1,25-Dihydroxy-Vitamin D ELISA

Transkript

1 Arbeitsanleitung,25DihydroxyVitamin D ELISA Immunenzymetrisches Assay für die quantitative Bestimmung von,25(oh)2 Vitamin D im Serum. MG Nur zur allgemeinen Veranschaulichung. Den Assay nur mit der mitgelieferten Arbeitsanleitung durchzuführen. Distributed by: I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 DEUTSCH Vor Gebrauch des Kits lesen Sie bitte diese Packungsbeilage.,25(OH) 2 Vitamin D ELISA I. VERWENDUNGSZWECK Immunenzymetrisches Assay für die quantitative Bestimmung von,25(oh) 2 Vitamin D im Serum. II. ALLGEMEINE INFORMATION A. Handelsbezeichnung: B. Katalognummer:,25DihydroxyVitamin D ELISA MG5905 III. KLINISCHER HINTERGRUND A. Biologische Aktivität Vitamin D wird vorwiegend in der Haut aus 7Dehydrocholesterin synthetisiert und stammt teilweise aus der Nahrung und Nahrungsergänzung. Durch Hydroxylierung auf Kohlenstoff 25 in der Leber entsteht das Zwischenprodukt 25OH Vitamin D. Dieses wird weiter verstoffwechselt, bevor es die Aufgaben des Vitamin D für Darm, Nieren, Knochen und andere Organe und Gewebe erfüllen kann. Diese Folgereaktion findet in den Nieren und anderen Geweben statt. So wird das 25OH Vitamin D in der αposition weiter hydroxyliert, sodass α,25dihydroxyvitamin D (,25(OH) 2 Vitamin D) entsteht. Neben den oben genannten Geweben können auch die Plazenta von Schwangeren und MakrophagenZellen im Fall einer Sarkoidose eine gewisse Menge von,25(oh) 2 Vitamin D bilden.,25(oh) 2 Vitamin D ist im Hinblick auf die bekannten Funktionen die aktive Form des Vitamin D, während ausgeschlossen werden kann, dass 25OH Vitamin D und Vitamin D selbst physiologisch funktional sind.,25(oh) 2 Vitamin D stimuliert die Aufnahme von Kalzium und Phosphor in den Darm. Darüber hinaus regt es die Knochenresorption und mineralisierung an und beugt so der Entstehung von Rachitis und Osteomalazie vor.,25(oh) 2 Vitamin D ist auch in anderen Geweben, die für den Transport von Kalzium zuständig sind (Plazenta, Niere, Brustdrüse usw.), sowie in endokrinen Drüsen wie den Nebenschilddrüsen aktiv.,25(oh) 2 Vitamin D wird rasch metabolisiert, und seine Halbwertszeit im Plasma liegt bei etwa 2 Stunden. Sein Hauptmetabolit ist die Calcitroidsäure, ein C23KarboxylDerivat, welches eigentlich ohne irgendeine biologische Aktivität ist. Zusätzlich zu diesem Weg unterliegt das,25(oh) 2 Vitamin D auch einer 24Hydroxylierung, damit,24,25trihydroxyvitamin D gebildet wird. Diese Verbindung hat eine geringere biologische Aktivität als seine Eltern, und diese metabolische Route ist als ein unbedeutender Weg zu betrachten. Die Konzentrationen von,25(oh) 2 Vitamin D in Plasma oder Serum sind 00 bis 000fach geringer als diejenigen von 25OH Vitamin D. Aufgrund dieser geringen Konzentrationen und der Anwesenheit zahlreicher ähnlicher Metaboliten erfordert die Bestimmung des,25(oh) 2 Vitamin D Extraktion sowie eine Separation durch Säulenchromatografie. B Klinische Anwendung Die Messung des zirkulierenden,25(oh) 2 Vitamin D ist bei verschiedenen den Kalziumstoffwechsel betreffenden Erkrankungen angezeigt, darunter Phosphatdiabetes, Sarkoidose, Nierenversagen, Über bzw. Unterfunktion der Schilddrüsen, Rachitis, tumorvermittelte Hyperkalzämie, Hyperkalziurie, vitaminresistente Mangelfunktion und Behandlung mit antikonvulsiven Medikamenten.

3 IV. GRUNDSÄTZE DER METHODE Es werden nur Proben und Kontrollen und nicht die Kalibratoren mit einem Lösungsmittelgemisch extrahiert und auf Kartuschen aufgetragen, um,25(oh) 2 Vitamin D von den anderen VitaminDMetaboliten zu trennen. Nach der Eluierung des,25(oh) 2 Vitamin D aus den Proben und Kontrollen werden Kalibratoren, eluierte Proben und eluierte Kontrollen direkt in mit Anti,25(OH) 2 Vitamin DAntikörpern beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert. Nach Inkubation über Nacht bei 4 C wird die Mikrotiterplatte gewaschen, und die Arbeitskonjugatlösung wird hinzugefügt und eine Stunde lang bei 4 C inkubiert. Die Mikrotiterplatte wird gewaschen, um die Verdrängungsreaktion zu stoppen. Danach wird die Farblösung (TMB) hinzugefügt und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe einer Stopplösung angehalten, und die Mikrotiterplatte wird bei der geeigneten Wellenlänge gelesen. Die Menge an,25(oh) 2 Vitamin D wird kolorimetrisch durch Messung der Absorption bestimmt, die umgekehrt proportional zur,25(oh) 2 VitaminD Konzentration ist. Es wird eine Kalibrationskurve gedruckt, und die,25(oh) 2 VitaminD Konzentrationen der Proben werden über DosisInterpolation der Kalibrationskurve bestimmt. V. MITGELIEFERTE REAGENZIEN Reagenzien 96 Test Kit Farbcode Rekonstitution Mikrotiterplatte mit 96 mit Anti,25(OH) 2 Vitamin D Antikörpern beschichteten brechbaren Kavitäten CONJ CONC,25(OH) 2Vitamin D Konzentriertes Konjugat HRP Konzentriertes HRP Kalibratoren N = 0 bis 5 (für genaue Werte siehe etiketten) in Phosphatpuffer mit Rindercasein und Gentamycin WASH SOLN CONC Waschlösung (TRISHCl) Kontrollen N = oder 2 in Humanplasma und Gentamycin Inkubationspuffer mit Proclin Konjugatpuffer mit Casein und Proclin ELU CAL CONTROL INC CONJ K SOLN Eluierungslösung: enthält Methanol CHROM MOM Farblösung TMB (Tetramethylbenzydin) STOP Stopplösung HCl.5 N CONC N N BUF BUF TMB SOLN 96 Kavitäten ml 0,2 ml 6 lyophilisiert 0 ml 2 lyophilisiert 20 ml 30 ml 25 ml 25 ml 2 ml blau blau gelb gelb braun silber grün rot weiß braun 40 x mit Konjugatpuffer verdünnen 200 x mit Konjugatpuffer verdünnen ml destilliertes Wasser hinzufügen 200 x mit destillierten Wasser verdünnen (Magnetrührer verwenden) 2 ml destilliertes Wasser hinzufügen Klebestreifen Silikakartuschen Bemerkung: Verwenden Sie den NullKalibrator zur Verdünnung der Proben mit Werten über dem höchsten Kalibrator (vor Separationsschritt verdünnen). VI. NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Folgendes Material wird benötigt, aber nicht mit dem Kit mitgeliefert: Destilliertes Wasser 2 Diisopropylether ( für Analyse ; GCReinheit 99 %) 3 Cyclohexan ( für Analyse ; GCReinheit 99,5 %) 4 Ethylacetat ( für Analyse ; GCReinheit 99,5 %) 5 Ethanol absolut ( für Analyse ; GCReinheit 99,9 %) 6 Dichlormethan ( für Analyse ; GCReinheit 99,8 %) 7 Pipetten für: µl, 00 μl, μl, 200 µl, ml und 2 ml (Verwendung von Präzisionspipetten mit Einwegpipettenspitzen aus Kunststoff wird empfohlen). 8 Glasröhrchen (2 x 75 mm) für Extraktion und Eluierung (für Extraktionsschritt mit Verschluss). 9 Glasröhrchen (6 x 00 mm) oder (2 x 20 mm) oder Polypropylenröhrchen (Falcon 2097) für das Waschen der Kartuschen. 0 Vortexmixer Magnetrührer 2 Zentrifuge für Betrieb mit 800 g 3 Mikrotiterplattenleser zum Lesen bei 4 nm und 6 nm (bichromatisches Ablesen) VII. PLATE GEL VORBEREITUNG DER REAGENZIEN A. Kalibratoren: Rekonstituieren Sie die Kalibratoren mit ml destilliertem Wasser (gerade vor dem Inkubationsschritt). B. Kontrollen: Rekonstituieren Sie die Kontrollen mit 2 ml destilliertem Wasser. C. HRPArbeitskonjugatlösung:! Die HRPArbeitskonjugatlösung muss unbedingt eine Stunde vor dem Zugeben der Lösung in der Platte vorbereitet werden! Bereiten Sie eine entsprechende Menge der HRPArbeitskonjugatlösung durch Mischen des konzentrierten Konjugats, des konzentrierten HRP und des Konjugatpuffers je nach Anzahl der verwendeten Streifen gemäß nachstehender Tabelle zu: z. B. für 6 Streifen (48 Kavitäten): 2 µl konzentriertes Konjugat und µl konzentriertes HRP zu 0 ml Konjugatpuffer. Mit einem Vortexmixer homogenisieren. Das HRPKonjugat bei Raumtemperatur aufbewahren und direktes Sonnenlicht vermeiden oder ein braunes Glasgefäß zu seiner Vorbereitung verwenden. Anzahl Streifen COVER Menge an Konzentriertem Konjugat (µl) D. Arbeitswaschlösung: Zur Vorbereitung einer angemessenen Menge an Arbeitswaschlösung 99 Volumen destilliertes Wasser zu Volumen Waschlösung geben (200 x) Mit einem Magnetrührer homogenisieren. Überflüssige Arbeitswaschlösung nach jedem Arbeitstag entsorgen Menge an Konzentriertem HRP (µl) Bei Raumtemperatur lagern Menge an Konjugatpuffer (ml)

4 E. Extraktionslösungsmittel: Für jede zu testende Kontrolle oder Probe sind 2 ml erforderlich. Vorbereitung einer frischen Lösung aus Diisopropylether, Cyclohexan und Ethylacetat (, 40, 0 V/V). Achtung: Die genauen Mengenanteile sind strengstens zu beachten. F VIII. Waschlösung: Für jede Kontrolle oder Probe ist ml erforderlich. Vorbereitung einer frischen Lösung aus Diisopropylether, Cyclohexan, Ethylacetat und Ethanol absolut (, 40, 0/ V/V). Achtung: Die genauen Mengenanteile sind strengstens zu beachten. AUFBEWAHRUNG UND VERFALLDATUM DER HALTBARKEIT DER REAGENZIEN Vor dem Öffnen oder Rekonstituieren sind alle Kitkomponenten bei 2 bis 8 C bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfalldatum haltbar; ausgenommen hiervon sind die Kartuschen, die bei Raumtemperatur zu lagern sind. Nach ihrer Rekonstitution sind Kalibratoren 4 Wochen bei 28 C haltbar. Für längere Aufbewahrungszeiten sind sie zu aliquotieren und einzufrieren und bei 20 C maximal 4 Monate aufzubewahren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Nach ihrer Rekonstitution sind Kontrollen 3 Tage bei 28 C haltbar. Für längere Aufbewahrungszeiten sind sie zu aliquotieren und einzufrieren und bei 20 C maximal Monat aufzubewahren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Die frisch hergestellte Waschlösung sollte am selben Tag aufgebraucht werden. Das HRPArbeitskonjugat nach seiner Verwendung entsorgen. Es wird empfohlen, Extraktions und Waschlösungsmittel jeweils frisch herzustellen und nicht zu lagern. Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können auf Instabilitätbzw. Zerfall hindeuten. IX. PROBENSAMMLUNG UND VORBEREITUNG Der Kit eignet sich für Serumproben. Serumproben müssen bei 28 C aufbewahrt werden. Falls der Test nicht innerhalb von 24 Std. durchgeführt wird, müssen die Proben aliquotiert und bei 20 C aufgehoben werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Nach dem Auftauen müssen die Proben auf dem Vortex gemischt und zentrifugiert werden. X. DURCHFÜHRUNG I. Extraktionsschritt:! Nur für Kontrollen und Proben!. Glasröhrchen (2 x 75 mm) für die Extraktion beschriften: 2 Kontrollen und bis zu 40 Proben. 2. In die jeweiligen Röhrchen 0,5 ml Kontrolle oder Probe pipettieren ml Extraktionslösungsmittel in alle Röhrchen geben. 4. Röhrchen mit Verschluss schließen und Stunde auf einem Schüttler (200 rpm) inkubieren. 5. Alle Röhrchen 5 min. bei Raumtemperatur (800 g) zentrifugieren. 6. Für den nächsten Separationsschritt Überstände verwenden. II. Separationsschritt:! Nur für Kontrollen und Proben!. Glasröhrchen (6 x 00 mm) oder (2 x 20 mm) oder Polypropylenröhrchen (Falcon 2097) für das Waschen der Kartuschen beschriften: 2 Kontrollen und bis zu 40 Proben. 2. In jedes Röhrchen eine Silikakartusche geben. 3.,6 ml des Überstandes (2 x 0,8 ml) aus dem Extraktionsschritt auf die Kartuschen tragen. Durch Schwerkraft passieren lassen. 4. Kartuschen mit ml Waschlösungsmittel (vgl. Reagenzienvorbereitung) waschen.! Niemals Vakuum an die Kartuschen anlegen, sondern Lösungsmittel allein durch Schwerkraft passieren lassen μl Dichlormethan auf die Kartuschen pipettieren; durch Schwerkraft passieren lassen µl destilliertes Wasser auf jede Kartusche geben und alle Röhrchen 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (800 g) zentrifugieren. 7. Glasröhrchen (2 x 75 mm) für das Eluieren von,25(oh) 2 Vitamin D beschriften. Kartuschen nach dem Zentrifugieren in die entsprechenden Glasröhrchen übertragen μl Eluierungslösung auf jede Kartusche tragen, um,25(oh) 2 Vitamin D zu eluieren, und 5 Min. bei Raumtemperatur (800 g) zentrifugieren. 9. Die eluierte Fraktion vortexmischen. Bemerkung: Nach diesem Schritt müssen die Proben unverzüglich in die beschichtete Röhrchen überführt werden, um einen Abbau zu vermeiden. III. Inkubationsschritt:. Wählen Sie die erforderliche Anzahl von Streifen für den Durchgang. Die nicht verwendeten Streifen sollten wieder mit einem Trocknungsmittel in einem Beutel verschlossen und bei 28 C aufbewahrt werden. 2. Die Streifen im Halterahmen befestigen. 3. Rekonstituierte Kalibratoren, extrahierte Kontrollen und extrahierte Proben kurz vortexen. 4. µl Inkubationspuffer in ale Kavitäten pipettieren. 5. µl von jedem Kalibrator (nicht extrahiert), eluierte Kontrollen und eluierte Proben in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. 6. 8±2 Stunden bei 28 C inkubieren. Platte mit einem Deckel oder einer Folie abdecken. HRPArbeitskonjugatlösung 60 Min. +/ 5 Minuten vor dem Waschen der Kavitäten nach der Übernachtinkubation vorbereiten. 7. Flüssigkeit aus jeder Kavität absaugen. Platte drei Mal wie folgt waschen: 0,35 ml Waschlösung in jede Kavität geben und Inhalt aus jeder Kavität absaugen µl HRPArbeitskonjugatlösung in jede Kavität pipettieren. 9. Stunde bei 4 C inkubieren. Platte mit einem Deckel oder einer Folie abdecken. 0. Flüssigkeit aus jeder Kavität absaugen. Platte drei Mal wie folgt waschen: 0,35 ml Waschlösung in jede Kavität geben und Inhalt aus jeder Kavität absaugen.. Binnen 5 Minuten nach dem Waschschritt 200 µl der Farblösung in jede Kavität pipettieren. 2. Mikrotiterplatte 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, dabei direktes Sonnenlicht vermeiden µl Stopplösung in jede Kavität pipettieren. 4. Absorption bei 4 nm (Referenzfilter 630 nm oder 6 nm) binnen Stunde ablesen und Ergebnisse wie in Punkt XI beschrieben berechnen. XI. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE. Platte bei 4 nm unter Vergleich mit einem Referenzfilter von 6 nm (oder 630 nm) ablesen. 2. Den Durchschnitt aus den Doppelbestimmungen berechnen. 3. Für die Erstellung der Kalibrationskurve wird die Verwendung von computergestützten Methoden empfohlen. Die bevorzugte Methode ist die 4Parameter Kurvenfunktion. Offensichtliche Ausreißer ausschließen. 4. Die,25(OH) 2 VitaminDKonzentrationen der Proben über Interpolation der ODProbenwerte aus der Kalibrationskurve bestimmen. XII. TYPISCHE WERTE Die folgenden Daten dienen nur zu Demonstrationszwecken und können nicht als Ersatz für die Echtzeitkalibrationskurve verwendet werden.,25(oh) 2 Vitamin D ELISA Kalibrator: 0 pg/ml 3 pg/ml 2 pg/ml pg/ml 20 pg/ml 80 pg/ml Anmerkung: pg/ml = 2,4 pmol/l ODEinheiten 2,93 2,52,85, 0,57 0,36 XIII. LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN A. Nachweisgrenze Zwanzig NullKalibratoren wurden zusammen mit einem Satz anderer Kalibratoren gemessen. Die Nachweisgrenze, definiert als die scheinbare Konzentration bei zwei Standardabweichungen unterhalb des gemessenen OD Werts bei Nullbindung, entsprach 0,8 pg/ml. B. Spezifität Die Kreuzreaktivität des,25(oh) 2 Vitamin D ELISA Assay wurde durch Testen von Seren mit dotierten und nichtdotierten Kreuzreaktionsmitteln bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst:

5 Verbindung und Konzentration KreuzReaktivität Hinzugefügtes,25(OH)2Vitamin D WIEDERFINDUNGSTEST Wiedergefunden,25(OH)2Vitamin D Wiedergefunden,25(OH) 2VitaminD3 bei 200 pg/ml,25(oh) 2VitaminD2 bei 200 pg/ml 25OHVitaminD3 bei µg/ml 25OHVitaminD2 bei µg/ml 24,25(OH) 2VitaminD3 bei 200 ng/ml 25,26(OH) 2VitaminD3 bei 400 ng/ml Die Auswirkung potenziell störender Substanzen auf Proben wurde mit dem,25(oh) 2 Vitamin D ELISA Test beurteilt. Verschiedene Konzentrationen von Hämoglobin, Bilirubin (konjugiert und unkonjugiert), Triglycerid und Vitamin C in Serumproben wurden an Proben mit unterschiedlicher,25(oh) 2 VitaminD Konzentration getestet. Das Annahmekriterium war eine Störung von weniger als 5 %. Die Leistung des,25(oh) 2 Vitamin D ELISA wurde durch die getesteten Substanzen nicht beeinflusst. Substanz Hämoglobin Bilirubin konjugiert Bilirubin unkonjugiert Triglycerid Vitamin C C. Präzision,25(OH) 2 VitaminD Konzentration der Störsubstanz (mg/dl) INTRAASSAY PRÄZISION Probe N <X> ± SD A B ± ± 8.7 CV Abweichung zum Durchschnitt % 5.0% 2.3% 0.4%.0% 4.9% INTERASSAY PRÄZISION Probe N <X> ± SD A B SD: Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient D. Genauigkeit ± ± 4.6 CV Die Probe wurde vor dem Extraktionsschritt mit NullKalibrator verdünnt. VERDÜNNUNGSTEST Probenverdünnung Theoretische Konzentration Gemessene Konzentration / Steigung Schnittpunkt Y Achse R Wiederfindungsrate 00 / / / Umrechnungsfaktor: Von pg/ml in pmol/l: x 2,4 Von pmol/l in pg/ml: x 0,42 Laut unserem Wissen gibt es keine internationale Referenzen zu diesen Parametern. XIV. INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE Entsprechen die Ergebnisse für Kontrolle und/oder Kontrolle 2 nicht den auf den angegebenen SollWerten, können die Werte, ohne treffende Erklärung der Abweichungen, nicht weiterverarbeitet werden. Falls ExtraKontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen eigenen Pool herstellen, der in Aliquots eingefroren werden sollte. Kontrollen, die Azid enthalten, stören die enzymatische Reaktion und dürfen nicht verwendet werden. Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf Guter Laborpraxis beruhen. Es wird empfohlen, dass Kontrollen routinemäßig als unbekannte Proben untersucht werden, um die Zuverlässigkeit des Assays zu bestimmen. Die Leistung des Assays sollte mit Qualitätskontrollencharts der Kontrollen überwacht werden. Es gilt als gute Praxis, visuell die vom Computer gewählte Kurvenanpassung zu prüfen. XV. ZU ERWARTENDE BEREICHE Diese Werte sind nur Richtwerte; jedes Labor muss seinen eigenen Normalwertbereich ermitteln. Mit dem Elisa Assay getesteten Proben lagen zwischen 9,3 und 53,8 pg/ml. Bei Patienten mit Nierenversagen (n = 20) lag der Wert < 6,9 pg/ml. XVI. VORSICHTMASSNAHMEN UND WARNUNGEN Sicherheit Nur für in vitro Diagnostik. Die menschlichen Blutkomponenten in diesem Kit wurden mit europäischen und/oder in USA erprobten FDAMethoden getestet, sie waren negativ für HBsAg, antihcv und antihiv und 2. Keine bekannte Methode kann jedoch vollkommene Sicherheit liefern, dass menschliche Blutbestandteile nicht Hepatitis, AIDS oder andere Infektionen übertragen. Deshalb sollte der Umgang mit Reagenzien, Serum oder Plasmaproben in Übereinstimmung mit den lokalen Sicherheitsbestimmungen erfolgen. Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern, in denen BSE nicht nachgewiesen wurde. Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potentiell ansteckend behandelt werden. Vermeiden Sie Hautkontakt mit den Reagenzien, die Stopplösung enthält HCl. Bei Kontakt gründlich mit Wasser waschen. Bitte im Arbeitsbereich nicht rauchen, trinken, essen oder Kosmetika anwenden. Nicht mit dem Mund pipettieren. Schutzkleidung und Wegwerfhandschuhe tragen. XVII. LITERATUR. Bouillon R.A., Auwerx J.D., Lissens W.D. and Pelemans W.K. (987). Vitamin D status in eldery; season substrate deficiency causes,25 dyhydroxycholecalciferol deficiency. Am. J. Clin, Nutr., 45: Iqbal, S.J. (994). Vitamin D metabolism and the clinical aspects of measuring metabolites. Ann. Clin. Biochem., 3: Mawer E.B. (980). Clinical implications of measurements of circulating vitamin D metabolites. Clinics in Endocr. Metabol., 9: Jongen M.J.M., Van Ginkel F.C., Vander Vijgh W.J.F., Kuiper S., Netelenbos J.C. and Lips P; (984). An international comparison of Vitamin D metabolites measurements. Clin. Chem., 30: Deluca H.F. (979). The Vitamin D system in the regulation of calcium and phosphorus metabolism. Nutritional Rev., 37: Haussler, M.R., McCain, T.A. (977). Basic and clinical concepts related to Vitamin D metabolism and action. N. Engl. J. Med., 297: Pike J.W., Lee S.M., Meyer M.B. (204). Regulation of gene expression by,25dihydroxyvitamin D3 in bone cells: exploiting new approaches and defining new mechanisms. BoneKEy Reports, 3:482.

6 8. Hollis B.W. (200). Assessment and Interpretation of Circulating 25 Hydroxyvitamin D and,25dihydroxyvitamin D in the Clinical Environment. Endocrinol. Metab. Clin. North Am., 39(2): 27 contents. XVIII. ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLS KALIBRATOREN µl PROBE(N) KONTROLLEN µl EXTRAKTION Kalibratoren Proben / Kontrollen Extraktionslösungsmittel Schütteln Zentrifugierung Stunde bei 200 rpm 5 Minuten (800 g) SEPARATION Überstand aus dem Extraktionsschritt KARTUSCHE Überstand Waschlösungsmittel Dichlormethan Destilliertes Wasser Zentrifugierung Eluierungslösung Zentrifugierung μl 000 μl 0 μl 0 μl 5 Minuten (800 g) 300 μl 5 Minuten (800 g) Vortex INKUBATIONSSCHRITT In Mikrotiterplatte Inkubationspuffer Kalibratoren Extrahierte Proben µl µl µl µl Platte mit einem Deckel oder einer Folie abdecken. 8 ± 2 Stunden (über Nacht) bei 4 C (28 C) inkubieren. HRPArbeitslösung Stunde vor dem nächsten Schritt vorbereiten. Inhalt aus jeder Kavität absaugen. 3 Mal mit 3 µl Waschlösung waschen und absaugen. HRPArbeitskonjugat 200 µl 200 µl Platte mit einem Deckel oder einer Folie abdecken und Stunde bei 4 C (28 C) inkubieren. Inhalt aus jeder Kavität absaugen. 3 Mal mit 3 µl Waschlösung waschen und absaugen. TMB 200 µl 200 µl 5 Minuten bei Raumtemperatur (8 C bis 25 C) inkubieren. Stopplösung 00 µl 00 µl Auf einem Mikrotiterplattenleser ablesen. Die Absorption jeder Kavität bei 4 nm (im Vergleich zu 630 oder 6 nm) verzeichnen. Revisionsnummer: 20/ Versionsstand:

7 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθμόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBLInternational.com WEB: Symbols Version 4.5 /