Diphtheria-Ab ELISA. Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Diphtherie-Antikörpern in humanem Serum und Plasma.
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1 Arbeitsanleitung Diphtheria-Ab ELISA Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Diphtherie-Antikörpern in humanem Serum und Plasma. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Diphtherie-Antikörpern in humanem Serum, Citrat-, EDTA- und Heparin-Plasma. Ermittlung des humoralen Diphtherie-Immunstatus sowie Überprüfung des Impferfolges. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Nach wie vor ist die Diphtherie in Europa noch nicht ausgerottet [6]. Es kommt immer wieder zu sporadischen Erkrankungsfällen [4, 6, 13] auch in Deutschland mit einer Letalität von etwa einem Drittel. Überwiegend handelt es sich um importierte Erkrankungen, aber auch autochthone Infektionen werden gemeldet. Die derzeit niedrigen Erkrankungszahlen dürfen jedoch nicht über das potenzielle Infektionsrisiko hinwegtäuschen. Durch das seltene Auftreten der Diphtherie hat die natürliche Immunität in der Bevölkerung praktisch keine Bedeutung mehr. Das Vernachlässigen der aktiven Immunisierung in den vergangenen Jahren führte mittlerweile zu der aus verschiedenen Studien bekannten schlechten Impfimmunität bei Erwachsenen, aber auch bei Kindern und Jugendlichen [1, 5, 6, 9]. Aus den Diphtherie-Epidemieregionen Osteuropas [15] eingeschleppte Erreger können somit durch Tröpfcheninfektion in der Bevölkerung verbreitet werden. Dies kann zu einem häufigeren Auftreten der Erkrankung, möglicherweise auch in Form von Kleinepidemien führen. Ein Infektionsrisiko besteht durch den typischen Übertragungsweg für die gesamte Bevölkerung. Besonders gefährdet sind Personen mit häufigem Kontakt zu anderen (z. B. Kindergarten, Schule, Militär, Arztpraxen, Krankenhäuser, Grenzverkehr). Die aktive Diphtherie-Impfung reduziert Morbidität und Mortalität [12] der Infektion und unterbindet darüber hinaus bei hoher Durchimpfungsrate die Erregerzirkulation in der Bevölkerung. Mit dem IBL Diphtherie ELISA kann die Diphtherie-Antikörperkonzentration bestimmt und der humorale Diphtherie-Immunstatus ermittelt werden ("Impfmanagement"). Die erkannten Impflücken können vom behandelnden Arzt mit der entsprechenden Impfmaßnahme (Grundimmunisierung oder Auffrischungsimpfung) beseitigt werden. Einem Wiederaufflammen dieser fast schon in Vergessenheit geratenen Erkrankung kann somit entgegengewirkt werden. 3. TESTPRINZIP IBL Diphtheria-Ab ELISA ist ein Zweischritt-ELISA nach dem Sandwich-Prinzip. Vertiefungen der ELISA Teststreifen sind mit Diphtherie-Toxoid beschichtet. Verdünnte Serum- bzw. Plasmaproben werden in den Vertiefungen der ELISA-Teststreifen inkubiert (Probeninkubation). Während der Inkubationszeit werden spezifische Diphtherie-Antikörper an die Festphase gebunden. Unspezifische Probenbestandteile werden in einem Waschschritt entfernt. Im zweiten Inkubationsschritt erfolgt die Konjugatreaktion. Das Diphtherie- Toxoid-POD-Konjugat markiert spezifisch die gebundenen Diphtherie-Antikörper. In einem weiteren Waschschritt wird ungebundenes Konjugat entfernt. Im dritten Inkubationsschritt erfolgt die Substratreaktion, wobei die Peroxidase des Konjugats mit dem Substrat Wasserstoffperoxid Tetramethylbenzidin (TMB) zu einer blau gefärbten Substanz oxidiert. Durch anschließende Zugabe von Schwefelsäure wird diese Reaktion gestoppt und es erfolgt ein Farbumschlag nach gelb. Die Farbintensität ist der Diphtherie- Antikörperkonzentration der Probe direkt proportional. Bei einer Wellenlänge von 450 nm wird die Extinktion in einem ELISA-Reader gemessen. Über eine Standardkurve oder die Einpunktkalibrierung wird die Diphtherie-Antikörperkonzentration in der Probe quantitativ bestimmt. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Version / 7
3 Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 9. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 10. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf anti-hcv, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Alle in der Packung enthaltenen Komponenten sind ungeöffnet bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar. Die Mikrotiterplatte ist nach dem Öffnen der Verpackung bis zum aufgedruckten Verfallsdatum haltbar, wenn der Beutel sorgfältig verschlossen (inkl. Trockenbeutel) bei 2-8 C gelagert wird. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Serum, Plasma Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung: 2-8 C -20 C (aliquotiert) Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Haltbarkeit: 5 Tage 12 Monate Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 7. KOMPONENTEN DES KITS Anzahl / Menge Symbol 1 x 12 x 8 MTP 1 x 0.6 ml ENZCONJ CONC 5 x 0.35 ml CAL x 0.35 ml Control LL Control HL 2 x 75 ml DILBUF 1 x 100 ml WASHBUF CONC 2 x 15 ml TMB SUBS Komponente Mikrotiterplatte Gebrauchsfertig. Wells einzeln abbrechbar. Beschichtet mit Diphtherie-Toxoid. Enzymkonjugat Konzentrat (100x) Blau gefärbt. Diphtherie-Toxoid konjugiert mit Peroxidase. Kalibrator 1-5 Konzentrat Enthält: Humanserum, Stabilisatoren, Konservierungsmittel. Die chargenabhängige Konzentrationen bitte den Flaschenetiketten entnehmen. Kalibriert gegen WHO Standard (NIBSC 00/496). Kontrolle LL+HL Konzentrat Positivkontrolle Serum, LL, Low Level, HL, High Level. Enthält: Humanserum, Stabilisatoren, Konservierungsmittel. Die chargenabhängige Konzentrationen bitte den Flaschenetiketten entnehmen. Verdünnungspuffer Gebrauchsfertig. Rot gefärbt. Enthält: Detergenzien, % (w/v) Thimerosal, 0.01 M Tris/HCl; ph 7.4. Waschpuffer, Konzentrat (10x) Enthält: Phosphatpuffer. TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: TMB (Tetramethylbenzidine). 1 x 15 ml TMB STOP TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. Enthält: 0.5 M H 2SO 4. 2 x FOIL Haftklebefolie Hinweis: Waschpuffer, Verdünnungspuffer, TMB Substratlösung, Stopplösung sind mit folgenden Produkten austauschbar: TBE virus IgG (RE57401), TBE virus IgM (RE57411) und Tetanus-Ab (RE57441). Version / 7
4 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 5, 20, 100, 500, 1000 µl 2. Vortex-Mischer 3. Röhrchen zur Probenverdünnung 4. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 5. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 6. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 7. Bidest. oder deionisiertes Wasser 8. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 9. Software-Modul Einpunktkalibrierung für die Auswertung mit Microsoft Excel 5.0 oder höher (wird auf Anforderung kostenlos zur Verfügung gestellt). 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 8. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wieder verschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. TESTVORBEREITUNGEN Vorbereitung konzentrierter Komponenten (Beispiel für 32 Testvertiefungen) Verd. / rekonst. 80 µl Komponente mit Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit ENZCONJ CONC 8 ml DILBUF 1:101 Vorsichtig mischen. (Kurz vor Gebrauch ansetzen.) C 1 Stunde 10 ml WASHBUF CONC 90 ml bidest. Wasser 1:10 Vorsichtig mischen. 2-8 C 8 Wochen Version / 7
5 10.2. Verdünnung von Standards, Kontrollen und Proben CAL 1-5 CONTROL LL CONTROL HL zu verdünnen mit Verhältn is Bemerkungen immer DILBUF 1:101 z.b. 10 µl CAL/Control µl Serum / Plasma immer DILBUF 1:101 z.b. 10 µl Probe µl Für die Auswertung mittels Standardkurve werden die Kalibratoren 1 bis 5 und Kontrollseren benötigt. Für die Einpunktkalibrierung nur Kalibrator 4 und Kontrollseren verwenden. Proben mit Konzentrationen über dem höchsten Standard müssen weiter verdünnt werden. 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Je 200 µl der verdünnten Kalibratoren, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren (Kalibratoren sollten in Teststreifen 1 und 2 pipettiert werden). 2. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 60 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 3. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 3 x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 4. Je 200 µl des verdünnten Enzymkonjugats in jedes Well pipettieren. 5. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 60 min bei RT (18-25 C) inkubieren. 6. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 3 x mit je 250 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 7. Substrat- und Stopplösung möglichst mit einer 8-Kanal-Pipette pipettieren und Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. 8. Je 200 µl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren min bei RT (18-25 C) inkubieren. 10. Die Substratreaktion durch Zugabe von 50 µl TMB Stoplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 11. Die optische Dichte mit einem Photometer bei 450 nm (Referenzwellenlänge: nm) innerhalb 10 min nach dem Pipettieren der Stopplösung messen. 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Der IBL Diphtherie ELISA kann wahlweise durch Erstellen einer Standardkurve oder durch Einpunktkalibrierung ausgewertet werden Konzentrationsbestimmung über Standardkurve Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (lin-log) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Version / 7
6 Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden).die Konzentrationen der Proben können von der Standardkurve abgelesen werden. Die standardmäßig durchzuführende Verdünnung ist in dem oben beschriebenen Auswerteverfahren bereits berücksichtigt. Wenn Proben anders oder weiter verdünnt wurden, müssen die Ergebnisse mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, können wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben, verdünnt und erneut analysiert werden Konzentrationsbestimmung über Einpunktkalibrierung Das hierzu benötigte Software-Modul IBL Einpunktkalibrierung für die Auswertung mit Microsoft Excel 5.0 oder höher wird auf Anforderung kostenlos zur Verfügung gestellt. Vorgehen: Excel-Modul IBL Einpunktkalibrierung aufrufen und in die vorbereiteten Felder die Informationen aus dem QC-Zertifikat eintragen: - Extinktions-Sollwert von Kalibrator 4 - Extinktions-Istwert von Kalibrator 4 (Mittelwert). - OD-Toleranzgrenzen von Kalibrator 4, - Referenzkurvenparameter A, B, C und D Extinktionsmesswert von Kalibrator 4 eingeben: Die Extinktion von Kalibrator 4 muss im angegebenen Toleranzbereich liegen. In die vorbereitete Tabelle werden die Identifikationen und Extinktionen der jeweiligen Kontrollseren und Proben eingegeben. OD-Korrektur und Konzentrationsberechnung erfolgen automatisch. Validität des Tests bei Einpunktkalibrierung Die Extinktion von Kalibrator 4 muss im angegebenen Toleranzbereich liegen. Die Validität der Ergebnisse aus der IBL Einpunktkalibrierung ist gegeben, wenn die Kontrollen innerhalb der chargen-spezifischen Toleranzgrenzen liegen (siehe QC-Zertifikat) Auswertbarkeit der ermittelten Probenkonzentrationen Proben mit Extinktionen außerhalb der Standardkurve müssen mit Inkubationspuffer 1:5 vorverdünnt werden. Die ermittelte Konzentration wird mit dem Verdünnungsfaktor 5 multipliziert. Die Umrechnung von Citrat-Plasma- in Serumwerte erfolgt durch Multiplikation der abgelesenen Konzentrationen mit dem Faktor INTERPRETATION DER ERGEBNISSE In der Literatur [1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 13, 14] werden folgende Angaben zum Diphtherie-Impfschutz gemacht: Bei Diphtherie-Antikörperkonzentrationen unter 0.01 IU/mL besteht zum Zeitpunkt der Probenentnahme "kein Schutz", von IU/mL eine "Basisimmunität mit relativer Schutzwirkung" und bei Konzentrationen größer 0.1 IU/mL ein "sicherer individueller Schutz". Nach erfolgter Impfung sinken die Antikörperkonzentrationen im Verlaufe mehrerer Jahre so weit ab, dass eine rechtzeitige Auffrischungsimpfung empfehlenswert ist. In der Tabelle sind die Empfehlungen aus der Literatur [8, 11] für die Beurteilung des Befundes zusammengefasst. Das Testergebnis ist, unter Einbeziehung der testspezifischen Präzision, vom Arzt in jedem Einzelfall sorgfältig zu beurteilen. <0.1 IU/mL sofortige Grundimmunisierung IU/mL sofortige Auffrischung > IU/mL Auffrischung nach 5 Jahren > IU/mL Auffrischung nach 7 Jahren > 2.0 IU/mL Auffrischung nach 10 Jahren Es empfiehlt sich, 4-8 Wochen nach der Grundimmunisierung bzw. Auffrischungsimpfung eine serologische Kontrolle durchzuführen und die ermittelte Diphtherie-Antikörperkonzentration im Impfausweis zu dokumentieren. Version / 7
7 15. TESTCHARAKTERISTIKA Die Kalibrierung des Tests erfolgte am WHO Standard (NIBSC 00/496). Präzision: Wiederfindung: Die Abweichung vom theoretisch zu erwartenden Wert ist 20%. Intraassayvarianz bezogen auf die Konzentration: <10%. Interassayvarianz bezogen auf die Konzentration: <12%. Untere Nachweisgrenze: 0.08 IU/mL. Messbereich: IU/mL. Verdünnungslinearität innerhalb des Messbereichs: <10% Abweichung. Korrelation zu einem Neutralisationstest nach Bablok-Passing: 88%. 16. LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Allerdist, H.: Die Immunitätslage gegenüber Diphtherie. Dtsch. med. Wschr., 106, 1737 (1981) 2. Christenson, B. und Böttiger, M.: Serological immunity to diphtheria in Sweden in 1978 and Scand. J. Infect Dis. 18, 227 (1986) 3. Kjeldsen, K. et al.: Immunity against diphtheria years after primary vaccination in childhood. Lancet, 1, 900 (1985) 4. Müller, T.: Diphtherieausbruch in Reutlingen. Dtsch. Ärzteb. 86, 39 (1989) 5. Naumann, P. et al.: Diphtherie-Immunität und ihre epidemiologische Bedeutung. Dtsch. med. Wschr., 108, 1090 (1983) 6. Naumann, P. und Weber, H.-G.: Diphtherie-Immunität bei Schulanfängern und nach Wiederimpfung mit d-impfstoff. Dtsch. med. Wschr., 117, 1308 (1992) 7. Nelson, L. A. et al.: Immunity to diphtheria in an urban population. Pediatrics, 61, 703 (1978) 8. Pietsch, M.: Impfserologie zur Ergänzung von Impfungen. Allgemeinarzt, 18, 1155 (1993) 9. Pietsch, M. et al.: Immunitätslücken gegen Diphtherie und Tetanus bei Kindern und Jugendlichen.Sozialpädiatrie, 15 (7), 410 (1993), 10. Pilars de Pilar, C. E. und Spiess, H.: Diphtherie- und Tetanusantikörper bei Kindern und jungen Erwachsenen. Dtsch. med. Wschr., 106, 1341 (1981) 11. Scheibel, I. et al.: Duration of Immunity to Diphtheria and Tetanus after Active Immunization. Acta path. microbiol. scand., 67, 380 (1966) 12. Spiess, H.: Diphtherieschutzimpfung. In: Impfkompendium, Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 3. Auflage (1987) 13. Thilo, W. et al.: Serologische Immunität gegen Diphtherie Z. klin. Med., 42, 1807 (1987) 14. Wagner, G. und Schumann, H.: Die Diphtherie eine fast vergessene und doch aktuelle Krankheit. Wehrmed. Mschr., 35, 199 (1991) 15. Diphtheria Outbreak Russian Federation, : Morb. Mortal. Wkly. Rep. 42 (43), 840 (1993) 16. Naumann, P. und Nemes, G.: Die Diphtherie und ihre aktuelle Bedeutung. Dtsch Ärzteb., 79 (51/52), 21 (1982) 17. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum (2002) Version / 7
8 17. KURZPROTOKOLL TESTVORBEREITUNG VERDÜNNUNG Volumen DILBUF bidest. Wasser Verhältnis Bemerkung WASHBUF CONC 10 ml 90 ml 1:10 Beispiel für 32 Testvertiefungen ENZCONJ CONC 80 µl 8 ml 1:101 CAL 1-5, Control LL, Control HL je 10 µl je 1000 µl 1:101 PROBENVERDÜNNUNG Volumen DILBUF Verhältnis Bemerkung Serum/ Plasma 10 µl 1000 µl 1:101 TESTDURCHFÜHRUNG CAL 1-5, Control LL, Control HL (verdünnt) / Proben (verdünnt) 200 µl 60 min. bei C inkubieren. Inkubationslösung verwerfen. 3 x mit 0.25 ml Waschpuffer (verdünnt) waschen, verwerfen und restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. Enzymkonjugat (verdünnt) 200 µl 60 min. bei C inkubieren. Inkubationslösung verwerfen. 3 x mit 0.25 ml Waschpuffer (verdünnt) waschen, verwerfen und restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. TMB SUBS 200 µl 30 min. bei C inkubieren. TMB STOP 50 µl Optische Dichte mit einem Photometer bei 450 nm messen (Referenzwellenlänge: nm). Version / 7
9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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