitstellung für die Experimentatoren. Dies beinhaltete genetisch definierte und mikrobiologisch einwandfreie, konventionelle oder transgene, bzw. Knock out-versuchstiere entsprechend den Vorgaben und wissenschaftlichen Fragestellungen der Experimentatoren. Es wurden Strukturen geschaffen, um den besonderen Ansprüchen an die Haltung und Verwendung dieser Tiere in besonderem Maße gerecht zu werden. So wurden die wichtigen Mausstämme durch strikte Anwendung von Barrierebedingungen weiterhin frei von relevanten Krankheitserregern, einschließlich dem Maus-Hepatitis-Virus (MHV), gezüchtet. Dafür hat sich der Einsatz von einzelbelüfteten Käfig-Systemen (sog. IVCs) oder die Haltung von Mäusen in Käfigen unter Filterdeckeln bewährt. Durch diese Maßnahmen wurden die spezifischpathogen-freien (SPF)-Tiere vor Neuinfektionen langfristig und wirkungsvoll geschützt. Die Einrichtung eines regelmäßig durchgeführten und sehr aufwändigen Hygienemonitorings unter Verwendung von Indikator- Tieren (Sentinels) ermöglichte eine kontinuierliche Übersicht über den Hygienestand des gesamten Tierbereichs. Zucht und Haltung von Versuchstieren Im Jahresdurchschnitt wurden von den Mitarbeitern der Abteilung in 12 Bereichen durchschnittlich ca Mäuse, 500 Ratten, 200 Hamster, 107 Hunde sowie Kaninchen und Meerschweinchen und Zebrabärblinge gezüchtet und betreut. Die wissenschaftlichen Forschungsvorhaben wurden im Rahmen von 34 F&E-Vorhaben aus 13 Abteilungen und Instituten der GSF an Hand von 37 genehmigten bzw. der Aufsichtsbehörde angezeigten Tierversuchsvorhaben durchgeführt. Import von Versuchstieren In 2003 wurden mit 255 Versuchstieranforderungen Nager von Tierhaltungen außerhalb der GSF importiert. Zum Schutz des Versuchstierbestands der GSF vor potenziellen Infektionserregern der importierten Tiere wurde für jeden dieser Importe ein aktuelles Gesundheitszeugnis für die entsprechenden Tiere angefordert. Tiere mit zweifelhaftem Hygienestatus wurden vorübergehend in der Quarantänestation in IVCs untergebracht und über das standardisierte Sentinel-Monitoring-Programm der Abteilung untersucht. Bei der Anwendung dieses Verfahrens wurde keine Einschleppung von neuen Infektionserregern festgestellt. Hygienestatus und Infektionsprophylaxe Einzelbelüftete Käfigsysteme (IVC-Systeme) wurden in Räumen der SPF-Bereiche B, C und D im Rahmen der Embryotransfers zur Haltung der Rezipienten bis zur nächsten Hygieneuntersuchung verwendet. In den konventionellen Bereichen NB sowie in der German Mouse Clinic (GMC) und in der Quarantäne ermöglichte der Einsatz von IVCs die Haltung von spezifisch pathogenfreien (SPF gemäß der Liste der von der Die Institute GSF 235

6 231_236_avm.qxd :52 Uhr Seite 236 FELASA genannten Erreger) Mäusen neben non-spf-tieren (z.b. MHV-positiven Mäusen), ohne dass es zu Infektionen der SPF-Tiere kam. Zur Verbesserung der mikrobiologischen Qualität der Versuchstierhaltung wurden vermehrt Filter-Deckel-Käfige (Mikroisolatoren) eingesetzt. Insbesondere gegenüber MHV erwies sich diese Methode als wirksam, und infektionsbedingte Verluste wurden dadurch deutlich reduziert. Das Umsetzen aller in IVCs gehaltenen Mäuse wurde in Laminar-Flow-Umsetzstationen mit linear höhenverstellbaren Arbeitsbereichen durchgeführt. Dies bedeutet bei gleichbleibendem Objekt- und Personenschutz zusätzlich eine erheblich verbesserte Arbeitsplatzqualität. Dieser Qualitätsstandard erforderte andererseits einen erheblichen Mehraufwand an Investitionen, Betriebsmittel und Personal. Beagle-Kolonie Mit den Hunden der Beagle-Kolonie und mit den Labradors wurden die Langzeitexperimente im Rahmen der GSF-Knochenmarktransplantationsstudie weitergeführt. Außerdem wurden Forschungsvorhaben mit dem Klinikum der LMU, Großhadern, mit der Gynäkologischen und Andrologischen Tierklinik, dem Institut für Physiologie und dem Institut für Tierschutz, Verhaltenskunde und Tierhygiene der LMU weitergeführt bzw. neu eingerichtet. Standardisierung von Funktions- und Arbeitsabläufen Zur Standardisierung der Betriebsabläufe und zur Erreichung und Sicherstellung eines hohen Hygienestandards in den verschiedenen Bereichen der Tierhaltung wurden weitere standardisierte Arbeitsanweisungen (SOPs) erstellt und in den verschiedenen Bereichen der Tierhaltung etabliert. Die SOPs einschließlich der Zugangsregelung zu den verschiedenen Tierhaltungsbereichen können über die homepage der Abteilung (www.gsf.de/avm/) eingesehen werden. Zusammenarbeit Gynäkologische und Andrologische Tierklinik und Medizinische Tierklinik der LMU München Institut für Physiologie, Physiologische Chemie und Tierernährung der LMU München Institut für Tierschutz, Verhaltenskunde und Tierhygiene der LMU München Institut für Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenmedizin, LMU, München Institut für Tierzucht und Haustiergenetik, Georg-August- Universität Göttingen Max-Planck-Institut für Biochemie, Tierhaltung, Martinsried Medizinische Hochschule Hannover, Zentrales Tierlabor und Institut für Versuchstierkunde, Hannover Universität Ulm, Tierforschungszentrum, Ulm Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg Hahn Meither Institut, Abtl. Spurenelemente in Gesundheit u. Ernährung, Berlin Deutsches Inst. f. Ernährungsforschung, Abt. Vitamine u. Atherosklerose, Bergholz-Rehbrücke Abteilung für Innere Medizin I, Medizinische Fakultät der Universität Ulm Laboratory of Genetics, Division of Basic Sciences, NCI, NIH, Bethesda, MD, USA Dept. of Microbiology, UCSF, San Francisco, USA Dept. of Molecular and Structural Biology, University of Aarhus, Dänemark Gray Cancer Institute, Northwood, Middlesex, UK Sagres Discovery, Davis, CA, USA Ausgewählte Veröffentlichungen Conrad, M., Brielmeier, M., Wurst, W. and Bornkamm, G.W.: Optimized vector for conditional gene targeting in mouse embryonic stem cells. Biotechniques 34:1136-8, 1140, 2003 Ma, S.L., Lovmand, J., Sørensen, A.B., Luz, A., Schmidt, J. and Pedersen, F.S. Triple base pair changes within and adjacent to the conserved YY1 motif upstream of the U3 enhancer repeats of SL3-3 murine leukemia virus cause a small, but significant shortening of latency of T-lymphoma induction. Virology 313:638-44, 2003 Mahabir, E., Mayer, A., Marschall, S., Hrabe de Angelis, M., Schmidt, J. Importance of embryo transfers in transgenic mouse facilities. Reprod., Fertil. Dev. 16, , 2004 Moreno, S., Laux, G., Brielmeier, M., Bornkamm, G.W. and Conrad, M.: Testis-specific expression of the nuclear form of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx). Biol Chem 384:635-43, 2003 Wilhelm, P., Riminton, D.S., Ritter, U., Lemckert, F.A., Scheidig, C., Hoek, R., Sedgwick, J.D. and Körner, H.: Relative contribution of membrane lymphotoxin in lymphoid organ formation and host response. Eur. J. Immunol. 32: GSF

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