CRP ELISA. Enzymimmunassay zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein in humanem Serum und Plasma.
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- Dennis Seidel
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1 Arbeitsanleitung CRP ELISA Enzymimmunassay zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein in humanem Serum und Plasma. EU C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunassay zur quantitativen Bestimmung von C-reaktivem Protein in humanem Serum und Plasma. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG C-reaktives Protein (CRP) ist ein Akut-Phasen-Protein, das ausschliesslich von der Leber produziert wird. Interleukin-6 (IL-6) beschleunigt die Synthese der Hepalozyten von CRP, einem Pentamer von circa 120'000 Dalton. Bei gesunden Menschen beträgt die CRP-Konzentration im Serum bis zu 5mg/l. Das Protein wird im Fötus und im Neugeborenen produziert und ist nicht plazentagängig, somit kann es für die Früherkennung von Säuglingssepsis eingesetzt werden. Da Fieberzustand, Leukozytenzahl und Sedimentationsgeschwindigkeit oft zu falschen Schlüssen führen, bevorzugen Forscher und Kliniken zurzeit die quantitative CRP-Bestimmung zur Erkennung von akuter Entzündung und Nekrosen. Innerhalb von 6 Stunden eines akuten Entzündungsproblems beginnt die CRP Konzentration zu steigen. Die CRP-Konzentration im Serum steigt in beiden Fällen von infektiösen und nicht infektiösen Entzündungen, Gewebeschäden, und Vorkommen von malignen Tumoren stark an. CRP ist vorhanden in aktiven Stadien der Entzündungserkrankung wie rheumatische Arthritis, ankylosing Sponclylosis, Reiter s Syndrome, Psoriatric Arthropathy, Systemic Lupus Erythematosus, Polyartritis, ulcerative Colitis und Morbus Krohn. Bei Verletzungen, die das Gewebe beschädigen oder eine Nekrose bewirken, steigt die CRP-Konzentration im Serum ebenfalls an. Dies ist bei Verbrennungen, grossen Operationen und Myokardinfarkten der Fall. Sich ausdehnende bösartige Krankheiten wie Lungen-, Magen-, Dickdarm-, Brust-, Prostata- oder Bauchspeicheldrüse, Hodgkin Krankheit, Non-Hodgin-Lymphom und Lymphosarkom lassen die CRP-Werte ansteigen, weil die sich ausbreitenden Tumorzellen das Gewebe zerstören. Aus diesem Grund eignet sich der CRP-Test zur Überwachung der Malignität. Der CRP - Wert steigt dramatisch bei mikrobiologischen Infektionen und ist besonders wichtig für die Diagnose und Überwachung von bakteriellen Blutvergiftungen beim Neugeborenen und anderen immungeschwächten Risiko-patienten. Bei den Kindern ist CRP nützlich für die verschiedenen Diagnosen von bakterieller und viraler Meningitis. Da die biologische Halbwertzeit dieses Proteins nur 24 Stunden beträgt, spiegelt CRP genau die Entwicklung des Infektionsprozesses wieder. Ausserdem nimmt die CRP-Konzentration wesentlich schneller ab als die Blutkörperchensenkungsreaktion (ESR) oder andere Parameter zur Messung der akuten Phase, was insbesondere bei der Überwachung der sachgemässen Behandlung bakterieller Krankheiten mit Antibiotika von grossem Nutzen ist. Messungen des C-reaktiven Proteins in der frühen und späten postoperativen Phase von Knochenmarkund Organtransplantationen sind besonders nützlich immungeschwächten Patienten. 3. TESTPRINZIP Mikrotiterstreifen, die mit anti-crp Antikörper beschichtet sind, werden mit verdünnten Standardseren und Patientenproben inkubiert. Während der Inkubationsphase bindet sich CRP an die Vertiefungen des Probenstreifens. Nachdem die ungebundenen Serumproteine durch Waschen entfernt wurden, wird der Antigen-Antikörper Komplex in jeder Vertiefung durch anti-crp spezifische Peroxidase-konjugierte Antikörper erkannt. Nach Entfernung des ungebundenen Peroxidase-Konjugats werden die Probestreifen in einer Substratlösung inkubiert, welche Tetramethylbenzidin und Wasserstoffperoxid enthält. Eine Blaufärbung zeigt die Enzymaktivität des an die Vertiefung gebundenen Enzyms an. Die Enzymreaktion wird durch Hinzufügen von 2N H 2 SO 4 gestoppt, und die Absorptionswerte werden bei 450-nm gemessen. Für jeden Test wird eine Standardkurve erstellt, indem die Absorptionswerte und die entsprechenden Standardwerte in ein Achsenkreuz eingetragen werden. Die CRP-Konzentration der Patientenproben wird durch Interpolation mit den entsprechenden Standardkurven bestimmt. Version CRP06-16 (01) 1 / 6
3 4. REAGENZIEN 1. MTP Beschichtete Mikrotiterstreifen 12x8 Vertiefungen beschichtet mit Kaninchen Antikörper gegen Human CRP. 2. CAL A-E Standard A-E 5 Fläschchen, jedes enthält 1/10 vorverdünnte CRP Standardlösungen (0.2mL): 0, 5, 25, ug/ml. Kalibriert gegen NIBSC 1st International Standard, 85/506. Enthält 0.09 % NaN 3 und antimikrobiologische Wirkstoffe. 3. ENZCONJ Enzymkonjugat 1 Fläschchen, enthaltend Peroxidase konjugierte monoklonale anti-human CRP Antikörper (12mL). Enthält antimikrobiologische Wirkstoffe und einen inerten roten Farbstoff. 4. SAMPLEDIL CONC Proben-Verdünnungspuffer 1 Fläschchen, enthalten 40mL 5x konzentrierten Verdünnungspuffer. Schutz: 0.09 % NaN 3 und antimikrobiologische Wirkstoffe und einen inerten grünen Farbstoff. 5. WASHBUF CONC Waschlösung 1 Fläschchen enthaltend 50 ml 20 x gepufferte konzentrierte Waschlösung. 6. TMB SUBS TMB Substratlösung 1 Fläschchen enthaltend 15mL einer Lösung mit H 2 O 2 und Tetramethylbenzidin. 7. TMB STOP Stoplösung 1 Fläschchen enthaltend 12 ml 2N H 2 SO 4 5. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL 1. Präzisionsmesspipetten und laboratoriumsübliche Pipetten. 2. Saubere laboratoriumsübliche Messbecher aus Glas 3. Saubere Reagenzröhrchen zur Verdünnung der Proben und Standardseren. 4. Lesegerät für Mikrotiterplatten für die Absorptionsmessung bei 450-nm. 5. Vortex-Mischer 6. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 7. Bidest. oder deionisiertes Wasser Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 6. WARNUNG UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Die Tests sind ausschließlich für den Gebrauch als in-vitro Diagnostikum bestimmt. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 5. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 6. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 7. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 8. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. Version CRP06-16 (01) 2 / 6
4 9. Beim Test auf Hepatitis B Oberflächen-Antigen, HCV und HIV reagierte das zur Herstellung von Standardseren benützte Humanblut negativ. Da keine bekannte Testmethode die absolute Sicherheit bieten kann, dass aus Humanblut hergestellte Präparate weder Hepatitis noch andere Viruskrankheiten übertragen, sollten diese Standardseren als potentiell ansteckendes Material betrachtet werden. Aus diesem Grund sollten Patientenproben und sämtliches Material, das zur Durchführung des Tests benutzt worden ist, anschliessend nach den geltenden Bestimmungen entsorgt werden. 10. Keine Reagenzien oder beschichtete Mikrotiterstreifen aus Packungen mit verschiedenen Lotnummern mischen. 11. Einige Packungsbestandteile enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Dies erfordert die Beachtung der gesetzlichen Vorschriften im Umgang mit Natriumazid. Um die Bildung explosiver Blei- oder Kupferazide in den Abflüssen zu vermeiden, sollten diese nach dem Wegschütten der Lösungen mit reichlich Wasser nachgespült werden. 7. LAGERUNG 1. Bei 2-8 C lagern. 2. Die Mikrotiterstreifen zusammen mit dem Trockenmittel in der Originalverpackung lagern, bis alle Streifen aufgebraucht sind. 3. Die Packungsbestandteile dürfen nur bis zu dem vermerkten Verfalldatum benutzt werden. 8. PROBENENTNAHME UND HANDHABUNG Für diesen Test kann sowohl menschliches Serum als auch Plasma verwendet werden. Um eine Hämolyse zu vermeiden, sollte das Serum oder Plasma schnellstmöglich vom geronnenen Blut getrennt werden. Lipämische und/ oder hämolytische Proben können falsch positive oder negative Ergebnisse bewirken. Das Serum in einen sauberen Behälter geben. Die Proben bleiben mehrere Tage lang stabil, wenn sie zwischen 2-8 C gelagert werden. Für eine längere Lagerung können sie eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte jedoch vermieden werden. 9. TESTVERFAHREN 9.1. ALLGEMEINE BEMERKUNGEN 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 3. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 4. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. 5. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 6. Für jede Probe sollte eine neue Pipettenspitze benutzt werden, um Kreuzkontamination zu vermeiden. 7. Alle Reagenzien müssen vor dem Gebrauch Raumtemperatur haben. Außerdem ist bei der Mischung der Reagenzien darauf zu achten, dass kein Schaum entsteht. 8. Sobald der Test begonnen wurde, sollten alle Schritte ohne Unterbrechungen durchgeführt werden. 9. Bei Nutzung von ELISA Waschsystemen, kann eine Anpassung der Waschschritt erforderlich sein, um die Ergebnisse zu optimieren. Version CRP06-16 (01) 3 / 6
5 9.2. VORBEREITUNG DER REAGENZIEN Waschpuffer: 50 ml der konzentrierten Waschlösung (5) werden mit destilliertem Wasser bis auf 1000 ml verdünnt. Die verdünnte Waschlösung ist mindestens 1 Monat haltbar, oder solange die Lösung klar ist. Lagerung bei 2 C - 8 C. Bei höheren Temperaturen kann die konzentrierte Waschlösung trüb erscheinen, ohne dass die Eigenschaften dadurch beeinflusst werden. Nach der Verdünnung ist die Lösung klar. Proben-Verdünnungspuffer: 40 ml Proben-Verdünnungspuffer werden mit destilliertem Wasser bis auf 200 ml verdünnt. Der verdünnte Puffer ist mindestens 3 Monat haltbar, oder solange die Lösung klar ist. Lagerung bei 2 C - 8 C TESTVERFAHREN 1. Die 10-fach vorverdünnten Standards werden folgendermaßen 1:100 verdünnt: 10 μl der einzelnen Kalibratoren in je ein Reagenzröhrchen geben, 990 μl Proben-Verdünnungspuffer hinzugeben und vorsichtig mischen. 2. Die Patientenproben werden in zwei aufeinanderfolgenden Schritten 1:1000 verdünnt, indem man 10 μl der einzelnen Patientenproben mit einer Pipette in je ein Reagenzröhrchen gibt, 990 μl Proben- Verdünnungspuffer hinzufügt und alles gut mischt. Anschließend fügt man 450 μl verdünnten Proben- Verdünnungspuffer zu 50 μl dieser 100-fach verdünnten Proben hinzu und mischt alles. Achtung: Verdünnung frisch zubereiten und nicht länger als 8 Stunden lagern. 3. Mit einer Pipette 100 μl der verdünnten Kalibratoren und Proben in je ein Paar nebeneinander liegender Vertiefungen geben. 4. Die Mikrotiterstreifen abdecken und 30 +/- 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 5. Die Mikrotiterstreifen dreimal mit der rekonstituierten Waschlösung abspülen. Dazu kann man entweder ein für Mikrotiterstreifen geeignetes Waschgerät verwenden oder die Streifen gut ausklopfen und dann in die Waschlösung tauchen. Beim ersten Schritt bleiben die Streifen 2-3 Minuten lang in der Waschlösung. Zum Schluss werden die Mikrotiterstreifen herausgenommen und die überschüssige Flüssigkeit entfernt, indem man die Streifen umgekehrt auf absorbierendem Papier ausklopft. 6. Je 100 μl Konjugat-Lösung pipettieren, Mikrotiterstreifen abdeckten und für 30 +/- 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 7. Den in Punkt 5 beschriebenen Waschzyklus wiederholen µl TMB Substrate Lösung in jedes Well pipetieren ± 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Mikrotiterstreifen vor Lichteinwirkung schützten µl TMB Stop Lösung in jedes Well pipetieren. 11. Innerhalb 30 Minuten nach Abstoppen, die Absorption der einzelnen Vertiefungen bei 450-nm messen. 10. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. 11. TESTERGEBNISSE Für jeden Test wird der mittlere Absorptionswert der einzelnen Kalibratoren gegen den entsprechenden CRP-Wert aufgezeichnet und die optimale Kalibrationskurve (z.b. logarithmisch-linear) erstellt. Anhand der mittleren Absorptionswerte, den die einzelnen Patientenproben beim CRP-Test ergeben haben, bestimmt man durch einfache Interpolation aus der Kurve den entsprechenden CRP-Wert. Je nach der Verfügbarkeit von Computern können die Daten auch anhand anderer Methoden ausgewertet werden. Version CRP06-16 (01) 4 / 6
6 12. ERWARTETE WERTE Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. Beispiel für eine Standardkurve: CALIBRATOR µg/ml O.D. value Normalwerte: Serum- und Plasma-Proben von 360 gesunden Blutspendern wurden mit dem IBL CRP ELISA getestet, folgende Verteilung der CRP Werte wurde ermittelt: Konzentrationsbereich Anzahl CRP µg/ml > 50 0 Alle Individuen haben kleine Mengen an CRP in ihrem Blut. Die obere Grenze des normalen Bereichs liegt zwischen 5 und 8 μg/ml. (343 von 360 Individuen haben einen CRP Wert < 8 μg/ml). 13. TESTCHARAKTERISTIKA PRÄZISION Intra Assay (n = 10) Level 1 Level 2 MIttelwert (µg/ml) SD (µg/ml) % CV Inter Assay (n = 7) Level 1 Level 2 Level 3 Mittelwert (µg/ml) SD (µg/ml) % CV Version CRP06-16 (01) 5 / 6
7 14. SPEZIFITÄT KREUZREAKTIVITÄT Der CRP ELISA erkennt natürliches und rekombinantes menschliches CRP. Keine Kreuzreaktivität wurde mit folgenden Faktoren beobachtet, hergestellt bei 1 µg / ml in Probenverdünnungsmittel : menschliches Pentraxin 2; menschliches Pentraxin 3; menschliches monomeres CRP; Ratte CRP NACHWEISGRENZTE Die minimale nachweisbare Konzentration beträgt < 1 µg/ml GRENZEN DES TESTS Folgende Spezifikationen müssen bei jedem Testansatz erfüllt sein: O.D. Wert des Null-Standards: <0.080 O.D. Wert des höchsten Standards: >1.000 Konnte eine der Spezifikationen nicht erfüllt werden, ist der Testansatz zu wiederholen. 15. LITERATUR 1. POWELL L. J. C-Reactive Protein - a Review Am. J. Med. Technol., 87, (1979). 2. GEWURZ H., MOLD C., SIEGEL J. and FIEDEL B. C-Reactive Protein and the Acute Phase Response Advances in Internal Medicine, 27, (1982). 3. HELGESON N. G. P., ADAMSON D. M., PIKE R. B., JAMES D. S., NICODEMUS D. S., LEE B. A. and MILLER G. W. C-Reactive Protein : Laboratory Medicine, Vol. 2 (Race G. J., Ed.), Harper & Row, Hagerstown, chapter 29 (1973). 4. Johnson HL., Chiou CC., Cho CT. Applications of acute phase reactants in infectious diseases J. Microbiol. Immunol. Infect. 32(2):73-82 (1999). Version CRP06-16 (01) 6 / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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