alpha-amylase Saliva Assay

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1 Arbeitsanleitung alpha-amylase Saliva Assay Enzymatischer Assay zur Bestimmung der Alpha-Amylase-Aktivität in humanem Speichel. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymatischer Assay zur Bestimmung der Alpha-Amylase-Aktivität in humanem Speichel. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Die Aktivitätsmessung der Alpha-Amylase in Speichel ist nützlich für die Psychobiologie im Bereich Stress. Viele Studien haben gezeigt, dass die Alpha-Amylase Aktivität im Speichel mit der Aktivität des sympathischen Nervensystems korreliert. Es ist bewiesen, dass freies Cortisol im Speichel ein nicht-invasiver Marker für die Aktivität des Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA) ist. Die Alpha-Amylase im Speichel scheint ein ähnlich gut charakterisierter Marker für die Aktivität des sympathischen Nervensystems zu sein. Die Alpha-Amylase im Speichel wird in Zusammenhang mit chronischem Stress, posttraumatischen Belastunsstörungen, Verhalten, kognitive Funktion und Gesundheit gebracht. Darüber hinaus kann die Erhöhung von Alpha-Amylase in Speichel durch SNS aktivierende Medikamente (wie z.b. Yohimbine) hervorgerufen und durch Beta-Blockarde (wie z.b. Propanolol) unterdrückt werden. Die bisherigen Erkenntnisse lassen den vorsichtigen Schluss zu, dass die Alpha-Amylase im Speichel eine wertvolle Erweiterung des biopsychologischen Methodenrepertoires darstellen kann. 3. TESTPRINZIP Enzymatischer Flüssigphasenassay. Das Substrat wird von der in den Speichelproben enthaltenen Alpha- Amylase spezifisch umgesetzt. Die Intensität der Farbentwicklung ist proportional zur Alpha-Amylase- Aktivität in der Probe. Die Ergebnisse können direkt aus einer Standardkurve abgelesen werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 9. Einige Reagenzien enthalten Natriumazid (NaN 3 ) als Konservierungsmittel. Bei Kontakt mit den Augen oder der Haut gründlich mit Wasser abspülen. NaN 3 kann mit Blei und Kupfer explosive Azide bilden. Bei Entsorgung über das Abwasser gut spülen, um Azidanreicherung zu vermeiden. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Version / 5

3 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Saliva Der Patient sollte 30 min vor der Probennahme nicht essen, trinken, Kaugummi kauen oder Zähne putzen. Andernfalls 5 min vor der Probenahme den Mund gründlich mit kaltem Wasser spülen. Salivaproben sollten nicht bei Krankheiten, Entzündungen oder Verletzungen der Mundhöhle genommen werden (Blutkontamination). Salivaproben können in geeigneten Sammelgefäßen gesammelt werden. Es sollten mindestens 0.5 ml Flüssigkeit gesammelt werden. Der Speichelfluss kann durch Kauen auf Parafilm stimuliert werden. Es wird empfohlen, die Salivaproben vor der Testdurchführung bei 20 C einzufrieren und nach dem Auftauen zu mischen und 10 min bei x g zu zentrifugieren (um Partikel zu entfernen). Die Salivaproben müssen visuell einwandfrei sein. (Rötliche Färbung deutet auf Kontamination mit Blut hin) Lagerung C 2 8 C -20 C (aliquotiert) Haltbarkeit 1 Tag 28 Tage 6 Monate 7. KOMPONENTEN DES KITS Anzahl / Menge Symbol 1 x 12 x 8 MTP 3 x 200 µl CAL LYO 2 x 3 x 200 µl CONTROL 1 LYO CONTROL 2 LYO 1 x 40 ml DILBUF CONC 1 x 21 ml SUBS Komponente Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. Stockstandard, lyophilisiert Enthält: humane Speichel-Alpha-Amylase. Referenzmethode für die Kalibrierung: Temperiertes Photomter. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat. Kontrolle 1+2, lyophilisiert Enthält: humane Speichel-Alpha-Amylase. Referenzmethode für die Kalibrierung: Temperiertes Photomter. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat., Konzentrat (10x) Enthält: PBS, BSA, Stabilisatoren. Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: CNPG3, Stabilisatoren. 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 10; 100; 200; 1000 µl 2. Röhrchen für die Probenverdünnung 3. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 4. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 405 nm (Referenzwellenlänge nm) 5. Bidest. oder deionisiertes Wasser 6. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 7. Vortex-Mischer 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. Version / 5

4 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Alpha-Amylase ist in Schweiß und Speichel enthalten. Daher während der Testdurchführung Handschuhe tragen und nicht mit dem Mund pipettieren. 10. TESTVORBEREITUNGEN Vorbereitung konzentrierter Komponenten Komponente Verhältnis Diluent Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit DILBUF CONC 1:10 bidest. Wasser z.b. 10 ml + 90 ml bidest. Wasser Ohne Schaumbildung mischen. 2-8 C 4 Wochen Vorbereitung lyophilisierter Komponenten Komponente mit Diluent Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit CAL LYO 200 µl 15 min stehen lassen. 2-8 C 7 Tage CONTROL 1+2 LYO 200 µl Ohne Schaumbildung mischen. 2-8 C 7 Tage Vorbereitung der Standardreihe Der rekonstituierte Stockstandard muss 1:301 mit verdünntem verdünnt werden. Dies ergibt den Standard 1. Aus diesem wird durch serielle Verdünnung wie im folgenden Beispiel eine Standardreihe erstellt. Name Verhältnis Diluent Bemerkungen Standard 1 1:301 Standard 2 1:2 Standard 3 1:2 Standard 4 1:2 Standard 5-10 µl rekonstituierter Stockstandard + 3 ml verdünnter Vor der nächsten Verdünnung gründlich mischen. 100 µl Standard µl verdünnter Vor der nächsten Verdünnung gründlich mischen. 100 µl Standard µl verdünnter Vor der nächsten Verdünnung gründlich mischen. 100 µl Standard µl verdünnter Gründlich mischen. Berechnung U/mL s. Fläschenetikett z.b.: 400 U/mL z.b.: 200 U/mL z.b.: 100 U/mL z.b.: 50 U/mL Nur verdünnten 0 U/mL Verdünnung der Kontrollen und Proben Proben und rekonstituierte Kontrollen müssen wie folgt verdünnt werden: Verhältnis Diluent Bemerkungen Probe 1:301 z.b.: 10 µl Probe (Saliva) + 3 ml verdünnter. Nach Verdünnung gründlich mischen. Kontrollen 1:301 z.b.: 10 µl Kontrolle (rekonstituiert) + 3 ml verdünnter. Nach Verdünnung gründlich mischen. Proben mit Konzentrationen über dem höchsten Standard müssen weiter verdünnt werden. Version / 5

5 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Je 10 µl von jedem vorverdünnten Standard, jeder vorverdünnten Kontrolle und vorverdünnten Patientenprobe in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte pipettieren. 2. Je 200 µl der Substratlösung in jedes Well pipettieren. Für die Zugabe der Substratlösung wird die Verwendung einer 8-Kanal-Mikropipette empfohlen. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden min bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren Messung: Optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei 405 nm messen (Referenzwellenlänge nm). 5. Während der Inkubation wird das Substrat von der in den Proben enthaltenen Alpha-Amylase spezifisch umgesetzt. Eine gute Differenzierung innerhalb der Standardkurve ist für die Auswertung von großer Bedeutung. Allerdings sollte die OD des höchsten Standards nicht überschreiten! Die Entwicklung der OD sollte daher während des Tests regelmäßig kontrolliert werden. Dies ist besonders bei hoher Raumtemperatur wichtig. 6. Weitere 5 min bei Raumtemperatur (18-25 C) inkubieren (gesamte Inkubationszeit 8 min.). Bei hoher Raumtemperatur oder erstmaliger Verwendung des Assays wird eine zusätzliche Messung nach 3 min. (Gesamtzeit 6 min.) empfohlen Messung: Optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei 405 nm messen (Referenzwellenlänge nm). 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP- Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Zunächst das Delta-OD für jeden Standard, Kontrolle und Probe ermitteln. Dafür wird die OD der 1. Messung von der der jeweiligen 2. Messung abgezogen. Die erhaltenen Delta-OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (lin-log) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Alpha-Amylase-Aktivitäten der Proben können von der Standardkurve direkt abgelesen werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Bei Fragen zur Auswertung kontaktieren Sie IBL. Die Ergebnisse werden in U/mL ausgedrückt. Zur Umrechnung in Internationale Einheitern (SI) sind die Ergebnisse mit dem Faktor zu multiplizieren. Die so erhaltenen Ergebnisse haben die Einheit nkat/l. 14. TESTCHARAKTERISTIKA Präzision Mittelwert Aktivität SD Intra-Assay Inter-Assay VK (%) N Version / 5

6 Probe Saliva Verdünnung Gemessen Aktivität Wiederfindung (%) 1: : : : : : Linearität 1: : : : : : : : : Endogene Aktivität Zugefügt Aktivität Gemessen Aktivität Wiederfindung (%) Saliva (25.5) Wiederfindung Saliva (38.9) Saliva (107.1) Methodenvergleich IBL = x kommerziell erhältlicher Enzymassay r = n = LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. DIN EN ISO 18153:2003, In vitro diagnostic medical devices Measurement of quantities in biological samples Metrological traceability of values for catalytic concentration of enzyme assigned to calibrators and control materials. 2. Emily S. Winn-Deen, Harold David, Gerald Sigler, Rodrigo Chavez; Development of a Direct Assay for alpha-amylase ; Clin. Chem. 34/10, (1988) 3. Jean-Pierre Bretaudiere, Robert Rej, Patricia Drake, Anne Vassault, Michel Bailly Suitability of Control Materials for Determination of alpha-amylase activity ; Clin. Chem. 27/6, (1981) 4. G. Gubern, F. Canalias, FJ Gella; Determination of alpha-amylase activity: method comparison and commutability study of several control material ; Clin. Chem. 41, (1995) 5. Urs M. Nater, Nicolas Rohleder, Wolff Schlotz, Ulrike Ehlert, Clemens Kirschbaum; Determinants of the diurnal course of salivary alpha-amylase ; Psychoneuroendocrinology 32, (2007) 6. Daniela Schoofs, Diana Preuß, Oliver T. Wolf; Psychosocial stress induces working memory impairments in an n-back paradigm ; Psychoneuroendocrinology 33, , (2008) 7. Tom Smeet, Henry Otgaar, Ingrid Candel, Oliver T. Wolf; True or false? Memory is differentially affected by stress-induced cortisol elevations and sympathetic activity at consolidation and retrieval ; Psychoneuroendocrinology 33, (2008) 8. Katrin Starcke, Oliver Wolf; Anticipatory Stress Influences Decision Making Under explicit Risk Conditions ; Behavioral Neuroscience, 122/ 6, (2008) 9. Noriyasu Takai, Masaki Yamaguchi, Toshiaki Aragaki, Kenji Eto, Kenji Uchihashi and Yasuo Nishikawa; Gender-Specific Differences in Salivary Biomarker Responses to Acute Psychological Stress ; New York Academy of Sciences 1098: (2007) 10. Anda van Stegeren, Nicolas Rohleder, Walter Everaerda and Oliver T. Wolf; Salivary alpha amylase as marker for adrenergic activity during stress: Effect of betablockade ; Psychoneuroendocrinology 31, (2006) 11. Ulrike Ehlert, Katja Erni, Gundula Hebisch, and Urs Nater; Salivary α-amylase Levels after Yohimbine Challenge in Healthy Men ;The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(12): (2006) Version / 5

7 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /