QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch

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1 QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Nur für In-Vitro Diagnostik CLIA Kompliziertheit: Hoch Verwendungszweck QUANTA Lite TM H. pylori IgG ist ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) für die semi-quantitative Bestimmung von IgG Antikörper gegen H. pylori (Helicobacter pylori) im Humanserum. Die Bestimmung dieser Antikörper gegen H. pylori IgG unterstützt mit anderen serologischen Nachweisen und der Beurteilung des klinischen Bildes die Diagnostik des H. pylori Infektionen in erwachsenen Patienten mit klinischen Anzeichen und Symptomen gastrointestinaler Erkrankungen. Informationen zum Test Die kausale Verbindung zwischen einer H. pylori Infektion und peptischen Ulzera wurde gut erforscht, seit es das erste Mal 1983 vorgeschlagen wurde. 1 Eine H.pylori Infektion wird bei über 95% der Patienten mit Zwölffingerdarmgeschwüren, bei 80% der Patienten mit Magenulzera und ist ebenso assoziert mit Magenkarzinomen und Lymphomen. 2-5 Eradikationen von H.pylori Infektionen reduziert das Wiederauftreten von Ulzera. 2-5 Die Behandlung von H.pylori Infektionen wird empfohlen bei Patienten mit Zwölffingerdarmund Magengeschwüren und ebenso bei funktioneller Dyspepsie. 5,6 Die Diagnose von H. pylori beinhaltet sowohl invasive als auch nicht invasive Methoden. Invasive Tests beinhalten die Endoskopie für die direkte Observation vom Antrum des Magens, und für den Erhalt von Biopsien für die Urease Testung, histologische Färbungen (Warthin-Starry) und die Kultur. 5,7 Die Kultur stellt den Goldstandard dar, ist jedoch der am wenigsten sensitive Test (70-80% Sensitivität). Die histologische und die Urease Testung weisen Sensitivitäten und Spezifitäten von über 90% auf. 5 Die wichtigsten Nachteile der invasiven Methoden sind das Risiko und die Unannehmlichkeiten für den Patienten, die hohen Kosten und falsch negative Ergebnisse aufgrund der inselhaften Verteilung des H. pylori im Magen. Nicht invasive Tests beinhalten den Atemtest unter Verwendung von 14 C oder 13 C-markiertem Harnstoff (Urea) und serologische Tests. Der Atemtest ist sensitiv und spezifisch aber teuer. Die Serologie ermöglicht eine kostengünstige, sensitive und spezifische Alternative zu invasiven und/oder teuren Untersuchungen wie die Endoskopie und den 14 C Harnstoff Atemtest. 2,3,5,8,9 Der QUANTA Lite TM H. pylori IgG Kit ist Teil der QUANTA Lite TM Serie der ELISA Kits. Die ELISAs zum Nachweis von H. pylori sind sensitiv und spezifisch. Vorverdünnte Kontrollen und verdünnte Patientenseren werden in die einzelnen Kavitäten pipettiert, um so vorhandenen Antikörpern gegen H. pylori die Bindung an das immobilisierte Antigen zu ermöglichen. Testprinzip Affinitätschromatographisch gereinigtes H. pylori IgG Antigen wurde an die Kavitäten der Polystyrol- Mikrotiterplatte unter Wahrung der ursprünglichen Konfiguration gebunden. Vorverdünnte Kontrollen und verdünnte Patientenseren werden in verschiedene Kavitäten pipettiert. Die vorhandenen H. pylori IgG Antikörper binden an das Antigen. Der Rest der Probe/Kontrolle wird durch Waschen entfernt. Enzymmarkiertes anti-humanes IgG wird in die Kavitäten pipettiert und bindet während einer zweiten Inkubation an den Patienten-Antikörper. Nachdem in einem weiteren Waschschritt das restliche Konjugat entfernt worden ist, wird ein Chromogen-Substrat zugegeben. Die Intensität der entstandenen Farbreaktion wird nach dem Abstoppen mit dem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen. Die quantitative Auswertung erfolgt durch einen Vergleich der Extinktionswerte der Patienten mit dem Wert eines Kalibrators. Inhalt der Testpackung 1. Mikrotiter-ELISA-Platte beschichtet mit hochgereinigtem H. pylori Antigen (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter in Folienverpackung und Trockenmittel 2. ELISA Negative Kontrolle, 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum ohne humane IgG Antikörper gegen H. pylori, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 3. H. pylori IgG ELISA Low Positive (Kalibrator), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum IgG mit Antikörpern gegen H. pylori, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 4. H. pylori IgG ELISA High Positive (positive Kontrolle), 1 Flasche Puffer mit Stabilisator und Humanserum IgG mit Antikörpern gegen H. pylori, gebrauchsfertig vorverdünnt, 1,2 ml 5. HRP Probenverdünner, 1 Flasche rosa gefärbt mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung, Tween 20, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 50 ml 6. HRP Waschkonzentrat, 1 Flasche mit 40fachem Konzentrat rot gefärbt mit gepufferter Kochsalzlösung und Tween 20, 25 ml. Zur Verdünnung bitte das entsprechende Kapitel in der Anleitung beachten. 7. HRP IgG Konjugat, (Ziege), anti-humanes IgG, 1 Flasche blau gefärbt mit Puffer, Proteinstabilisatoren und Konservierungsmittel, 10 ml 8. TMB Chromogen, 1 Flasche mit Stabilisatoren, 10 ml 9. HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure, 1 Flasche farblos, 10 ml Hinweise 1. VORSICHT: Probenverdünner, Kontrollen und Konjugat enthalten 0,02% Chloramphenicol. Es ist im US-Bundesstaat Kalifornien und allgemein bekannt, daß dieser Stoff Krebs verursachen kann. 2. Alle Reagenzien für die Herstellung dieses Tests wurden auf Antikörper gegen HIV, HBsAg und HCV getestet und für negativ befunden. Dennoch sollten alle humanen Kontrollen wie potentiell infektiöses Humanserum oder Blutproben behandelt werden. 10 1

2 3. NaN 3 wird als Stabilisator verwendet. NaN 3 ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen verursachen. Vorsichtig handhaben und Kontakt mit Augen und Haut vermeiden! Den Kontakt mit Metall, basischen Stoffen oder anderen Komponenten, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Bei der Entsorgung von Reagenzien ist daher mit viel Leitungswasser nachzuspülen, um Ansammlungen im Abwassersystem zu verhindern. 4. Das HRP Konjugat enthält eine verdünnte Chemikalie, die bei Einnahme toxisch wirken kann. Daher den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 5. Das TMB Chromogen enthält ein Reizmittel, das bei Inhalation, Einnahme oder Absorbtion durch die Haut gesundheitliche Schäden verursachen kann. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 6. Die HRP Stopplösung besteht aus verdünnter Schwefelsäure. Den Kontakt mit Basen, Metallen und anderen Stoffen, die mit Säure reagieren können, vermeiden. Schwefelsäure ist ein Giftstoff und kann bei Einnahme toxische Reaktionen hervorrufen. Den Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. 7. Die vorgeschriebene persönliche Schutzausrüstung während der Arbeit mit Reagenzien tragen. 8. Verschüttete Reagenzien sofort beseitigen. Bei der Entsorgung von Abfällen alle Umweltvorschriften beachten. Vorsichtsmaßnahmen 1. Dieser Test ist für In-Vitro Diagnostik. 2. Die Verwendung anderer als im Testkit vorhandenen Komponenten kann zu widersprüchlichen Ergebnissen führen. 3. Unvollständiges Waschen und ungenügendes Entfernen der Flüssigkeiten aus den ELISA Kavitäten führt zu einer schlechten Präzision und zu hohen Hintergrund-Extinktionen. 4. Die Adaptation dieses Testsystems auf automatische Probenverarbeitung und andere Instrumentierung, ganz oder teilweise, kann unterschiedliche Ergebnisse zur manuellen Durchführung ergeben. Es liegt in der Verantwortung eines jeden Labors, die automatische Bearbeitung so zu überprüfen, daß Testergebnisse innerhalb akzeptabler Bereiche erzielt werden. 5. Eine Reihe von Faktoren beeinflusst das Testergebnis. Hierzu zählen die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Pipettierung, der Typ des verwendeten Photometers, die Temperatur der Reagenzien, die Umgebungs-Temperatur, die Gründlichkeit des Waschens und der Entfernung der Flüssigkeiten aus den Vertiefungen der ELISA-Streifen, und die Einhaltung der Inkubationszeiten. Es ist deshalb sehr wichtig, für gleichbleibende Bedingungen zu sorgen. 6. Die strikte Einhaltung der Testprozedur wird empfohlen. Jede Änderung im Protokoll erfolgt auf Risiko des Anwenders. 7. Das unvollständige Verschließen der Mikrotiterkavitäten und des Trockenmittels führt zu Antigenabbau und schlechter Präzision. 8. Eine unakzeptabel niedrige Absorption kann beobachtet werden, wenn eine Flasche HRP Konjugat bei zwei- oder mehrfachem Gebrauch über einen längeren Zeitraum benutzt wird. Daher ist es wichtig, die Hinweise zum Umgang mit dem HRP Konjugat genau zu beachten. 9. Chemische Kontamination des HRP Konjugates kann durch unzureichendes Reinigen oder Spülen der Ausrüstung oder der Instrumente verursacht werden. Rückstände gebräuchlicher Laborchemikalien wie z.b. Formalin, Bleichmittel, Ethanol oder Spülmittel führen zum Abbau des HRP Konjugates im Verlauf der Zeit. Das gründliche Spülen der gesamten Ausrüstung und Instrumentierung nach Verwendung chemischer Reinigungsmittel ist daher unbedingt erforderlich. Lagerung 1. Lagerung aller Kit-Reagenzien bei 2-8 C. Nicht einfrieren. Die Reagenzien sind stabil bis zum Ende des Haltbarkeitsdatums bei vorschriftsmäßiger Lagerung und Handhabung. 2. Nicht verwendete Mikrotiterstreifen wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen. 3. Der verdünnte Waschpuffer ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Proben Die Testdurchführung sollte mit Serumproben erfolgen. Werden Azide oder andere Stabilisatoren zu den Serumproben gegeben, können die Ergebnisse nachteilig beeinflusst werden. Mikrobakteriell kontaminierte, hämolytische, lipämische oder durch Hitzeeinwirkung inaktivierte Proben sollten nicht verwendet werden. Nach der Blutentnahme ist das Serum vom Blut zu trennen. Das NCCLS Dokument H18-A2 empfiehlt die folgenden Lagerungsbedingungen für Patientenproben: 1) Proben bei Raumtemperatur nicht länger als 8 Stunden lagern. 2) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 8 Stunden erfolgen, die Proben bei 2-8 C kühl lagern. 3) Kann die Testdurchführung nicht innerhalb von 48 Stunden erfolgen ist die Probe bei -20 C oder niedriger einzufrieren. Eingefrorene Proben müssen nach dem Auftauen und vor der Testung gut geschüttelt werden. Testdurchführung In der Testpackung vorhandenes Material 1 H. pylori IgG ELISA Mikrotiterplatte (12-1 x 8 Kavitäten), mit Streifenhalter 1 1,2 ml vorverdünnte ELISA Negative Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle 1 1,2 ml vorverdünnte H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle 1 50 ml HRP Probenverdünner 1 25 ml HRP Waschkonzentrat, 40faches Konzentrat 1 10 ml HRP IgG Konjugat (von der Ziege), anti-humanes IgG 2

3 1 10 ml TMB Chromogen 1 10 ml HRP Stopplösung, 0,344M Schwefelsäure Zusätzliches benötigtes Material Pipetten für 5, 100, und 500 µl Einmal-Pipettenspitzen Eppendorf-Reaktionsgefäße für die Serumverdünnung, 4 ml Volumen Distilliertes oder deionisiertes Wasser 1 L Gefäß für verdünntes HRP Waschkonzentrat Reader für Mikrotiterplatten mit 450 nm Filter (und 620 nm für eine bichromatische Messung) Methode Testvorbereitung 1. Alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen (20-26 o C) und gründlich mischen. 2. Den gesamten Inhalt (25 ml) des Waschkonzentrats mit 975 ml Aqua dest. mischen (1:40 Verdünnung). Die verdünnte Pufferlösung ist bei 2-8 C eine Woche stabil. Soll nicht die gesamte Mikrotiterplatte auf einmal verwendet werden, so können für einen Ansatz von 16 Kavitäten 2 ml Konzentrat mit 78 ml Aqua dest. gemischt werden. 3. Serumproben 1:101 verdünnen, indem 5 µl Serum mit 500 µl gebrauchsfertigem Probenverdünner gemischt werden. Verdünnte Proben sollen innerhalb von 8 Stunden getestet werden. Die H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle, die H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle nicht verdünnen. 4. Jeder Test benötigt zwei Kavitäten für jede der drei Kontrollen sowie eine oder zwei Kavitäten für die Patientenprobe (Es wird empfohlen, alle Proben in Doppelbestimmung anzusetzen, bis die erforderliche Präzision und Reproduzierbarkeit erreicht sind). Testdurchführung 1. ALLE REAGENZIEN UND PATIENTENPROBEN AUF RAUMTEMPERATUR (20-26 C) BRINGEN. Die entsprechende Anzahl Mikrotiterkavitäten abbrechen. Die Kavitäten im Rahmen befestigen. Die unbenutzten Kavitäten wieder in die Originalverpackung geben, luftdicht verschließen und in den Kühlschrank zurücklegen, um Verdunstung zu minimieren. 2. Je 100 µl der gebrauchsfertigen H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle, der H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle, der ELISA Negative Kontrolle und der verdünnten Patientenproben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Streifen abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Die Inkubationszeit beginnt nach Zugabe der letzten Probe. 3. Waschen: Den Inhalt aller Kavitäten absaugen. Die Kavitäten vollständig ( µl) mit verdünntem HRP Waschpuffer füllen und dann gründlich absaugen. Diesen Waschschritt noch zweimal wiederholen (Insgesamt: drei Waschschritte). Anschließend die Platte auf saugfähigem Papier ausklopfen, um restliche Waschflüssigkeit zu entfernen. Die Waschschritte sind in der selben Reihenfolge wie die Pipettierschritte durchzuführen μl des HRP IgG Konjugates in jede Kavität geben. Sterile Pipetten verwenden! Nur das benötigte Volumen an Konjugat aus der Flasche entnehmen. UNBENUTZTES KONJUGAT NICHT IN DIE FLASCHE ZURÜCKPIPETTIEREN. KONTAMINATIONSGEFAHR!! Abgedeckte Streifen bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren, wie in 2. beschrieben. 5. Waschen: Schritt Nr. 3 wiederholen µl TMB Chromogen in jede Kavität geben. 30 Minuten im Dunkeln bei Raum-temperatur inkubieren µl HRP Stopplösung in jede Kavität pipettieren. Bei der Hinzugabe der Stopplösung dieselbe Reihenfolge und Zeitplan wie bei der Hinzugabe des TMB Chromogens einhalten. Die Mikrotiterplatte vorsichtig schütteln. 8. Die optische Dichte (OD) jeder Kavität bei 450 nm innerhalb einer Stunde nach Abstoppen der Reaktion ablesen. Es wird eine bichromatische Messung mit 620 nm als Referenzwellenlänge empfohlen. Qualitätskontrolle 1. Die H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle, die H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden, um sicher-zustellen, daß alle Reagenzien und der Testansatz insgesamt ordnungsgemäß funktionieren. 2. Da die H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle, die H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle und die ELISA Negative Kontrolle vorverdünnt sind, entfällt der Verdünnungsschritt der Patientenproben für die Kontrollen. 3. Zusätzliche Kontrollen zur Qualitätssicherung können gemäß den Richtlinien nationaler oder internationaler Regulierungs- oder Akkreditierungsbehörden eingesetzt werden. Geeignete Kontrollen können aus Humanserum gewonnen und bei <-20 C gelagert werden. 4. Um sicher zu sein, daß alle Patientenwerte korrekt sind, müssen die nachfolgenden Kriterien erfüllt werden (Wurden ein oder mehrere Kriterien nicht erfüllt, so ist das Ergebnis als ungültig zu betrachten und der Testansatz ist zu wiederholen). a. Die Absorption der vorverdünnten H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle muß größer sein als die Absorption der vorverdünnten H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle. Die Absorption der Low Positive Kontrolle wiederum muß größer sein als die der vorverdünnten ELISA Negativkontrolle. 3

4 b. Die Absorption der vorverdünnten H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle muß größer als 1,0 sein, die Absorption der vorverdünnten Negative Kontrolle darf nicht größer als 0,2 sein. c. Die Absorption der H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle muß mehr als doppelt so hoch sein wie die der ELISA Negative Kontrolle sein oder über 0,25. d. Die ELISA Negative Kontrolle und die H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle dienen der Sicherstellung der ordnungsgemäßen Funktionsweise des Testansatzes. Die H. pylori IgG ELISA High Positive Kontrolle stellt die Präzision am Cut-off des Tests nicht sicher. e. Der Anwender sollte unter anderem das NCCLS Dokument Nr. C24-A für zusätzliche Hinweise zur zeitgemäßen Qualitätskontrolle beachten. Berechnung der Ergebnisse Zunächst sind die Mittelwerte der OD für die Doppelbestimmungen zu berechnen. Alle weiteren Berechnungen werden dann mit den entsprechenden Mittelwerten durchgeführt. Die Reaktivität jeder Patientenprobe wird bestimmt durch die Division des Mittelwertes der Proben-OD durch den Mittelwert der Low Positive Kontrolle und der Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem chargenspezifischen Wert der H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle. Die chargenspezifischen Werte sind auf dem Fläschchenetikett aufgedruckt. OD der Probe Probenwert = x H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrollwert (Units) H. pylori IgG ELISA Low Positive Kontrolle OD Wert (Units) Die Reaktivität verhält sich zur Konzentration der vorhandenen Antikörper nicht linear. Zunahme und Abnahme der Antikörperkonzentrationen von Patienten werden durch einen entsprechenden Anstieg oder Abfall der Reaktivität angezeigt, diese Änderungen sind jedoch nicht proportional (d.h. eine Verdoppelung der Antikörperkonzentration führt nicht zu einer Verdoppelung der Reaktivität). Wird eine genauere Quantifizierung der Patientenantikörper gewünscht, sind serielle Verdünnungen der Probe durchzuführen und der Titer der zuletzt als positiv gemessen wurde, sollte als Patienten-Antikörpertiter bewertet werden. Interpretation der Ergebnisse Dieser ELISA-Test ist sehr sensitiv und in der Lage, sogar kleine Unterschiede in Patientenpopulationen zu messen. Die folgenden Werte dienen als Beispiel für die Interpretation der Testergebnisse. Es wird empfohlen, daß sich jedes Labor seine eigenen Normalwerte, basierend auf eigener Technik, Kontrollen, Ausrüstung und Patientenpopulation erarbeitet. Die Patientenprobe kann anschließend als negativ, (negativ für IgG Antikörper gegen H. pylori), grenzwertig oder positiv (IgG Antikörper gegen H. pylori nachgewiesen) positiv klassifiziert werden. Units Negativ 0,0 20,0 Grenzwertig 20,1 24,9 Positiv >25 Grenzwertige Proben sollten vor der endgültigen Beurteilung nochmals getestet werden. 1. Ein positives Ergebnis indiziert nur eine vorhergegangene immunologische Exposition von H. pylori. Es kann nicht unterschieden werden zwischen einer aktiven und einer inaktiven H. pylori Infektion. Eine aktive Infektion wird mittels Kultur von Biopsiematerial, 13 C Harnstoff Atemtest oder mittels anderer Urease Untersuchungsmethoden nachgewiesen. 2. Bei einer Probe mit grenzwertigen Werten von H. pylori IgG kann kein Antikörperstatus festgelegt werden. Falls das Ergebnis nach einer wiederholten Testung wieder grenzwertig ist, soll das Ergebnis als grenzwertig dokumentiert werden und/oder eine zusätzliche Probe entnommen werden. 3. Eine negative Probe indiziert keine Antikörper gegen H. pylori oder Werte unter der Nachweisgrenze des Testkits. Proben, die zu früh während der Erstinfektion entnommen wurden, können nicht nachweisbare Werte von IgG Antikörpern aufweisen. Falls eine Erstinfektion vermutet wird, sollte eine weitere Probe nach 4-6 Wochen entnommen werden und nochmals mit dem gleichen Test wie die Originalprobe getestet werden. 4. Es wird empfohlen, daß die Ergebnisse, die in einem Labor erstellt werden, folgendes beinhalten: Die folgenden Ergebnisse wurden mit dem INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Kit ermittelt. IgG Werte, die mit Hilfe von Testmethoden verschiedener Hersteller ermittelt wurden, dürfen nicht untereinander ausgetauscht werden. Die Höhe der angegebenen IgG Werte korreliert nicht mit einem Endpunkttiter. Grenzen des Verfahrens 1. Dieser Test dient als Hilfe bei der Diagnose einer H. pylori Infektion. 2. Der Test soll verwendet werden bei Personen mit Symptomen mit Verdacht auf gastrointestinale Erkrankungen und dient nicht zum Gebrauch bei asymptomatischen Patienten. 3. Ein negatives Antikörperergebnis schließt nicht die Anwesenheit von H. pylori aus, da die Konzentration der Antikörper unter der Nachweisgrenze des Tests liegen kann. 4. Negative Ergebnisse können erhalten werden, wenn Proben zu früh während der Infektion entnommen werden, vor dem Auftreten von nachweisbaren Antikörpern. Falls eine H. pylori Infektion vermutet wird, sollten weitere Proben nach 4-6 Wochen entnommen werden und parallel mit der ersten Probe getestet werden. 5. Ein positives Testergebnis läßt nicht die Unterscheidung zwischen einer aktiven Infektion und einer Kolonisierung von H. pylori zu. 4

5 6. Ein positives Testergebnis zeigt nur das Vorhandensein des Antikörpers H. Pylori an und nicht notwendigerweise zeigt an, daß gastro-intestinale Krankheit anwesend ist. 7. Ergebnisse dieses Testes müssen im Zusammenhang mit klinischen Ergebnissen und anderen serologischen Tests verwendet werden. 8. Die Leistungscharakteristika für andere Untersuchungsmaterialien als Serum wurden nicht bestimmt. Erwartungswerte Ein positives Testergebnis indiziert nur die Anwesenheit von Antikörpern gegen H. pylori und indiziert nicht notwendigerweise das Vorhandensein einer gastrointestinalen Erkrankung. Es wird angenommen, dass annähernd 50% der Weltbevölkerung mit H. pylori infiziert ist. In Entwicklungsländern sind 50% und mehr der Bevölkerung in einem Alter von 10 Jahren infziert, während in entwickelten Ländern eine Infektion in der Kindheit selten ist. Die Häufigkeit steigt mit 0,5-1,0% pro Jahr mit ansteigendem Alter (z.b. annähernd 60% Häufigkeit bei einer Gruppe von 60-Jährigen). 3,7,12,13 Normalbereich Zwei Gruppen von asymptomatischen, gesunden Personen (im Alter zwischen 18 und 75), eine aus San Diego, CA und eine aus Buffalo, NY wurden mit dem QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Testkit getestet. 1,8% (1/53) der Seren aus der San Diego Gruppe und 11,3%(11/97) der Seren aus der Buffalo Gruppe waren positiv für H. pylori IgG Antikörper. Die Daten zeigten einen Anstieg in der Häufigkeit mit ansteigendem Alter, wie es aus der Literatur erwartet wurde. Relative Sensitivität und Spezifität Proben der Studien Die Leistung des QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Testkits wurde an einem Panel von 295 klinisch, retrospektiv nachgewiesenen Proben von Patienten, die eine Endoskopie hatten, getestet. Die Anwesenheit einer H. pylori Infection wurde mit Hilfe von Kultur, Histologie und Urease-Schnelltest (CLO-Test) bestimmt. Proben wurden positiv für H. pylori bewertet, wenn sie in der Kultur positiv waren oder wenn sie in zwei von drei Tests positiv waren. Tabelle 1: Sensitivität und Spezifität der klinischen Panel n= 295 INOVA H.pylori IgG Positiv Grenzwert Negativ Clinical POS* n= NEG n= *Probe wurde positiv bewertet, wenn sie in der Kultur positiv war, oder wenn sie im CLO-Test und in der Histologie positiv war. Sensitivität: 94,0% (141/150) Spezifität: 92,0% (126/137) Übereinstimmung: 93,0% (267/287) Hinweis: grenzwertige Ergebnisse wurden von den Berechnungen ausgeschlossen. Obwohl zum Zeitpunkt der Probensammlung Patienten als negativ in der Kultur, Histologie und im CLO-Test beurteilt wurden, besteht der Verdacht, daß bei einigen Patienten bereits vorher eine H. pylori Exposition vorlag, basierend auf einer starken IgG Reaktivität in einigen negativen Proben. Deshalb waren 7 der 11 klinisch negativen Proben positiv im INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA. Diese Proben wurden mit einem ähnlichen zugelassenen H. pylori IgG Test nochmals getestet. In dem kommerziellen Kit waren 6 Proben positiv und eine Proben unbestimmbar. Ergebnisse klinischer Blindstudien an drei Stellen Die Ergebnisse, die von einem Panel von 40 klinischen Blindproben an drei Teststellen ermittelt wurden, erzielt wurden, sind nachfolgend in Tabelle 2 angeführt. Die Spezifität betrug 100% (10/10) an allen drei Stellen. Die Sensitivität betrug 96,3% an Stelle 1, 96,6% an Stelle 2, und 93,1% an Stelle 3. Tabelle 2: QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Sensitivität und Spezifität erzielt an drei Stellen in einer klinischen Blindstudie. Seite 1 Seite 2 Seite 3 Sensitivität N=30 96,3% (26/27) 96,6% (28/29) 93,1% (27/29) Spezifität N=10 100% (10/10) 100% (10/10) 100% (10/10) Totale Übereinstimmung 97,3% (36/37) 97,4% (38/39) 94,9% (37/39) Hinweis: Grenzwertige Ergebnisse sind nicht enthalten. Validierung des Cut-off Der Cut-off dieses Tests wurde durch Testung des klinischen Probenpanels und unter Verwendung ROC (Receiver Operating Characteristics) Analysen des Cut-offs validiert. 11 ROC Analysen ROC Analysen geben eine Einschätzung der diagnostischen Genauigkeit des INOVA H. pylori IgG Tests verglichen mit dem dokumentierten klinischen Status des Patients. Es ermöglicht auch die Validierung des Cut-off eines Tests. 11 Die Analysen unterstützen den Gebrauch von Interpretationsbereichen, die wir für diesen Test erstellt haben. 5

6 Kreuzreaktivitätsstudien Eine Adsorptionsstudie wurde durchgeführt, um eine Kreuzreaktivität von bakteriellen Antigenen mit dem INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Testkit zu evaluieren. Kurz, Seren mit verschiedenen Werten von Antikörpern gegen H. pylori wurden adsorbiert mit entweder H. pylori, C. jejuni, C. coli, C. fetus, oder E. coli Antigenen und wurden dann mit unbehandelten und behandelten Proben im H. pylori IgG Test getestet. Alle H. pylori seropositiven Proben verblieben seropositiv nach Absorption mit anderen Antigenen als H. pylori. Die durchschnittliche Inhibition betrug 82,1% bei Verwendung von H. pylori Antigen und 2,9% wenn Antigene, gewonnen von anderen Organismen, verwendet wurden. Die Anwesenheit von Anti-Nukleären Antikörpern (5 Seren), Rheumatoider Faktor (5 Seren) und Anti-DNA Antikörpern (5Seren) wurde ebenfalls getestet und beeinflusste nicht die Spezifität des INOVA QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Testkits. Interferenz Um zu bestimmen, ob die Anwesenheit hoher Werte von Bilirubin, Cholesterin oder Triglyzeriden in Serumproben mit dem QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Testkit interferieren, wurden zwei Studien durchgeführt. In der ersten wurden 20 Serumproben (6 H. pylori positiv und 14 negativ) getestet, einmal mit und einmal ohne Addition des Bilirubinwertes (40fache des Normalwertes) oder des Hämoglobinwertes (66fache des Normalwertes). In einer zweiten Studie bestehend aus gespikten positiven H. pylori Seren mit Seren mit hohen Werten von Cholesterin, Triglyzeriden oder Bilirubin. Die Ergebnisse zeigten, dass keine dieser Substanzen mit dem QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Testkit interferierten. Präzision und Reproduzierbarkeit Die Variation im Inter-assay wurde bestimmt durch die Testung eines Blindpanels von 14 Proben in Doppelbestimmung, bestehend aus zwei negativen, drei schwach, zwei mittel und einer hoch positiven Probe, sowie der Negativkontrolle, der schwach positiven und hoch positiiven Kontrolle aus dem Testkit zweimal am Tag (einmal in der Früh und einmal am Nachmittag) an drei aufeinanderfolgenden Tag an den drei verschiedenen Teststellen. Tabelle 4: Kombinierte Inter-Assay Durchführung An Drei Stellen Seren R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 NC LPC HPC SRU 46,7 23,8 30,2 46,5 45,6 25 4,2 24, ,6 3,5 4,0 25,8 3,4 4, ,6 SD 2,4 2,3 4,9 2,3 2,5 3,4 2,6 2,9 3,0 8,8 2,7 3,0 2,5 2,8 3,2 0 5 CV% Die Intra-assay Durchführung wurde evaluiert mittels Testung von 6 Proben, bestehend aus einer negativen, grenzwertigen, grenzwertig positiven, schwach positiven, mäßig positiven und einer hoch positiven Probe 15x. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt. Tabelle 5: Intra-assay Testung für QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA Seren 1 Seren 2 Seren 3 Seren 4 Seren 5 Seren 6 Mean 84,03 99,28 31,98 25,96 21,12 2,98 S.D. 3,09 4,21 1,44 1,52 0,91 0,30 C.V.% 3,6 4,2 4,5 5,9 4,3 10,1 Linearität Zur Bestimmung der Linearität des QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA wurden 4 Proben in Serie verdünnt von 1:50 bis 1: und im QUANTA Lite TM H. pylori IgG ELISA getestet. Die Analysenergebnisse zeigten, daß der Test linear von ca Units am unteren Ende bis auf mind. 121 Units am oberen Ende anstiegen. R 2 Werte der 4 verdünnten Seren waren 0,99 oder besser. SRU QUANTA Lite H. pylori IgG ELISA Linearität 1:50 1:200 1:800 1:3200 Verdünnung SRU BL - 63 SRU BL - 77 SRU BL - 95 SRU BL - 96 Linear (SRU BL - 95) Linear (SRU BL - 96) Linear (SRU BL - 63) Linear (SRU BL - 77) y = -18,159x + 138,35 R 2 = 0,9934 y = -10,639x + 86,575 R 2 = 0,9937 y = -13,894x + 119,42 R 2 = 0,9903 y = -15,844x + 120,41 R 2 = 0,9885 6

7 Referenzen 1. Marshall BJ Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet, ii: Walsh JH and Peterson WL The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. N.Engl. J. Med. 333(15): Blaser MJ Helicobacter pylori: its role in disease. Clin. Infect. Dis. 15: The Eurogast Study Group An international association between H. pylori infection and gastric cancer. Lancet 341(8857): NIH Concensus Development Panel on Helicobacter pylori in Peptic Ulcer Disease JAMA 272: Malfertheiner P, et al Current European concept in the mangement of Helicobacter pylori infection- the Maastricht concensus report. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 9: Hirschl AM, et al Kinetics of specific IgG antibodies for monitoring the effect of anti- Helicobacter pylori chemotherapy. J. Infect. Dis. 168: Bourke B, Jones N, and Sherman P Helicobacter pylori infection and peptic ulcer disease in children. Ped. Infect. Dis. J. 15: Patel P, et al Prospective screening of dyspeptic patients by Helicobacter pylori serology. Lancet 346: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. 11. National Committee for Clinical Laboratory Standards Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests using receiver operating characteristic (ROC) Plots; approved guideline (NCCLS document GP10-A), Wayne, PA. 12. Megraud F, et al Seroepidemiology of Campylobacter pylori infection in various populations. J. Clin. Microbiol. 27: Veldhuyzen SJO, et al Increasing prevalence of H. pylori infection with Age: Continuous risk of infection in adults rather than cohort effect. J. Infect. Dis. 169: Hersteller: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Autorisierter Repräsentant: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service DEU November 2009 Revision 4 7