Chromogranin A RIA. Radio immunoassay for the quantitative determination of chromogranin A in human plasma.

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1 Instructions for Use Chromogranin A RIA Radio immunoassay for the quantitative determination of chromogranin A in human plasma. MI C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 EINLEITUNG Chromogranine und Sekretogranine bilden eine Familie einzigartiger saurer Proteine, die zusammen mit Neurotransmittern und Peptidhormonen in das Gehirn und das diffuse neuroendokrine System eingelagert werden (Winkler, H. & Fischer-Colbrie, R.1992). Strukturell stammen diese Proteine zwar von unterschiedlichen Genen, aber sie teilen manche allgemeinen Eigenschaften, haben eine Reihe von Aminosäuren gemeinsam und mehrere Paare basischer Aminosäuren als potentielle Positionen für post-translationale Gruppierungen. Chromogranine werden in den neuroendokrinen Zellen des gesamten Körpers zusammen mit Neuropeptiden und Hormonen eingelagert. Es wird vermutet, dass Chromogranine eine Rolle bei der Bildung von Hormonkörnchen und pakete spielt. Weiterhin können Chromogranine in kleinere Fragmente gespalten werden, die auch biologische Aktivitäten zeigen können, wie die Inhibierung der Hormonfreisetzung, Gefäßerweiterung und antimikrobielle Effekte. Tumore neuroendokrinen Ursprungs gehen normalerweise einher mit erhöhten Chromogranin A-Plasmakonzentrationen. Neuroendokrine Tumore werden von den neuroendokrinen Zellen und gebildet. Beispiele sind Krebstumore, Phaeochromozytom, Neuroblastom, das kleinzellige Lungenkarzinom, hyperparathyroide Adenoma, Schilddrüsentumore, Prostatakrebs und pankreatische Inselzelltumore, sowie die MEN1- und MEN2-Syndrome. Auch die verschiedenen neuroendokrinen Tumorsyndrome, in erster Linie die Gastrinoma, Insulinoma, Glucagonoma, Somatostatinoma gehören hierzu. PPoma und die non-functioning neuroendokrinen Tumore (Eriksson, B. et al. 2000). Für diese Tumore ist Chromogranin A der beste zirkulierende Marker (Bajetta, E. et al. 1999). Der erste Radioimmunoassay für die Messung von Chromogranin A wurde 1986 eingeführt (O Connor, D.T. & Deftos, L.J. 1986). Seitdem wurden andere Assays zur Messung von intaktem humanem Chromogranin A vorgestellt. Assays zur Messung von bestimmten Regionen des Chromogranin A wurden ebenso etabliert, wie spezifische Methoden für Pankreastatin und andere Regionen des Chromogranin A (Stridsberg, M. 2000). Der vorliegende Chromogranin A Test ist ein kompetitiver Assay mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern. Die Antikörper sind gerichtet gegen ein gereinigtes Fragment des Chromogranin A-Moleküls mit der Aminosäuresequenz Mit dem Assay werden sowohl intaktes Chromogranin A, als auch Fragmente bestimmt (Stridsberg, M. et al. 1993, Stridsberg, M. et al. 1995). 2

3 TESTPRINZIP Dieser Assay ist für die Bestimmung von Chromogranin A in humanem Plasma bestimmt. Das Testprinzip der Bestimmung von Chromogranin A mit dem Chromogranin A RIA Kit ist der kompetitive Radioimmunoassay, mit Antikörpern gegen humanes Chromogranin A. Das Chromogranin A aus den Standards und Proben konkurriert mit 125 I-markiertem Chromogranin A um die Bindungsstellen des Antikörpers. Das 125 I-Chromogranin A bindet umgekehrt proportional zur Chromogranin A-Konzentration der Standards und Proben. Das Antikörper-gebundene 125 I-Chromogranin A wird mit einem zweiten Antikörper, der an eine Festphase gebunden ist, von der ungebundenen Fraktion getrennt. Die gebundene Fraktion 125 I-Chromogranin A wird in einem Gammacounter bestimmt. Für den professionellen Gebrauch im medizinisch-diagnostischen Labor. KLINISCHE BEDEUTUNG Tumore neuroendokrinen Ursprungs gehen normalerweise einher mit erhöhten Chromogranin A-Plasmakonzentrationen. Neuroendokrine Tumore werden von den neuroendokrinen Zellen und gebildet. Beispiele sind Krebstumore, Phaeochromozytom, Neuroblastom, das kleinzellige Lungenkarzinom, hyperparathyroide Adenoma, Schilddrüsentumore, Prostatakrebs und pankreatische Inselzelltumore, sowie die MEN1- und MEN2-Syndrome. Auch die verschiedenen neuroendokrinen Tumorsyndrome, in erster Linie die Gastrinoma, Insulinoma, Glucagonoma, Somatostatinoma gehören hierzu. PPoma und die non-functioning neuroendokrinen Tumore. Normale Plasmawerte von Chromogranin A: <4.0 nmol/l. Referenzmaterial: 40 gesunde Probanden, 17 Männer und 23 Frauen. Alter Jahre. Chromogranin A-Konzentrationen von nmol/l deuten auf neuroendokrine Tumore und sollten mit erneuter Probenahme und Analyse bestätigt werden. Chromogranin A-Konzentrationen >10.0 nmol/l sind ein starker Hinweis auf neuroendokrine Tumore. Nicht tumor-bedingtes Ansteigen von Chromogranin A Erhöhte Werte von Chromogranin A können auftreten bei Patienten mit verminderter Nierenfunktion, Patienten mit atrophischer Gastritis und Patienten, die laufend mit Medikamenten, die die Protonenpumpe hemmen, behandelt werden. 3

4 VORSICHTSMASSNAHMEN Nur zum in vitro Gebrauch. Es ist notwendig, dass die für das Labor verantwortliche Person mit den im jeweiligen Land gültigen, gesetzlichen Bestimmungen im Umgang mit radioaktivem Material vertraut ist. Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanes Material enthalten, ergaben bei der Prüfung auf HCV, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Es sollten geeignete Maßnahmen zum sicheren Umgang mit dem radioaktiven Material ergriffen werden. Nur autorisierte Personen sollten Zugang zu den Reagenzien haben. Die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sollten beim Umgang mit radioaktivem Material beachtet werden: - Radioaktives Material muß in speziell ausgewiesenen Räumen gelagert werden, die für nicht authorisiertes Personal nicht zugänglich sind. - Der Umgang mit radioaktivem Material darf nur in speziell gekennzeichneten Räumen erfolgen. - Vorsicht ist geboten vor oraler oder dermaler Aufnahme von radioaktiven Stoffen oder Kontamination von Kleidung. Nicht mit dem Mund pipettieren. - Bei der Testdurchführung darf weder gegessen, getrunken oder geraucht werden. - Es wird empfohlen Einmalhandschuhe zu tragen. Nach Gebrauch radioaktiven Materials Hände waschen. - Beim Umgang mit radioaktivem Material sollten die Labortische mit absorbierendem, wegwerfbarem Material abgedeckt sein. - Verschüttetes radioaktives Material sollte sofort aufgenommen werden und kontaminiertes Material als radioaktiver Abfall entsorgt werden. Kontaminierte Tischoberflächen sollten mit einem Detergenz gesäubert werden. Kitkomponenten enthalten Natriumazid. Kontakt mit Kupfer- oder Bleirohren kann zur Bildung von hochexplosiven Ablagerungen führen. Daher beim Einbringen in Abflüsse mit reichlich Wasser nachspülen, was die Bildung von Metallaziden verhindert. Rohre, die wahrscheinlich dies explosiven Ablagerungen enthalten vorsichtig mit 10%iger Natronlauge spülen. 4

5 KOMPONENTEN DES KITS Die Reagenzien dieses Testkits sind ausreichend für 100 Bestimmungen. 1. Anti-Chromogranin A (Reagenz A) Kaninchen-Antiserum gegen humanes Chromogranin A (Aminosäuren ). Das Antiserum wird in 2.0 ml 0.25 M Phosphatpuffer verdünnt und lyophilisiert, ph 7.4, mit 1.0% bovinem Serumalbumin, M NaCl, 0.25% NaN 3 und 2.5% Tween 20. Farbe: Gelb. In 11.0 ml bidest. Wasser rekonstituieren I-Chromogranin A (Reagenz B) Aktivität: 56 KBq (1.5 µci) am Markierungstag. Lyophilisiert in 2.5 ml 0.25 M Phosphatpuffer, ph 7.4, mit 1.0% bovinem Albumin, M NaCl, 0.25% NaN 3 und 2.5% Tween 20. Farbe: Blau. In 12.5 ml bidest. Wasser rekonstituieren. 3. Doppel-Antikörper-Festphase (Reagenz C) Anti-Kaninchen-Ig gekoppelt an Zellulosepartikel. 54 ml Suspension. 4. Assay Verdünner (Reagenz D) 50 ml 0.05 M Phosphatpuffer, ph 7.4, mit 0.2% bovinem Serumalbumin, M NaCl, 0.05% NaN 3 und 0.5% Tween 20. Der Puffer wird zur Verdünnung der Proben, Herstellung der Arbeitsstandards und zum Pipettieren in die NSB-Röhrchen anstelle des Antiserums benötigt. 5. Chromogranin A Standard (Reagenz E) Konzentration: 10.0 nmol/l Volumen: 5.00 ml Standard nach Rekonstitution. Lyophilisiert in 5.00 ml 0.05 M Phosphatpuffer, ph 7.4 mit 0.2% bovinem Serumalbumin, M NaCl, 0.05% NaN 3 und 0.5% Tween 20. In 5.00 ml bidest. Wasser rekonstituieren. 6. Kontrollen (Reagenz F-G) Lyophilisierte Kontrollen mit zwei verschiedenen Bereichen an Chromogranin A. Jede Kontrolle hat nach Rekonstitution ein Volumen von 1.00 ml. Die Chromogranin A- Konzentrationen sind den Etiketten auf den Fläschchen zu entnehmen. Die Kontrollen sollten nach dem Rekonstituieren nicht verdünnt werden. In 1.00 ml bidest. Wasser rekonstituieren. 5

6 ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) Destilliertes Wasser Einmal-Teströhrchen x 55 mm, Polystyrol Pipetten mit Einmalspitzen, 50, 100 und 500 µl Volumenpipetten: 1,00 und 5,00 ml Vortexmixer Zentrifuge, geeignet für mindestes 1.700xg (vorzugsweise Kühlzentrifuge) Gamma-Counter VORBEREITUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Die Reagenzien sollten bei 2 8 C gelagert werden. Das Verfallsdatum sowie die Chargenbezeichnung sind auf jedem Fläschchen angegeben. Bei lyophilisierten Reagenzien gilt das Verfallsdatum für die ungeöffnete Flasche. Nach Rekonstitution haben die Reagenzien eine Haltbarkeit von 10 Wochen, wenn ordnungsgemäß gelagert. Das für die Rekonstitution der lyophilisierten Reagenzien verwendete Wasser sollte mit einer Glasapparatur gewonnen werden, oder von entsprechender Reinheit sein. Den Inhalt der Fläschchen vorsichtig unter Vermeidung von Schaumbildung lösen. Reagenz A: Anti-Chromogranin A Mit 11.0 ml bidest. Wasser rekonstituieren. Lagerung bei 2-8 C. Reagenz B: 125I-Chromogranin A Mit 12.5 ml bidest. Wasser rekonstituieren. Lagerung bei -20 C oder tiefer. Reagenz C: Doppel-Antikörper-Festphase Gebrauchsfertig. Während des Pipettierens ständig rühren. Lagerung bei 2 8 C Reagenz D: Assay Verdünner Gebrauchsfertig. Lagerung bei 2 8 C Reagenz E: Chromogranin A Standard Mit 5.00 ml bidest. Wasser rekonstituieren. Lagerung bei -20 C oder tiefer. Reagenz F-G: Kontrollen Mit 1.00 ml bidest. Wasser rekonstituieren. Lagerung bei -20 C oder tiefer. 6

7 PROBENGEWINNUNG Vor der Blutentnahme sollten die Patienten mindestens 8 Stunden nüchtern sein. Venenblut wird in Röhrchen mit Heparin (144 U.S.P Heparin in einem 10 ml Röhrchen) gesammelt. Die Proben werden bis zur Gerinnung in einem Eisbad gekühlt. Serum wird durch Zentrifugation bei 2-4 C gewonnen. Das Serum sollte innerhalb von 3 Stunden nach der Entnahme eingefroren und bei -20 C oder tiefer bis zur Analyse gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen sollte vermieden werden. TESTDURCHFÜHRUNG Rekonstituiere die Reagenzien wie beschrieben. Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden. Genauigkeit bei allen Pipettierschritten ist entscheidend. Alle Tests (Standards, Kontrollen und Proben) sollten in Doppelbestimmungen durchgeführt werden. Ein kompletter Testansatz beinhaltet: Standards (St-Röhrchen) 7 Konzentrationen (0, 0.156, 0.313, 0.625, 1.25, 2.50 und 5.00 nmol/l Kontrollen (C-Röhrchen) niedrig und hoch Proben (P-Röhrchen) Röhrchen für die Bestimmung der nicht spezifischen Bindung (NSB-Röhrchen) Röhrchen für die Bestimmung der Totalaktivität (TOT-Röhrchen) Siehe Übersicht Seite 12. Verdünnung der Proben Plasmaproben sollten 1:10 mit Assay Verdünner (Reagenz D) vor dem Assay verdünnt werden. Proben mit Chromogranin A-Konzentrationen über 50 nmol/l können mit Assay Verdünner weiter verdünnt und erneut gemessen werden. 7

8 ARBEITSSCHRITTE 1. Die lyophilisierten Reagenzien wie beschrieben rekonstituieren. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. 2. Herstellen der Chromogranin A-Arbeitsstandards durch Verdünnung des Chromogranin A Standards nmol/l (Reagenz E) mit Assay Verdünner (Reagenz D) nach dem folgenden Schema: a ml Standard nmol/l ml Assay Verdünner = 5.00 nmol/l b ml Standard 5.00 nmol/l ml Assay Verdünner = 2.50 nmol/l c ml Standard 2.50 nmol/l ml Assay Verdünner = 1.25 nmol/l d ml Standard 1.25 nmol/l ml Assay Verdünner = nmol/l e ml Standard nmol/l ml Assay Verdünner = nmol/l f ml Standard nmol/l ml Assay Verdünner = nmol/l g. Assay Verdünner = 0 nmol/l Die Standards bei 20 C oder tiefer lagern. 3. Plasmaproben 1:10 mit Assay Verdünner verdünnen, z.b. 50 µl Plasma und 450 µl Assay Verdünner. Vorsichtig vortexen. 4. Standards ( nmol/l), Kontrollen und Proben in die entsprechenden Röhrchen pipettieren. 5. Nullstandard (Assay Verdünner) in die NSB-Röhrchen pipettieren I-Chromogranin A (Reagenz B) in alle Röhrchen pipettieren. Die TOT- Röhrchen verschließen und beiseite stellen. 7. Anti-Chromogranin A (Reagenz A) in alle Röhrchen außer NSB- und TOT- Röhrchen pipettieren. 8. Assay Verdünner (Reagenz D) in die NSB-Röhrchen pipettieren. 9. Alle Röhrchen vorsichtig vortexen Stunden bei 2-8 C inkubieren. 11. Doppel-Antikörper-Festphase (Reagenz C) in alle Röhrchen außer TOT-Röhrchen pipettieren. Während des Pipettierens das Reagenz ständig auf einem Magnetrührer mischen. Vorsichtig vortexen Minuten bei 2-8 C inkubieren Minuten bei +4 C zentrifugieren (mind x g). 14. Überstände abdekantieren. 15. Radioaktivität der Pellets aller Röhrchen in einem Gammacounter messen. Messzeit: 1-3 Minuten (mind Counts sollten in den TOT-Röhrchen gefunden werden). 8

9 TESTAUSWERTUNG Bei Doppelbestimmung wird der cpm-mittelwert berechnet. Von den Mittelwerten der Standards wird der cpm-mittelwert der Nichtspezifischen Bindung (NSB) der Standards und von den Mittelwerten der Proben und Kontrollen der cpm-mittelwert der Nichtspezifischen Bindung (NSB) der Proben subtrahiert. Für jeden Standard, Kontrolle und Probe wird % B/TOT wie folgt berechnet: % B/TOT = cpm (Mittelwert Standard/Probe - Mittelwert NSB) x 100 cpm TOT (Mittelwert) % B/TOT der Standards (y-achse) wird gegen die entsprechende Konzentration in pmol/l (x- Achse) aufgetragen. Die gefundenen Konzentrationen müssen mit dem Verdünnungsfaktor 10 (bzw. tatsächlichen Verdünnungsfaktor bei weiterer Verdünnung der Probe) multipliziert werden. Steht ein entsprechendes Computerprogramm zur Verfügung, so können die Standardkurve und die Berechnung der Konzentrationen der Proben durch ein entsprechendes Computerprogramm durchgeführt werden, z.b. unter Anwendung einer Spline-Methode. QUALITÄTSKONTROLLE Um eine gleichbleibende Testqualität sicherzustellen, sollte jedes Labor die folgenden Punkte beachten: a. Die wiedergefundenen Konzentrationen der Kontrollseren (Reagenz F und G) sollten innerhalb der auf den Etiketten angegebenen Werten liegen. b. Total Counts Die gefundenen Counts sollten annähernd den erwarteten CPM entsprechen, je nach Wirkungsgrad des Gammacounters und radioaktivem Zerfall. Der Gehalt an 125 I- Chromogranin dieses Kits beträgt ca CPM (-10 %, +20 %) am Tag der Markierung (Wirkungsgrad des Counters = 80 %). c. Maximale Bindung (Bo/TOT) Für jeden Assay wird die gebundene Radioaktivität des Nullstandards (Bo/TOTx100) berechnet. Bo/TOTx100 beträgt normalerweise % am Tag der Markierung. Gegen Ende der Laufzeit kann der Wert um einige Prozent absinken. d. Unspezifische Bindung (NSB/TOT) Für jeden Assay wird die unspezifische Bindung in Prozent (NSB/TOTx100) berechnet. Die NSB/TOTx100 beläuft sich auf weniger als 6 %, wenn korrekt dekantiert wird. e. Form der Standardkurve Als Marker für die Reproduzierbarkeit können die Punkte bei 80, 50 und 20 % der Standardkurve von Testlauf zu Testlauf verwendet werden. 9

10 TESTCHARAKTERISTIKA Sensitivität Die untere Nachweisgrenze, definiert als die zweifache Standardabweichung des Nullstandards, beträgt 0.04 nmol/l (bezogen auf die Standardkurve). Die untere Nachweisgrenze für 1:10 verdünnte Proben beträgt 0.4 nmol/l. Präzision Intra assay Konzentration Variationskoeffizient (VK %) N 0.74 nmol/l 6.9% nmol/l 4.5% nmol/l 4.6% nmol/l 5.8% 30 Inter assay (Gesamtvarianz) Konzentration Variationskoeffizient (VK %) N 0.44 nmol/l 9.1% nmol/l 5.0% 10 Spezifität Das Antiserum erkennt Chromogranin A (immunogen), intaktes Chromogranin A sowie Fragmente. Es wurde keine Kreuzreaktivität mit NPY, PP, VIP, Substanz P, Glukagon, Amylin, Somatostatin, Calcitonin-Gene-Related-Peptide und Pankreastatin gefunden (M. Stridsberg et al 1993 and 1995). 10

11 ASSAY SCHEMA Röhrchen- Typ Röhrchen Nr. Standard Probe oder Kontrolle 125 I- Chromogranin A Anti- Chromogranin A Assay Verdünn er Doppel- Anti- körper- Festphase TOT NSB Stand 0 Stand 0.16 Stand 0.32 Stand 0.63 Stand 1.25 Stand 2.50 Stand 5.00 Kontr. F Kontr. G Probe 1 Probe 2 etc (B) (A) - - (D) Vortexen und für h bei 2-8 C inkubieren. (C) - Vor-texen und für min bei 2-8 C inkubieren. 15 min. bei 1700 x g und +4 C inkubieren. Dekantieren und Radioaktivität der Pellets messen. 11

12 BEISPIEL EINER STANDARDKURVE Mittelcpm Korrigierte cpm B/T % B/Bo % Total Counts NSB 951 Standard 0 nmol/l Standard nmol/l Standard nmol/l Standard nmol/l Standard 1.25 nmol/l Standard 2.50 nmol/l Standard 5.00 nmol/l Beispiel Standardkurve B/Bo % CHROMOGRANIN A STANDARD CURVE nmol/l 12

13 LITERATUR 1. Bajetta, E., Ferrari, L., Martinetti, A., Celio, L., Procopio, G., Artale, S., Zilembo, N., Di Bartolomeo, M., Seregni, E. and Bombardieri, E. Chromogranin A, neuron specific enolase, carcinoembryonic antigen, and hydroxyindole acetic acid evaluation in patient with neuroendocrine tumours. Cancer 1999, 86: Eriksson, B., Öberg, K. and Stridsberg, M. Tumour markers in neuroendocrine tumours. Digestion 2000, 62: O Connor, D.T. and Deftos, L.J. Secretion of chromogranin A by peptide-producing endocrine neoplasms. New England Journal of Medicine 1986, 314: Stidsberg, M., Hellman, U., Wilander, E., Lundqvist, G., Hellsing, K. and Öberg, K. Fragments of chromogranin A are present in the urine of patients with carcinoid tumours: Development of a specific radioimmunoassay for chromogranin A and its fragments. Journal of Endocrinology 1993, 139: Stridsberg, M., Öberg, K., Li, Q., Engström, U. and Lundqvist, G. Measurements of chromogranin A, chromogranin B (secretogranin I), chromogranin C (secretogranin II) and pancreastatin in plasma and urine from patients with carcinoid tumours and endocrine pancreatic tumours. Journal of Endocrinology 1995, 144: Stridsberg, M. Measurements of chromogranins and chromogranin-related peptides by immunological methods. Advanced Experimental and Medical Biology 2000, 482: Winkler, H. and Fischer-Colbrie, R. The chromogranin A and B: The first 25 years and future perspectives. Neuroscience 1992, 49:

14 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International B.V. Zutphenseweg 55, 7418 AH Deventer, The Netherlands IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /