Rheumatoid Factor IgA ELISA

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1 Arbeitsanleitung Rheumatoid Factor IgA ELISA Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von IgA Rheumafaktoren (RF) in humanem Serum oder Plasma. RE Nur zur allgemeinen Veranschaulichung. Den Assay nur mit der mitgelieferten Arbeitsanleitung durchzuführen. Distributed by: I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 ANWENDUNG RF IgA ist ein Reagenziensatz zur quantitativen Bestimmung von IgA Rheumafaktoren (RF) in humanem Serum oder Plasma zur Diagnose der Rheumatoiden Arthritis (RA). Patienten, die an einer RA leiden, weisen RF Autoantikörper im Serum auf, die mit dem Fc Teil von IgG reagieren. RA oder auch die Chronische Polyarthritis ist durch eine nicht geklärte Ätiologie gekennzeichnet und stellt die häufigste systemische entzündlichrheumatische Erkrankung mit einer Prävalenz von bis zu 1% dar. Eine der typischen klinischen Manifestationen der RA ist die symmetrische Synovialitis der Arm- und Beingelenke, welche mit einer Beteiligung der Wirbelsäule einhergehen kann. Neben klinischen Gesichtspunkten stellt der Nachweis von RF eine der Kriterien der American Association of Rheumatology für die Diagnose der RA dar (1). Bis zu 80% der RA Patienten können RF aufweisen. RF können einige Jahre vor dem Auftreten von klinischen Manifestationen der RA nachgewiesen werden. RF positive, augenscheinlich gesunde Individuen besitzen ein 5-40fach höheres Risiko hinsichtlich des Auftretens einer RA (2). Bei Patienten mit anderen autoimmunen, infektiösen oder B Zell-lymphoproliferativen Erkrankungen als auch bei Gesunden können jedoch ebenfalls RF gefunden werden. Hohe RF Konzentration sind häufig mit einer schweren RA assoziiert, welche durch eine progressive Destruktion der Gelenke gekennzeichnet ist. Hohe Konzentrationen werden ebenfalls in Patienten mit extraarticulären Manifestationen wie z.b. Rheumaknötchen, Polyneuropathien, Vasculitiden und Sicca Syndrom gefunden. RF Antikörper können allen Subklassen (IgM, IgG, IgA) angehören, wobei IgM RF die häufigste anzutreffende Subklasse bei RA Patienten ist. Extraarticuläre Manifestationen können vor allem mit IgA RF assoziiert zu sein. Hohe Konzentrationen von IgG RF scheinen ähnlich wie RF IgM bei Patienten mit einem schwereren Verlauf der Erkrankung mit progressive Erosionen der Gelenke aufzutreten. IgA und IgG Rheumafaktoren gelten bei einer Langzeit-RA als prognostische Indikatoren für eine systemische Manifestation. (1) Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, et al.: The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum (2) MacGregorFJ, Silman AJ.: Rheumatoid factors as predictors of rheumatoid arthritis. J Rheumatol TESTPRINZIP PATIENTENPROBEN Gewinnung und Lagerung Blut durch Venenpunktion entnehmen, gerinnen lassen und das Serum durch Zentrifugation isolieren. Plasma kann ebenfalls verwendet werden. Lipämische, hämolisierte oder kontaminierte Proben dürfen nicht verwendet werden. Die Lagerung der Proben ist bis zu 3 Tagen bei 2-8 C möglich, Darüber hinaus müssen die Proben bei - 20 C eingefroren werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden, ggf. sollte vor dem Einfrieren aliquotiert werden. Vorbereitung und Verwendung Vor dem Einsatz im RF IgA werden die Proben auf Raumtemperatur gebracht. Grundsätzlich sollte durch kurzes Aufschütteln eine entsprechende Homogenität gesichert werden. Achtung: Die Patientenproben müssen vor Einsatz im Test (v/v) verdünnt werden, z. B. 10 µl Probe + 1,0 ml Probenverdünner C (Kalibratoren sind bereits entsprechend vorverdünnt). TESTKOMPONENTEN FÜR 96 BESTIMMUNGEN A Ag 96 B BUF WASH Mikrotiterplatte mit 12 Streifen zu je 8 Kavitäten (insgesamt 96) beschichtet mit aggregiertem Kaninchen IgG Waschpuffer für 1000 ml Lösung 1 vakuumversiegelt mit Trockenbeutel 100 ml Konzentrat weiße Kappe C Probenverdünner 100 ml DIL schwarze Kappe D CONJ 10x Konjugat enthält anti-human-iga vom Schaf, gekoppelt mit POD 15 ml violette Kappe RF IgA ist ein Reagenziensatz zur quantitativen Bestimmung von IgA Rheumafaktor in humanem Serum oder Plasma. Die RF IgA in den Kalibratoren, der Positiv-Kontrolle und verdünnten Patientenproben reagieren im ersten Reaktionsschritt mit an der festen Phase gebundenem aggregierten Kaninchen IgG. Nicht gebundene Probenkomponenten werden nach 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur (RT) durch einen Waschschritt entfernt. Die gebundenen Antikörper reagieren im zweiten Reaktionsschritt spezifisch mit anti-human-iga, das an Meerretichperoxidase (POD) gekoppelt ist. Überschüssige Konjugatmoleküle werden nach 30 Minuten Inkubationszeit bei RT von den an der festen Phase gebundenen Immunkomplexen durch drei Waschschritte getrennt. E SOLN TMB F H2SO4 0.25M Substrat 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin in Citratpuffer mit Wasserstoffperoxid Stopplösung 0,25 M Schwefelsäure 0-4 Kalibratoren CAL (Verdünntes Serum) Konz.: 1, 10, 30, 100, 300 U/mL 15 ml blaue Kappe 15 ml gelbe Kappe je 1,0 ml weiße Kappe Die POD setzt im folgenden enzymatischen Reaktionsschritt die farblose Substratlösung mit 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin (TMB) in ein blaues Endprodukt um. Diese Reaktion wird nach 15 Minuten Inkubation durch Zugabe einer sauren Stopplösung abgebrochen, wodurch ein Farbumschlag der blauen Lösung zu gelb auftritt. Die bei 450 nm gemessene optische Dichte (OD) des Endprodukts ist zur Konzentration der spezifisch gebundenen Antikörper direkt proportional. Mit den ermittelten OD-Werten der Kalibratoren und deren entsprechenden Konzentrationen wird eine Standardkurve erstellt. Die unbekannten Patientenwerte werden an dieser Standardkurve direkt abgelesen. P Positive Kontrolle CONTROL (Verdünntes Serum) Konz.: siehe Beipackzettel + 1,0 ml rote Kappe Zusätzlich benötigte Materialien und Hilfsmittel - verstellbare Einkanal-Mikropipette - 8-Kanalpipette bzw. Multipipette - Pipettenspitzen - 8-Kanal-Handwaschkamm mit Vakuumpumpe und Abfallbehältern oder Mikrotiterplatten-Waschgerät - Mikrotiterplatten-Photometer mit optischen Filtern für 450 nm und 620 nm oder 690 nm - Bechergläser - Eppendorfröhrchen 2 ml - destilliertes oder deionisiertes Wasser v04/ / 4

3 Menge und Lagerung Jede Packung RF IgA enthält die Reagenzien für 96 Bestimmungen. Das Verfallsdatum des kompletten Reagenziensatzes ist auf dem Außenetikett des Testbesteckes angegeben. Die Verfallsdaten der Einzelreagenzien können ggf. darüber hinausgehen und sind auf den jeweiligen Reagenzien vermerkt. Bis zur Verwendung sind alle Reagenzien des RF IgA bei 2-8 C zu lagern. Alle geöffneten Testbesteckbestandteile sind bei ordnungsgemäßer Lagerung bei 2-8 C mindestens 2 Monate haltbar. Vorbereitung und Verwendung Die Mikrotiterplatte mit den Strips ist in einem aluminiumbeschichteten Beutel zusammen mit Trockenmittel vakuumversiegelt. Öffnen der Verpackung erst nach dem Erreichen der Raumtemperatur. Nicht gebrauchte Kavitäten vor Feuchtigkeit schützen und zusammen mit dem Trockenmittel in den Beutel zurücklegen und verschließen. Waschpufferkonzentrat 10fach (1 + 9) mit destilliertem oder deionisiertem Wasser verdünnen. Beispiel: 8 ml Waschpufferkonzentrat + 72 ml destilliertes Wasser pro Streifen. Die auf diese Weise verdünnte Waschlösung ist bei 2-8 C mindestens 30 Tage haltbar. Beim Waschvorgang dispensierte Waschlösung mindestens 10 Sekunden einwirken lassen und Waschlösungsreste durch gründliches Absaugen oder Ausschlagen der Kavitäten entfernen. Substrat lichtgeschützt aufbewahren. TESTDURCHFÜHRUNG Patientenproben (v/v) vorverdünnen z. B. 10 µl Serum + 1,0 ml Probenverdünner (C) BERECHNUNG DER ERGEBNISSE Die OD-Mittelwerte (MW) von Kalibrator 0 (1 U/mL, optional) sowie der Kalibratoren 1 bis 4 werden auf der Ordinate (lin.) gegen die entsprechende RF IgA Antikörper-Konzentrationen (Abszisse, log. Maßstab) aufgetragen. Daraus wird eine Standardkurve gezeichnet, aus der sich über die OD-MW die jeweiligen RF IgA Konzentrationen der unbekannten verdünnten Patientenproben direkt in U/mL ablesen lassen. Sofern die oben angegebene Probenverdünnung angewendet wird, bedarf es keines Multiplikationsfaktors zur Ermittlung der Konzentration der RF IgA, da die Kalibratoren bereits in dieser Verdünnung vorliegen. Diese Auswertung lässt sich auch automatisch über die integrierte Auswerteeinheit des Mikrotiterplatten-Photometers oder durch ein lieferbares Computerprogramm durchführen. BERECHNUNGSBEISPIEL Kavität OD (a) OD (b) OD (Mittelwert) U/m L Kalibrator 0 0,064 0,050 0,057 1 Kalibrator 1 0,257 0,269 0, Kalibrator 2 0,630 0,612 0, Kalibrator 3 1,343 1,381 1, Kalibrator 4 2,176 2,225 2, Patient 1 0,478 0,494 0, ,5 2 STANDARDKURVE (Beispiel) Die Reihenfolge der Pipettierschritte und deren Durchführung im Zeittakt sind einzuhalten. 1. Die Testreagenzien und die benötigte Anzahl an Kavitäten auf Raumtemperatur (18-25 C) bringen und alle Reagenzien vor Gebrauch schütteln. OD 450 nm 1, Pipettieren von 100 µl Kalibratoren 1-4, (Kalibrator 0 optional) 100 µl positive Kontrolle (P) 100 µl der verdünnten Patientenseren in die vorgesehenen Kavitäten. 3. Platte abdecken, 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 4. Dekantieren und 3 mal mit 300 µl Waschlösung (verdünnt aus B) waschen µl Konjugat (D) in jede Kavität pipettieren. 6. Platte abdecken, 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 7. Dekantieren und 3 mal mit 300 µl Waschlösung (verdünnt aus B) waschen µl Substrat (E) in jede Kavität pipettieren. 9. Platte abdecken, 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) im Dunkeln inkubieren µl Stopplösung (F) in jede Kavität pipettieren und kurz schütteln. 11. Messen der OD bei 450 nm gegen 620 (690) nm mit einem Mikrotiterplatten-Photometer innerhalb von 30 Minuten. 0, RF IgA (U/ml) Bei Proben, deren OD-Werte diejenige des Kalibrators 4 überschreiten, ist die Bestimmung mit einer höheren Proben- Vorverdünnung zu wiederholen. Zur Ermittlung der Konzentration solcher Proben ist die gemessene Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren. Testvalidierung Der Test kann ausgewertet werden, wenn: OD-Mittelwert von Kalibrator 1 0,5 OD-Mittelwert von Kalibrator 4 1,2 Sind die o. g. Gültigkeitskriterien nicht erfüllt, muss der Testansatz wiederholt werden. Stellen Sie sicher, dass die Abarbeitung strikt gemäß Testanleitung erfolgt (korrekte Reagenzienvorbereitung, korrekte Inkubationszeiten und -temperaturen, sorgfältiges Waschen). Sollten die Gültigkeitskriterien auch nach wiederholtem Testansatz nicht erfüllt sein, kontaktieren Sie bitte den Hersteller. v04/ / 4

4 REFERENZWERTE RF IgA Negativ Positiv Graubereich < 25 U/mL > 30 U/mL U/mL Aufgrund von Unterschieden in der Population wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen pathologischen und normalen Referenzbereiche für RF IgA Spiegel bestimmen sollte. Oben genannte Werte sind deshalb nur als Empfehlung zu werten. Antikörperkonzentrationen im Graubereich sollten erneut im RF IgA bestimmt werden. Gegebenenfalls empfiehlt es sich, eine weitere entnommene Serumprobe zu untersuchen. Grenzen der Methode Gesunde Individuen sollten mit dem RF IgA Testbesteck negativ bestimmt werden. Asymptomatische Probanden können jedoch positive RF IgA Konzentrationen aufweisen. Eine klinische Diagnose sollte nicht allein mit Hilfe der Ergebnisse einer einzelnen diagnostischen Methode erhoben werden. Zur Diagnosestellung sollten vom Arzt alle möglichen klinischen und Laborbefunde berücksichtigt werden. TESTCHARAKTERISTIKA Kalibrierung Das RF IgA Testbesteck ist an der WHO Referenzpräparation W1066 (Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service, Amsterdam) kalibriert. Parallelität Definierte Verdünnungen von ausgewählten positiven Serumproben in RF IgA Antikörper freiem Humanserum werden im RF IgA Testbesteck mit ihren theoretisch erwarteten Werten wieder gefunden. Sensitivität Die analytische Sensitivität des RF IgA beträgt 3 U/mL. Präzision Intra-Assay Varianz n = 10 Probe MW (U/mL) SD CV (%) 1 9 0,6 6, ,4 6, ,8 6,4 Inter-Assay Varianz n = 4 Probe MW (U/mL) SD CV (%) ,8 4, ,1 4, ,8 4,2 v04/ / 4

5 ASSAY - SCHEMA RF IgA Verdünnen der Patientenseren 10 µl Serum + 1,0 ml Probenverdünner (C) 1 Alle Reagenzien auf Raumtemperatur (RT) (18-25 C) bringen Kalibratoren Kontrolle Seren 2 Pipettieren Kalibratoren (0 4) 100 µl Kontrolle (P) 100 µl verdünnte Seren 100 µl 3 Inkubieren 60 min bei Raumtemperatur (18-25 C) 4 Waschen Dekantieren, 3 x 300 µl (verdünnt aus B) 5 Pipettieren Konjugat (D) 100 µl 100 µl 100 µl 6 Inkubieren 30 min bei Raumtemperatur (18-25 C) 7 Waschen Dekantieren, 3 x 300 µl (verdünnt aus B) 8 Pipettieren Substrat (E) 100 µl 100 µl 100 µl 9 Inkubieren im Dunkeln 15 min bei Raumtemperatur (18-25 C) 10 Pipettieren Stopplösung (F) 100 µl 100 µl 100 µl 11 Messen 450 gegen 620 (690) nm innerhalb 30 min. ALLGEMEINE HINWEISE und VORSICHTSMASSNAHMEN Dieser Reagenziensatz ist zum in vitro-gebrauch bestimmt und muss von geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Die Arbeitsanleitung ist strikt einzuhalten. Das Testbesteck oder seine geöffneten Reagenzien sind nur innerhalb der angegebenen Haltbarkeitsfristen zu verwenden. Das Mischen von Testbesteckkomponenten verschiedener Chargen ist nicht erlaubt. Dies gilt auch für die Verwendung von Reagenzien anderer Hersteller zur Komplettierung eines geöffneten Testbestecks. Die empfohlene Lagertemperatur angebrochener Reagenzien bis zur Wiederverwendung beträgt 2-8 C. Einige Reagenzien enthalten geringe Mengen Kathon (1,0 % v/v) und Thimerosal (0,01 % w/v) als Konservierungsmittel. Reagenzien nicht verschlucken und Kontakt mit Schleimhäuten vermeiden. Alle Reagenzien dieses Testbestecks, die humanen Ursprungs sind, ergaben bei der Prüfung auf HBsAg (Hepatitis B surface Antigen) bzw. AK gegen HIV (Human Immunodeficiency Virus) und HCV (Hepatitis C Virus) ein negatives Ergebnis. Dennoch kann das Vorhandensein infektiöser Erreger durch keinen Test mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb immer wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Beim Umgang mit den Komponenten des Testbestecks sowie mit den Patientenproben und Kontrollen sind die Vorschriften zur Unfallverhütung beim Umgang mit potentiell infektiösem Material und gefährlichen Chemikalien zu beachten. Insbesondere sind folgende Regeln einzuhalten: - Nicht essen, trinken oder rauchen! - Nie mit dem Mund pipettieren! - Handschuhe zur Vermeidung von Kontakt mit den Reagenzien und Seren tragen! - Sicherheitshinweise zu den einzelnen Testkomponenten beachten! Wir empfehlen, mittels laborinterner Kontrollseren eigene Qualitätskontrollen durchzuführen (s.a. Eichordnung, Bundesgesetzblatt I, S. 1657, 1988 sowie Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, Dt. Ärzteblatt 98, Heft 42, S. A , 2001). v04/ / 4

6 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer. Symbols Version 3.5 /