IRT neonatal screening ELISA

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1 Arbeitsanleitung IRT neonatal screening ELISA Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von immunreaktivem Trypsin (IRT) in Trockenblutproben von humanen Neugeborenen. Für das Neugeborenenscreening auf Mukoviszidose (zystische Fibrose, ZF). RE53275/RE / C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Enzymimmunoassay zur quantitativen Bestimmung von immunreaktivem Trypsin (IRT) in Trockenblutproben von humanen Neugeborenen. Für das Neugeborenenscreening auf Mukoviszidose (zystische Fibrose, ZF). 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Zystische Fibrose (ZF) ist eine der meist verbreitesten autosomal rezessiven Erkrankungen, die durch Mutation des CFTR Gens (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) verursacht wird. ZF kann zum frühen Tode führen, vor allem durch fortgeschrittene Lungenkrankheit, aber oftmals auch durch zahlreiche andere betroffene Organe. ZF tritt mit einer Inzidenz von ca. 1:2000 1:5000 Lebendgeburten in Europa und Nordamerika auf. Die ersten Fälle von zystischer Fibrose bei der Untersuchung von Neugeborenen in Europa wurden in den frühen siebziger Jahren beschrieben, als die ersten Programme den Albumingehalt im Mekonium untersuchten. Die Erhöhung von immunreaktivem Trypsin (IRT) im Blut von Neugeborenen mit ZF und seine Bestimmung aus Trockenblutproben wurde zum ersten Mal 1979 beschrieben. Im folgenden Jahrzehnt wurde die Bestimmung der IRT-Konzentration in Fersenblut in mehreren Ländern eingeführt. Weitere Verbesserungen wurden nach dem Klonen des CFTR Gens 1989 erreicht. Die anschließende Identifizierung der am meisten verbreiteten CFTR Genmutationen ermöglichte zudem die Einführung von DNA-Untersuchungen in das Neugeborenenscreening. Studien haben gezeigt, dass die frühe Diagnose der ZF in Kombination mit einer radikalen Ernährungstherapie den langfristigen Ernährungszustand signifikant verlängern kann. Die am weitesten verbreiteten Verfahren für das ZF-Screening sind (a) die Messung von IRT in zunächst einer und dann einer weiteren Probe, und (b) die Messung von IRT mit anschließender DNA-Mutationsanalyse in derselben Probe [1, 2, 3]. 3. TESTPRINZIP Der IRT neonatal screening ELISA ist ein Sandwich -Typ der Festphasen-Enzymimmunoassays, der auf zwei biotinilierten monoklonalen Antikörpern mit Epitopspezifität zu Trypsin 1 und Trypsin 2 sowie einem dritten polyclonalen Trypsin-spezifischen Antikörper, der auf der inneren Well-Oberfläche immobilisiert ist, basiert. Trypsin-Moleküle aus der Probe bindet sowohl an den immobilisierten als auch an das anti-trypsin-biotin-konjugat. Dann werden die Wells mit Waschpuffer gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Enzymkonjugat wird hinzugefügt. Die Wells werden wieder gewaschen, um Konjugat, das nicht an einen konjugierten Antikörper gebunden ist, zu entfernen. Substrat wird in jedes Well gegeben. Die Intensität der Farbe nach der Substratinkubation ist proportional zur Antigenmenge in der Probe. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. Version / 7

3 9. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf anti-hcv, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. 10. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8 C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Trockenblutproben Blut aus der Ferse des Neugeborenen sollte entweder am medialen oder lateralen Bereich der Fußsohle entnommen werden. Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Der erste Blutstropfen sollte mit einem sterilen Tupfer entfernt werden. Die Probenkarte ist an einen großen freihängenden Blutstropfen zu bringen. Es ist darauf zu achten, dass ohne Unterbrechung eine ausreichende Menge Blut auf die Karte aufgetragen wird, um die markierte Fläche vollständig auszufüllen. Dieses Verfahren ist zu wiederholen um alle benötigten Flächen der Sammelkarte auszufüllen. Die Trockenblutproben sollten für 3 h bei Raumtemperatur luftgetrocknet werden. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. Da die im Kit enthaltenen Standards sich auf Karten von Whatman 903 befinden, und die Messwerte durch verschiedene Kartenmaterialien beeinflusst werden (siehe GRENZEN DES VERFAHRENS), sollten diese Karten auch für die Proben verwendet werden. Den Blutfluss nicht durch Drücken verstärken, da dies zu Hämolyse bzw. zum Verdünnen durch Gewebsflüssigkeit führen kann. Blut nicht auf bereits benutzte Flächen der Karte tropfen. Die Trockenblutproben nicht berühren oder verstreichen. Die Trockenblutproben müssen visuell einwandfrei sein (z.b. keine verstrichenen Trockenblutproben, keine Gerinnsel im Blut, keine Fingerabdrücke auf den Trockenblutproben). Das Screening auf zystische Fibrose erfordert keine Änderung der gängigen Blutprobenentnahme Praxis. Der häufigste Blutentnahmezeitpunkt ist am dritten und fünften Tag nach der Geburt. Nationale und länderspezifische Vorgaben zum Entnahmezeitpunkt müssen berücksichtigt werden. Lagerung: 2-8 C Haltbarkeit: bis zu 4 Monate [1] Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Version / 7

4 7. KOMPONENTEN DES KITS Anzahl / Menge RE53275 Anzahl / Menge RE53279 Symbol 5 x 12 x 8 25 x 12 x 8 MTP 1 x 6 x 8 2 x 6 x 8 CAL A-F 1 x 3 x 8 4 x 3 x 8 CONTROL x 10 ml 5 x 10 ml ASSAYBUF CONC 1 x 1 ml 5 x 1 ml BIOTIN-AB CONC 1 x 0.6 ml 5 x 0.6 ml ENZCONJ CONC 5 x 15 ml 4 x 90 ml TMB SUBS 5 x 15 ml 4 x 90 ml TMB STOP 2 x 100 ml 10 x 100 ml WASHBUF CONC 10 x 50 x FOIL Komponente Mikrotiterplatte Transparent. Beschichtet mit anti-human Trypsin Antikörper (Kaninchen). Standard A-F Enthält: Humanblut + Trypsin auf Whatman 903 Papier. 8 Trockenblutproben / Karte. Genaue Konzentrationen siehe Etiketten oder QC Zertifikat. Kontrolle 1-3 Kontrolle 1: niedrig Kontrolle 2: mittel Kontrolle 3: hoch Enthält: Humanblut + Trypsin auf Whatman 903 Papier. 8 Trockenblutproben / Karte. Konzentrationen / Akzeptanzbereiche siehe Etiketten oder QC Zertifikat. Assaypuffer Konzentrat (20x) Enthält: PBS Puffer, Tween, Protease Inhibitor, Casein, Konservierungsmittel. Biotin anti-irt Ak Konzentrat (100 x) anti-human Trypsin Antikörper (Maus), konjugiert mit Biotin. Enzymkonjugat Konzentrat (100x) Enthält: Streptavidin-Poly-HRP, Konservierungsmittel. TMB Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: TMB (Tetramethylbenzidin). TMB Stopplösung Gebrauchsfertig. Enthält: 1 M H 2SO 4. Waschpuffer Konzentrat (10x) Enthält: PBS, Tween. Haftklebefolie schwarz 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 50; ; 1000 µl 2. Karten für Blutproben (Whatman 903 ) 3. Trockenblutproben-Stanze, 3 mm (e.g. Sauer, Hannover, Germany) 4. Orbitalschüttler ( rpm) 5. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 450 nm (Referenzwellenlänge nm) 6. Leere Fläschchen zur Herstellung von Biotin und Enzymkonjugat 7. Vortex-Mischer 8. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 9. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 10. Bidest. oder deionisiertes Wasser 11. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. Version / 7

5 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. Nicht benötigte Wells sollten sofort in den wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben werden. 4. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 5. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden, um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. 6. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. 7. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 8. Beim Ausstanzen der für die Bestimmung benötigten Proben (Trockenblutproben) müssen die folgenden Dinge beachtet werden: 1. Es dürfen nur Trockenblutproben verwendet werden, die beidseitig ausreichend mit Blut durchtränkt sind. 2. Bei Doppelbestimmungen dürfen nur Stanzlinge verwendet werden, die aus einer Trockenblutprobe ausgestanzt wurden und direkt nebeneinander liegen, um einem potentiellen chromatografischen Effekt und somit ggf. auftretender Inhomogenität entgegenzuwirken. 3. Hinweis: Nicht zu nah am Rand der Trockenblutprobe ausstanzen (1mm vom Rand entfernt)! 9. Vor dem Waschen der Mikrotiterplatte muss sichergestellt werden, dass ausnahmslos alle Stanzlinge aus den Kavitäten entfernt worden sind. 10. Die Trockenblutproben müssen visuell einwandfrei sein (z.b. keine verstrichenen Trockenblutproben, keine Gerinnsel im Blut, keine Fingerabdrücke auf den Trockenblutproben). 11. Nicht benötigte Wells/Röhrchen und getrocknete Trockenblutproben sofort in den wiederverschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. TESTVORBEREITUNGEN Vorbereitung konzentrierter Komponenten (1 Mikrotiterplatte) Verd. / rekonst. Komponente mit Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit 100 ml WASHBUF CONC 900 ml bidest. Wasser 1:10 Gründlich mischen. 2-8 C 4 Wochen 2 ml ASSAYBUF CONC 38 ml bidest. Wasser 1:20 Kristalle bei C lösen. > 10 min ohne Schaumbildung mischen. verdünnter 160 µl BIOTIN-AB CONC 16 ml 1: C bis zu 1h Assaypuffer Es sollten keine Polypropylen Flaschen für die Herstellung des Enzymkonjugates verwendet werden. Wenn mehrere Fläschchen konzentrierten Enzymkonjugats im Gebrauch sind, wird sehr empfohlen, die Lösungen zu mischen und daraus eine Working Solution herzustellen. 110 µl ENZCONJ CONC 11 ml verdünnter Assaypuffer 1:101 > 10 min ohne Schaumbildung mischen. 2-8 C C 24 h bis zu 3h Version / 7

6 11. TESTDURCHFÜHRUNG 1. Die Trockenblutproben Standards (A-F), Kontrollen 1-3 und Proben ausstanzen (je 3 mm Ø) und jeden Stanzling in die entsprechenden Wells der Mikrotiterplatte legen. Hinweis: Nicht zu nah am Rand der Trockenblutprobe ausstanzen! 2. Je 150 µl verdünntes Biotin anti-irt Ak in jedes Well pipettieren. Jeder Stanzling muss vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sein. Platte mit schwarzer Haftklebefolie abdecken Stunden bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( rpm) inkubieren. 4. Folie entfernen. Inkubationslösung mit allen Stanzlingen verwerfen und restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. Platte 4 x mit je 300 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 5. Je 100 µl verdünntes Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. Platte mit schwarzer Haftklebefolie abdecken Minuten bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( rpm) inkubieren. 7. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen und restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. Platte 4 x mit je 300 µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 8. Substrat- und Stopplösung möglichst mit einer 8-Kanal-Pipette pipettieren und Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden µl TMB Substratlösung in jedes Well pipettieren Minuten bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( rpm) inkubieren. Direkte Sonneneinstrahlung vermeiden. 11. Die Substratreaktion durch Zugabe von 100 µl TMB Stopplösung in jedes Well stoppen. Farbumschlag von blau nach gelb. 12. Optische Dichte mit einem Photometer bei 450 nm (Referenzwellenlänge: nm) innerhalb von 15 min nach Pipettieren der Stopplösung messen. 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. Version / 7

7 13. TESTAUSWERTUNG Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode oder 4-Parameter-Analyse empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden (bei Doppelwerten kann ein offensichtlicher Ausreißerwert eliminiert und stattdessen der plausiblere Einzelwert verwendet werden). Die Konzentrationen der Proben können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Typische Standardkurve (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!)) Standard Trypsin OD Mittelwert OD/OD max (%) (ng/ml) A % B % C % D % E % F % 14. NORMWERTE Basierend auf der Annahme, dass die IRT Werteverteilung unter Screeningbedingungen eine Normalverteilung ergibt, ist es allgemein akzeptiert den Cut-off anhand eines gewählten Perzentils der Verteilung festzulegen (gleitender Cut-off). Dies ist bedingt durch ethnische oder saisonale Variationen in den IRT Werten. Im Hinblick auf das zu wählende Perzentil des initialen Cut-offs gibt es verschiedene Optionen (z.b.97,5%, 99% oder 99,5%). Es ist empfehlenswert die Proben oberhalb des Cut-offs (positiv) durch eine wiederholte Messung in Doppelbestimmung zu bestätigen. Eine weitergehende Bestätigungsdiagnostik (Mutationsanalyse oder PAP) und Schweißtest sind unerlässlich. Nachfolgend ein Beispiel für eine Werteverteilung, die in einer Studie mit 474 Neugeborenen erhalten wurde: Proben verschiedener Populationen können sich auch in den IRT Werten unterscheiden. Es ist daher dringend empfohlen, dass jedes Labor seinen eigenen Normalbereich/ Cut-off etabliert. Weiter sollten die Empfehlungen lokaler Gesellschaften (z.b. DGNS in Deutschland) beachtet werden. Version / 7

8 15. GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG. Jede Probe mit einer erhöhten Konzentration muss als vermutlich positiv betrachtet und durch weitere Probenahmen und Messungen bestätigt werden. Ein falsch negatives Ergebnis mit diesem Assay kann nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Mögliche Ursachen für anormale Testergebnisse sind: - Probe nicht gleichförmig mit Blut getränkt - Stanzlinge zu nah am Rand der Trockenblut-Proben/Standards/Kontrollen ausgestanzt - Nicht konforme Probennahme und ungenügend getrocknete Proben - Ungenügende Eluation durch den Einfluss von Hitze und Feuchtigkeit - Kontamination des Trockenblut Filterpapiers mit Fäkalien Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Die folgenden Blutbestandteile haben bis zu den angegebenen Konzentrationen keinen signifikanten Einfluss auf die Testergebnisse: Bilirubin Triglyceride 5 mg/ml 91 mg/ml 16. TESTCHARAKTERISTIKA Analytische Spezifität (Kreuzreaktivität) Die folgenden Substanzen zeigten eine Kreuzreaktivität niedriger als <0.01 %: Pepsinogen II PGC; alpha2-macroglobulin; alpha-1-antitrypsin; alpha- Chrymotrypsin; Gamma-Globulin, Phospholipase A2. Analytische Sensitivität (Nachweisgrenze des Blank) < 6 ng/ml Mittleres Signal (Nullstandard) + 2SD Präzision Bereich (ng/ml) VK (%) Intra-Assay Inter-Assay Methodenvergleich versus Methoden / Assays IBL-Assay ELISA = 0.70 (IBL IRT LUM)+6.91 r = 0.89; n = 482 IBL-Assay ELISA = 0.86 (IRT Colorimetric ELISA) r = 0.95; n = 130 IBL-Assay ELISA = 0.84 (IRT Fluorometric Assay) + 14 r = 0.75; n = LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Li L et al. Development and characterization of dried blood spot materials for the measurement of immunoreactive trypsinogen. J Med Screen 13:79-84 (2006) 2. Castellani C et al. European best practice guidelines for cystic fibrosis neonatal screening. Journal of Cystic Fibrosis (2009) 3. Crossley JR et al. Dried-blood spot screening for cystic fibrosis in the newborn. Lancet 1: (1979) 4. Stopsack M et al. Neonatal screening for cystic fibrosis. Pros and cons. Monatsschr Kinderheilkd (2009) 5. Salvatore D et al. An overview of international literature from cystic fibrosis registries 2. Neonatal screening and nutrition/growth. Review. Journal of Cystic Fibrosis (2009) 6. Southern W et al. Newborn screening programmes for cystic fibrosis. Paediatric respiratory reviews 4, (2003) 7. Heeley A F et al. Screening for cystic fibrosis by dried blood spot trypsin assay. Archives of Disease in Childhood, 57, (1982) 8. Rodrigues R et al. Cystic fibrosis and neonatal screening. Review. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24 Sup 4, (2008) Version / 7

9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /