Cortisol Urine ELISA
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- Gudrun Schneider
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1 Arbeitsanleitung Cortisol Urine ELISA Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von Cortisol in humanem Urin. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1 ZWECKBESTIMMUNG Der Cortisol Urine ELISA ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von freiem Cortisol im Urin. 2 KLINISCHE BEDEUTUNG Cortisol ist ein Steroidhormon aus der Nebennierenrinde, die Bildung von Cortisol wird vom Hormon ACTH (von der Hirnanhangdrüse) gesteuert, und wird bei Stress freigesetzt; es erhöht den Blutdruck, Blutzuckerspiegel, kann zu Unfruchtbarkeit bei Frauen führen, und unterdrückt das Immunsystem. Cortisol wirkt über spezifische intrazelluläre Rezeptoren und hat Auswirkungen in zahlreichen physiologischen Systemen, einschließlich der Immunfunktion, Glucose-Gegenregulation, Gefäßtonus, Substratverwertung und Knochenstoffwechsel. Cortisol wird in erster Linie im Urin ausgeschieden, dieses wird als "freies Cortisol im Urin" bezeichnet. Cortisol ist im Plasma an Corticosteroid-Binding Globulin (CBG, transcotin) mit hoher Affinität und Albumin gebunden. Nur freies Cortisol ist für die meisten Rezeptoren verfügbar. Diese normalen endogenen Funktionen sind die Basis für die physiologischen Folgen von chronischem Stress - verlängert Cortisol-Sekretion verursacht Muskelschwund, Hyperglykämie, und unterdrückt Immun/ Entzündungsreaktionen. Die gleichen Konsequenzen ergeben sich aus langfristiger Gabe von Glukokortikoid- Medikamenten. Der Anteil von freiem Cortisol repräsentiert das metabolisch aktive Cortisol. Unter normalen Bedingungen, werden weniger als 1% im Urin ausscheiden. Bei pathogenen Zuständen (Cushing-Syndrom), sind freie Cortisolwerte im Urin erhöht, weil das CBG Cortisol im Plasma nicht bindet und über den Urin ausscheidet. Während der Schwangerschaft oder Östrogentherapie finden sich erhöhte Plasma-Cortisolwerte durch gesteigerte Transportproteinbildung, jedoch bleiben die Konzentrationen von freiem Urin-Cortisol normal und zeigen korrekte Nebennierenfunktion an. Dieser Test ist sehr nützlich, um die echte Nebennierenfunktion zu ermitteln, weil es freies Cortisol in der metabolisch aktiven Form bestimmt. Darüber hinaus ist die Messung von freiem Urin-Cortisol ein wichtiger Parameter für die Diagnose des Cushing-Syndroms. 3 TESTPRINZIP Cortisol (Antigen) in der Probe konkurriert mit dem Meerrettichperoxydase Cortisol (Enzym-markiertes Antigen) während der Inkubation um die freien anti-cortisol Bindungsstellen auf der beschichteten Mikrotiterpatte. Nach Inkubation wird das nicht gebundene Konjugat durch Waschen der Wells entfernt. Anschließend wird die TMB- Substratlösung zugegeben Das gebundene Enzym HRP reagiert mit dem Substrat (H 2 O 2 ) und dem TMB Substrat und entwickelt eine blaue Farbe, die ins Gelbe umschlägt bei Zugabe der Stopplösung (H 2 SO 4 ). Die Intensität der gebildeten Farbe ist umgekehrt proportional zur Cortisol -Konzentration in der Probe. Die Berechnung der Cortisolkonzentration erfolgt über die Standardkurve. 4 MATERIALIEN 4.1 Mitgelieferte Reagenzien 1. Beschichtete Microtiterplatte MTP (1 einzeln brechbar) Mit anti-cortisol IgG beschichtet 2. Konjugat CONJ 1 x 33 ml Cortisol-HRP Konjugat 3. Cortisol Standard 0 CAL 0 1 x 4mL 4. Cortisol Standards 1 4 CAL1-4 1 x 4 x 1mL 5. Waschpuffer (10x) WASHBUF CONC 1 x 50 ml Phosphatpuffer, ProClin < % 6. TMB Substrat TMB SUBS 1 x 15 ml H 2 O 2 -TMB 0.26g/L (Hautkontakt vermeiden) 7. Stoplösung TMB STOP 1 x 15 ml Schwefelsäure 0.15 mol/l (Haut- und Augenkontakt vermeiden) 8. Niedrige Kontrolle CONTROL LOW 1 x 1 ml 9. Hohe Kontrolle CONTROL HIGH 1 x 1 ml 4.2 Erforderliche aber nicht enthaltene Geräte und Materialien Aqua dest. Version 01/ / 5
3 4.3 Erforderliche Materialien und Geräte Manuelle oder automatische Waschvorrichtung. Photometer mit Filtern (450nm, nm) Achtung Alle Reagenzien dunkel bei 2 C bis 8 C lagern. Verpackung der Mikrotiterplatte nur öffnen, wenn die Platte auf Raumtemperatur gebracht ist und nach Gebrauch wieder sorgfältig verschließen. Geöffnet ist die Mikrotiterplatte bis zum Ablauf des Verfalldatums des Kits haltbar. 5 WARNHINWEISE Dieser Kit ist nur zum in vitro diagnostischen Gebrauch durch Fachpersonal geeignet. Nicht für innere oder äußere Anwendung bei Mensch und Tier. Beim Umgang mit den Reagenzien entsprechende Schutzkleidung tragen Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) und andere einschlägige Normen und Gesetze beachten. Einige Reagenzien enthalten kleine Mengen an Proclin 300R als Konservierungsmittel. Den Kontakt mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. TMB-Substrat hat eine Reizwirkung auf Haut und Schleimhaut. Zum Schutz vor Verletzungen sollte die Substanz weder eingeatmet noch oral aufgenommen, sowie der Kontakt mit Haut und Augen vermieden werden. Der Kontakt mit der Stop Solution sollte vermieden werden, da sie 0.5 M H2SO4 enthält. Schwefelsäure kann Haut- Augen-reizungen und Verbrennungen verursachen. Direkten Kontakt des Substrates TMB/H2O2 mit Sonnenlicht, Metallen oder Oxydationsmittel vermeiden. Lösung nicht einfrieren. Dieser ELISA erlaubt die Ermittlung des Cortisols von 10 ng/ml bis 500 ng/ml. Ergebnisse werden verfälscht, wenn Patienten natürliche oder synthetische Corticosteroide einnehmen. 6 VORSICHTSMASSNAHMEN Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss genau wie in dieser Anleitung angegeben eingehalten werden. Die hier dargestellten Daten zur Performance wurden unter Verwendung der in dieser Gebrauchsanweisung genannten spezifischen Reagenzien ermittelt. Alle Reagenzien sollten bei 2-8 C kühl in ihren Originalverpackungen gelagert werden. Ausnahmen sind klar angegeben. Die Reagenzien sind bis zum angegebenen Verfallsdatum stabil, wenn sie wie angegeben gelagert und gehandhabt werden. Die Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf Raumtemperatur (22-28 C) bringen und vor Gebrauch gut mischen. Komponenten von Kits mit unterschiedlichen Lotnummern nicht untereinander vertauschen. Das Verfallsdatum auf Kit und Fläschchen ist zu beachten. Reagenzien nicht nach dem auf dem Kit-Etikett angegebenen Verfallsdatum verwenden. Bei der Verwendung von Automaten, muss darauf geachtet werden, dass der Kit entsprechend getestet wurde. Die unvollständige oder ungenaue Entfernung von Flüssigkeit aus den Wells kann die Testgenauigkeit beeinflussen und/oder den Background erhöhen. Um genaue Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Reaktionszeit in jedem Well konstant zu halten. Das Pipettieren der Proben sollte 10 min nicht überschreiten, um eine Zeitabweichung zu vermeiden. Wenn mehr als 10 Minuten benötigt werden, muss auf dieselbe Pipettierreihenfolge geachtet werden. Wenn mehr als eine Platte verwendet wird, wird empfohlen, die Dosis-Wirkungs-Kurve für jede Platte zu wiederholen. Die Zugabe der TMB-Substratlösung setzt eine kinetische Reaktion in Gang, die durch die Zugabe von Stopplösung beendet wird. Deshalb müssen das TMB-Substrat und die Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugegeben werden, um Zeitverzögerungen während der Reaktion auszuschließen. Die Richtlinien zur Qualitätskontrolle in medizinischen Laboren sind mittels Kontrolltesten und Serenpools einzuhalten. Bei der Rekonstitution und Dispensierung ist maximale Präzision erforderlich. Plattenlesegeräte messen vertikal. Nicht den Boden der Wells berühren. Version 01/ / 5
4 7 TESTDURCHFÜHRUNG 7.1 Vorbereitung der Standards (CAL 0 CAL 4) Vor Gebrauch 5 Minuten auf einem Rollenmischer gut durchgemischen. Die Standards sind gebrauchsfertig und haben folgende Cortisolkonzentrationen: CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 ng/ml Nach dem Öffnen 6 Monate bei 2-8 C haltbar. 7.2 Vorbereitung des Konjugates Das Konjugat ist gebrauchsfertig. Nach dem Öffnen 6 Monate bei 2-8 C haltbar. 7.3 Probenvorbereitung Die Bestimmung von Cortisol mit diesem Kit wird mit Urinproben durchgeführt. Wichtiger Hinweis: Bitte beachten Sie, dass dieser Test mit unbehandelten Urinproben validiert wurde. Die Ansäuerung des Urins, die zu einem ph-wert 5,0 führt, kann den Assay stören und die Ergebnissen verfälschen. Es ist nicht notwendig, die Probe zu verdünnen. Das Gesamtvolumen des in 24 Stunden ausgeschieden Urins sollten gesammelt und in einem geeignetem Gefäß gemischt werden. Urinproben, die nicht sofort untersucht werden, können bei 2-8 C ( 48h) oder bei -20 C ( 6 Monate) gelagert werden. Die Kontrollen sind gebrauchsfertig. Proben mit Konzentrationen über 500 ng/ml sind mit Kalibrator 0 zu verdünnen (Verdünnung bei der Berechnung der Endkonzentration berücksichtigen). 7.4 Vorbereitung des Waschpuffers Das Waschpufferkonzentrat, vor Gebrauch, in einem geeigneten Gefäß mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnen.gut mischen. Für kleinere Volumina das 1:10 Verhältnis berücksichtigen. In konzentrierter Waschlösung können Kristalle auftreten. In diesem Fall gut mischen bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Auflösung der Kristalle. Um eine bessere Genauigkeit zu erreichen, die gesamte Flasche des konzentrierten Waschpuffers in 500 ml lösen und gut mischen, bis die Kristalle sich komplett aufgelöst haben. 7.5 Prozedur Alle Reagenzien für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur (22-28 C) bringen. Am Ende des Tests, sofort die Reagenzien bei 2-8 C lagern und lange Exposition bei Raumtemperatur vermeiden. Nicht verwendete MTP-Streifen sollten sicher im Folienbeutel mit Trockenmittel bei 2 8 C gelagert werden. Um mögliche mikrobielle und / oder chemische Kontamination zu vermeiden, sollten nicht verwendete Reagenzien nie in den Originalflaschen zurückgeführt werden. Um die Genauigkeit der Testergebnisse zu verbessern, wird empfohlen Proben, Standards (CAL 0 - CAL 4) und Kontrollen in Doppelbestimmungen durchzuführen. Eine Vertiefung für den Leerwert frei lassen. Version 01/ / 5
5 Stdandard. / Kontrolle Probe Leerwert Standards CAL 0 CAL 4 Kontrolle 10 µl - - Probe - 10 µl - Konjugat 300 µl 300 µl - Platte kurz schütteln. 60 Minuten bei 37 C inkubieren. Den Inhalt der Wells ausschütten. Wells 3x mit 350 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Wichtiger Hinweis: Während jedes Waschschritts, die Platte vorsichtig für 5 Sekunden schütteln und restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. Automatisches Waschsystem: bei automatischem waschen werden 6 Waschschritte empfohlen. TMB-Substrat 100 µl 100 µl 100 µl 15 Minuten, im dunklen, bei Raumtemperatur (22 28 C) inkubieren. Stoplösung 100 µl 100 µl 100 µl Platte kurz schütteln. OD bei 450 nm gegen Referenzwellenlänge nm oder Leerwert innerhalb von 5 Minuten messen. 8 QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Labor sollte Cortisol Urin Kontrollen im normalen, hohen und niedrigen Bereich messen, um die Leistungsfähigkeit des Testes zu überprüfen. Diese Kontrollen sollten wie unbekannte Proben behandelt und bei jedem Testlauf mitbestimmt werden. Qualitätskontrollaufzeichnungen sollten geführt werden, um die Performance der gelieferten Reagenzien zu überwachen. Um Trends erkennen zu können, sollten angemessene statistische Methoden etabliert werden. Jedes Labor sollte Annahmekriterien für die Testperformance aufstellen. Weitere Parameter, die für eine Reproduzierbarkeit überwacht werden sollten, umfassen die 80, 50 und 20% Abschnitte der Standardkurve. Zusätzlich sollte die maximale Absorption mit früheren Messungen konsistent sein. Signifikante Abweichungen von der etablierten Leistungsfähigkeit können ein Indikator sein für unbemerkte Veränderungen der experimentellen Bedingungen oder Instabilität von Kitreagenzien. Um die Ursache der Abweichung zu ermitteln sollten frische Reagenzien verwendet werden. 9 ERGEBNIS 9.1 Mittelwert Die Mittelwerte der Optischen Dichte (OD) für jeden Standards, Kontrolle und Proben berechnen. 9.2 Standardkurve Zeichnen Sie eine Kurve mit den berechneten Mittel-Extinktionswerten der Standards in Bezug zu den Standardkonzentrationen. (z.b. mit 4 Parameter Gleichung) 9.3 Berechnung der Ergebnisse Um Konzentrationen der Proben zu ermitteln, werden die entsprechenden Werte mit der Standardkurve Interpoliert, die Konzentrationen sind in ng/ml ausgedrückt. Zur Berechnung der Cortisolkonzentration in Urin, den mit der Standardkurve berechnete Wert mit dem Volumen des 24h-Sammelurin wie folgt berechnen: ng/ml x Vol(mL) urine 24 h/ 1000 = μg Cortisol/24h 10 REFERENZWERTE Die Konzentration von Cortisol im 24 Stunden Urin sind im Bereich: μg / 24 Stunden Version 01/ / 5
6 11 ASSAY CHARAKTERISTIKA 11.1 Präzision Intra Assay Variation Die Intra-Assay-Variation wurde durch wiederholte Messung (20x) mit drei unterschiedlichen Urinproben in einem Ansatz durchgeführt. Die Intra Assay Variation beträgt 6.5% Inter Assay Variation Die Inter-Assay-Variation wurde durch wiederholte Messung (10x) mit drei unterschiedlichen Urinproben und verschiedenen Chargen durchgeführt. Die Inter Assay Variation beträgt 7.2% Genauigkeit (Wiederfindung) Die Wiederfindung von ng/ml Cortisol in aufgestockten Urin Proben gab einen Durchschnittswert (±SD) von % ± 8.16% mit Bezug auf die ursprünglichen Konzentrationen Sensitivität Die niedrigste nachweisbare Konzentration des Cortisol in Urin, die vom Nullstandard abweicht ist 2.95 ng/ml mit einer Vertrauensgrenze von 95% Spezifität (Kreuzreaktivität) In der folgenden Tabelle wurde die Kreuzreaktion des Antikörpers nach Abraham mit 50% kalkuliert: Cortisol 100 % Prednisolone 46.2 % 11-Deoxycortisol 4 % Cortisone 3.69 % Prednisone 3.10 % 11αOH Progesterone 1 % Progesterone < 0.1 % Aldosterone < 0.1 % Pregnenolone < 0.1 % 17b Estradiol < 0.1 % Estrone 3-solfato < 0.1 % Estriol < 0.1 % Testosterone < 0.1 % Spironolactone < 0.1 % DHEA < 0.1 % DHEA-S < 0.1 % Androstenedione < 0.1 % Androsterone < 0.1 % DHT < 0.1 % Danazol < 0.1 % Cholesterol < 0.1 % Dexamethasone < 0.1 % 11.5 Korrelation Der neue Cortisol Urine ELISA wurde mit dem Vorgänger Cortisol Urine ELISA verglichen. 100 Urinproben wurden analysiert. Die Linear-Regression Kurve wurde berechnet: y = 0.90* x r 2 = ENTSORGUNGSHINWEISE Die Beseitigung unterliegt den nationalen abfallrechtlichen Gesetzen und Verordnungen. 13 LITERATUR 1. Foster, L.B. and Dunn, R.T. Clin Chem: 20/3, 365 (1974) 2. De Laceda, L., Kowarski, A., and Migeon, C.J. J. Clin Endocr. and Metab: 36:227 (1973) 3. Rolleri, E., Zannino, M., Orlandini, S., Malvano, R. Clin chim Acta (1976) 4. Kobayashi, Y., et al. Steroids, 32 no. 1 (1978) 5. Arakawa, H., Maeda, M., Tsuji, A. Anal. Biochem (1979) Version 01/ / 5
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8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /
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