Noradrenalin ELISA RE C. Arbeitsanleitung

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1 Arbeitsanleitung Noradrenalin ELISA Manueller und automatischer Enzymimmunoassay für die quantitative In-vitro-Bestimmung von Noradrenalin (Norepinephrin) in humanem Plasma und Urin. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. ZWECKBESTIMMUNG Automatischer und manueller Enzymimmunoassay für die quantitative In-vitro-Bestimmung von Noradrenalin (Norepinephrin) in humanem Plasma und Urin. 2. KLINISCHE BEDEUTUNG Die Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin werden als Neurotransmitter an den Synapsen freigesetzt und dienen unter anderem der Adaption des Körpers an akuten und chronischen Streß. Hierbei stehen beim Adrenalin die Wirkung auf Herzmuskulatur und Stoffwechsel, beim Noradrenalin die Wirkung auf den peripheren Kreislauf im Vordergrund. Im Zentralen Nervensystem ist Dopamin hauptsächlich in den dopaminergen Neuronen gespeichert und hat Einfluß auf motorische Funktionen und Wahrnehmung. Erhöhte oder zu niedrige Katecholaminwerte werden bei einer Reihe von Krankheiten beschrieben, wie z.b. dem Phäochromozytom (einer malignen Entartung der chromaffinen Zellen, hauptsächlich des Nebennierenmarks), bei Hypertonie, degenerativen Erkrankungen des Herzens, Schizophrenie und manischer Depression. Die Bestimmung der Katecholamine kann sowohl im Urin als auch im Plasma erfolgen. Bei der diagnostischen Beurteilung ihrer Ausscheidungsmuster und der ihrer Metabolite ist zu berücksichtigen, daß die gemessenen Konzentrationen sowohl den zentralen wie den peripheren Stoffwechsel widerspiegeln. Aufgrund des Extraktionsschrittes kann der Assay auf verschiedene Tierarten angewendet werden, wie z.b. Ratten, Mäusen und anderen. Die chemische Struktur der Katecholamine ist in allen Tierarten identisch. 3. TESTPRINZIP Sandwich-Enzymimmunoassay (ELISA). Die Wells der Mikrotiterstreifen sind mit Ziege-anti-Kaninchen Antikörpern beschichtet. Der zugegebene flüssige Antikörper, der gegen ein Epitop des Antigenmoleküls gerichtet ist, bindet während der Inkubationszeit an die Platte. Die Proben werden in den Wells zusammen mit einem enzymmarkierten Antikörper (E-Ab) inkubiert, der gegen ein anderes Epitop des Antigens gerichtet ist. Die Intensität der gebildeten Farbe nach der Substratreaktion ist proportional zur Antigen- Konzentration. Die Ergebnisse der Proben können direkt anhand der Standardkurve bestimmt werden. 4. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Nur zum In-vitro-Gebrauch. Nur für den Gebrauch durch Fachpersonal. 2. Vor der Testdurchführung sollte die Arbeitsanleitung vollständig und sorgfältig gelesen werden und verstanden worden sein. Die gültige Version aus dem Kit verwenden. 3. Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist IBL bzw. der jeweilige Lieferant innerhalb einer Woche nach Empfang der Ware schriftlich zu benachrichtigen. Beschädigte Komponenten dürfen nicht zur Testdurchführung verwendet werden, sondern sollten solange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden endgültig geregelt ist. 4. Chargen-Nummer und Verfallsdatum beachten. Es dürfen keine Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen in einem Test verwendet werden. Verfallene Reagenzien dürfen nicht verwendet werden. 5. Gute Laborpraxis und Sicherheitsrichtlinien beachten. Je nach Bedarf sollten Laborkittel, Einmal- Latexhandschuhe und Schutzbrillen getragen werden. 6. Reagenzien dieses Kits, die Gefahrstoffe enthalten, können Reizungen der Augen und der Haut hervorrufen. Siehe Angaben in KOMPONENTEN DES KITS und auf den Etiketten. Sicherheitsdatenblätter für dieses Produkt sind auf der IBL-Homepage zum Download verfügbar oder auf Anfrage direkt von IBL erhältlich. 7. Chemikalien und vorbereitete oder gebrauchte Reagenzien sind unter Beachtung der jeweiligen nationalen Bestimmungen als Gefahrstoffabfall zu entsorgen. 8. Das Reinigungspersonal ist durch das Fachpersonal bezüglich möglicher Gefahren und Umgang anzuleiten. 9. Kontakt mit Stopplösung vermeiden. Kann Hautreizungen und Verätzungen hervorrufen. 10. Alle Reagenzien dieses Kits, die humanes Serum oder Plasma enthalten, ergaben bei der Prüfung auf anti-hcv, HBsAg bzw. Antikörper gegen HIV I/II-Virus ein negatives Ergebnis. Trotzdem kann das Vorhandensein solcher infektiöser Erreger nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden. Die Reagenzien sollten deshalb wie potentiell infektiöses Material behandelt werden. Version / 9

3 5. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Der Kit wird bei Umgebungstemperatur angeliefert und sollte bei 2-8 C gelagert werden. Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Hinweise zur Lagerung und Haltbarkeit der Proben und vorbereiteten Reagenzien sind den entsprechenden Kapiteln zu entnehmen. Die Mikrotiterplatte ist auch nach dem Öffnen der Verpackung bis zum Verfallsdatum des Kits haltbar, wenn der Beutel sorgfältig wieder verschlossen und bei 2-8 C gelagert wird. 6. PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG Die in-vivo-freisetzung der Katecholamine wird durch verschiedene Lebensmittel und Arzneimittel beeinflusst. Der Patient sollte den Verzehr bzw. die Zufuhr von Vitamin B, Kaffee und Bananen alpha-methyldopa, MAO- und COMT-Inhibitoren sowie Medikationen in Verbindung mit Bluthochdruck mind. 72 h vor der Probensammlung absetzen. Plasma (EDTA) Die Blutproben sollten bei 2-8 C gelagert und innerhalb von 2 h nach der Blutentnahme zentrifugiert werden, um das Plasma abzutrennen. Die üblichen Vorsichtsmaßnahmen bei der Blutabnahme sind einzuhalten. Die chemische Integrität der Blutproben muss vom Zeitpunkt der Blutabnahme bis zur Testdurchführung erhalten bleiben. Keine hämolytischen, ikterischen oder lipämischen Proben verwenden. Getrübte Proben sollten vor der Testdurchführung zentrifugiert werden, um Partikel zu entfernen. Lagerung: 2-8 C -20 C (aliquotiert) Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. Haltbarkeit: 6 Stunden 1 Monat Zum Versand müssen die Proben eingefroren werden. Urin Spontanurin oder 24 h-sammelurin können verwendet werden. Das Gesamtvolumen über 24 h sollte in einer Flasche unter Vorlage von ml 6 N HCl als Konservierungsmittel gesammelt und gemischt werden. Gesamtvolumen bestimmen zur späteren Auswertung des Tests. Proben vor Gebrauch mischen und zentrifugieren. Lagerung: -20 C (aliquotiert) Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. Haltbarkeit: 6 Monate Wiederholtes Auftauen und Einfrieren vermeiden. 7. KOMPONENTEN DES KITS Die Reagenzien dieses Kits reichen aus für bis zu 48 Einzelbestimmungen in der Extraktion (6 Standards, 2 Kontrollen, 40 Patienten) und bis zu 48 Doppelbestimmungen im ELISA für jeweils Adrenalin und Noradrenalin in Plasma und Urin. Zusätzliche Komponenten sind bei Bedarf erhältlich. Anzahl / Menge Symbol 1 x 12x8 MTP 1 x 6 x 2.5 ml CAL A-F 1 x 2 x 2.5 ml CONTROL x 400 µl ENZCONJ CONC 2 x EXTRPLATE 1 x 60 ml EXTRBUF 2 x 1.25 ml COMT LYO Komponente Mikrotiterplatte Wells einzeln abbrechbar. Beschichtet mit anti-kaninchen IgG (Ziege, polyklonal). Standard A-F Adrenalin: 0; 1.5; 5.0; 15; 50; 150 ng/ml (0; 8; 27; 82; 273; 819 nmol/l) Noradrenalin: 0; 5.0; 15; 50; 150; 500 ng/ml (0; 30; 89; 296; 887; 2955 nmol/l) Dopamin: 0; 60; 180; 585; 2300; ng/ml (0; 392; 1175; 3819; 15014; nmol/l) Gebrauchsfertig. Enthält: [-] Adrenalin, [-] Noradrenalin, [-] Dopamin (biologisch aktiv) und 0.1 M HCl. Kontrolle 1+2 Gebrauchsfertig. Enthält: [-] Adrenalin, [-] Noradrenalin, [-] Dopamin (biologisch aktiv), 0.1 M HCl. Genaue Konzentrationen siehe Fläschchenetiketten oder QC Zertifikat. Enzymkonjugat Konzentrat (50x) Enthält: Streptavidin alkalische Phosphatase, Trispuffer, HCl, 0.01 % NaN 3. Extraktionsplatte (Makrotiterplatte) Je 24 Wells. Beschichtet mit Boronat-Affinitätsgel. Extraktionspuffer Rosa gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: % NaN 3. COMT lyophilisiert Enthält: Catechol-o-Methyltransferase (Schweineleber), NaN 3. Version / 9

4 Anzahl / Menge Symbol 2 x 1.25 ml COENZ 1 x 3 ml ENZBUF 2 x 13 ml RELEASEBUF 1 x 3 ml ACYLREAG 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 2 ml COMT ADD 1 x 8.0 ml ANTISERUM NAD 1 x 25 ml PNPP SUBS Komponente Coenzymlösung Gebrauchsfertig. Enthält: S-Adenosyl-L-Methionin, Stabilisatoren. Enzympuffer Gebrauchsfertig. Enthält: Trispuffer, HCl, Stabilisatoren. Freisetzungspuffer Gelb gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: 0.1 M HCl, Indikator. Acylierungsreagenz Gebrauchsfertig. Enthält: Dimethylformamid, Ethanol. Vorsicht! Giftig. Leichtentzündlich. Waschpuffer Konzentrat (10x) Enthält: Trispuffer, HCl, Tween, 0.2 % NaN 3. COMT Additiv Enthält: humanes Plasma, Stabilisatoren, 0.01 % Thimerosal. Noradrenalin Antiserum Blau gefärbt. Gebrauchsfertig. Enthält: Antikörper gegen Noradrenalin (Kaninchen), Puffer, Stabilisatoren. PNPP Substratlösung Gebrauchsfertig. Enthält: p-nitrophenyl-phosphat (PNPP). 1 x 15 ml PNPP STOP PNPP Stopplösung Gebrauchsfertig. Enthält: 1 M NaOH, 0.25 M EDTA. 3 x FOIL Haftklebefolie 8. ZUSÄTZLICHES MATERIAL (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 1. Pipetten (Multipette Eppendorf oder vergleichbare Produkte, < 3 % VK). Volumina: 10; ; µl 2. Orbitalschüttler ( U/min) (z.b. EAS 2/4, SLT) 3. Vortex-Mischer 4. 8-Kanal Mikropipette mit Reagenziengefäßen 5. Waschflasche, automatisches oder halbautomatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten 6. Messgerät für Mikrotiterplatten zur Messung der Absorption bei 405 nm (Referenzwellenlänge nm) 7. Bidest. oder deionisiertes Wasser 8. Papiertücher, Pipettenspitzen, Stoppuhr 9. Röhrchen für die Probenverdünnung M HCl, zur Probenverdünnung (Urin) 9. HINWEISE ZUR TESTDURCHFÜHRUNG 1. Fehler bei der Handhabung der Proben oder Abweichungen von der beschriebenen Testdurchführung können die Ergebnisse verfälschen. Die angegebenen Pipettiervolumina, Inkubationszeiten, Temperaturen und Vorbereitungsschritte sind unbedingt gemäß Arbeitsanleitung einzuhalten. Nur kalibrierte Pipetten und Geräte verwenden. 2. Sobald mit der Testdurchführung begonnen wird, sollten alle Arbeitsschritte ohne Unterbrechung durchgeführt werden. Es ist sicherzustellen, dass alle benötigten Reagenzien, Geräte und Hilfsmittel zur rechten Zeit zur Verfügung stehen. Alle Reagenzien und Proben müssen auf Raumtemperatur (18-25 C) gebracht und vor Gebrauch vorsichtig ohne Schaumbildung gemischt werden. 3. Kontaminationen der Reagenzien, Pipetten und Wells/Röhrchen sind zu vermeiden. Neue Einmal- Pipettenspitzen für jede zu pipettierende Komponente und jede Probe verwenden. Die Deckel der Fläschchen nicht vertauschen. Nicht benötigte Fläschchen immer verschlossen halten. Wells/Röhrchen oder Reagenzien dürfen nicht wiederverwendet werden. 4. Enthalten Komponenten 250 µl Flüssigkeit, sollte sich vor dem Öffnen der gesamte Inhalt auf dem Boden des entsprechenden Fläschchens befinden. 5. Es wird empfohlen, Doppelbestimmungen durchzuführen, um eventuelle Pipettierfehler zu erkennen. 6. Es sollte ein Pipettierschema verwendet werden um die Identifikation der Standards und Proben auf der Platte sicherzustellen. Ein Pipettierschema für die Probenvorbehandlung und den Assay ist auf der IBL- Homepage verfügbar. 7. Die Inkubationszeiten beeinflussen die Ergebnisse. Bei jedem Pipettierschritt sollten alle Wells in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Zeittakt behandelt werden. Die Verwendung einer 8-Kanal- Mikropipette zum Pipettieren in alle Wells wird empfohlen. Version / 9

5 8. Die korrekte Durchführung der Waschschritte ist entscheidend. Ungenügend gewaschene Wells ergeben falsche Ergebnisse. Die Verwendung einer Multikanalpipette oder eines automatischen Waschsystems für Mikrotiterplatten wird empfohlen. Zwischen den Inkubationen die Wells nicht austrocknen lassen. Beim Waschen und Ausschütteln dürfen die beschichteten Wells nicht beschädigt werden. Alle Reagenzien müssen daher mit Vorsicht pipettiert werden. Beim Waschvorgang ist es wichtig, dass alle Wells vollständig und gleichmäßig mit Waschpuffer gefüllt werden und nach dem Ausschütteln kein Rückstand an Flüssigkeit zurückbleibt. 9. Feuchtigkeit beeinflusst die beschichteten Wells/Röhrchen. Verpackung nicht öffnen bevor Raumtemperatur erreicht ist. Nicht benötigte Wells/Röhrchen sofort in den wieder verschließbaren Beutel mit Trockenmittel zurückgeben. 10. MANUELLE DURCHFÜHRUNG TESTVORBEREITUNGEN Der Inhalt des Kits für 96 Bestimmungen kann in 2 Läufe aufgeteilt werden. Sichtbare Gelmengen können sich während der Extraktion ohne störenden Einfluss auf das Ergebnis von der Extraktionsplatte ablösen. Luftverunreinigungen hervorgerufen durch Peroxid-haltige Desinfektionsmittel als Puder oder Lösungen, z.b. VIRKON müssen auf jeden Fall vermieden werden, da diese das Assay System empfindlich stören können. VIRKON ist ein Handelsname von DuPont Probenverdünnung Proben mit einer erwarteten Konzentration über dem höchsten Standard müssen wie folgt verdünnt werden: Probe zu verdünnen mit Bemerkungen Plasma > höchstem Standard bidest. Wasser vor dem Extraktionsschritt Urin > höchstem Standard 0.1 N HCl vor dem Extraktionsschritt Extraktion der Proben, Standards und Kontrollen (Extraktionsplatte) (manuelle Version) 1. Je 20 µl der Standards, Kontrollen und Urinproben und je 500 µl der Plasmaproben in die entsprechenden Wells der Extraktionsplatte pipettieren. 500 µl bidest. Wasser in alle Wells außer denen der Plasmaproben pipettieren, um das abweichende Volumen auszugleichen. 2. Je 1000 µl Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 30 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) extrahieren. Während der Extraktion sollte die Oberfläche der Flüssigkeit die Folie benetzen, aber die Flüssigkeit sollte nicht über 2/3 des Wells hinausgehen. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 4. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. 5. Je 2 ml bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 6. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 7. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 8. Je 150 µl Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. Zu jedem Well 50 µl Acylierungsreagenz hinzugeben. Sofort schütteln min bei RT (18-25 C) (ohne Folie) auf einem Schüttler ( U/min) extrahieren. 10. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 11. Je 2 ml bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 12. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 13. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 14. Je 300 µl Freisetzungspuffer in jedes Well pipettieren min bei RT (18-25 C) (ohne Folie) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) schütteln. Vorbereitete Proben sollten am gleichen Tag analysiert werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die Extraktionsplatte abgedeckt mit Folie bei 2-8 C über Nacht gelagert werden. Version / 9

6 Vorbereitung konzentrierter Komponenten Verd. / rekonst. Die unten angegebenen Volumina sind für einen Lauf mit 6 Streifen (48 Bestimmungen). Komponente mit Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit 25 ml WASHBUF CONC 225 ml 120 µl ENZCONJ CONC 6 ml bidest. Wasser WASHBUF (verdünnt) TESTDURCHFÜHRUNG (manuelle Version) Herstellung der COMT Enzymlösung 1:10 Gründlich mischen. 2-8 C 4 Wochen 1:51 Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Ohne Schaumbildung mischen C 5 Stunden Die COMT Enzymlösung muss frisch (max. 15 min) vor Gebrauch hergestellt werden. Die Kitkomponente COMT in jeweils 1.25 ml bidest. Wasser lösen und gut mischen*. Anschließend 1.25 ml Coenzymlösung, dann 1.25 ml Enzympuffer und 0.40 ml COMT Additiv in jedes Fläschchen zugeben, so dass ein Endvolumen von 4.15 ml COMT Enzymlösung pro Fläschchen resultiert. Es wird 1 Fläschchen für 48 Bestimmungen Noradrenalin benötigt. Sollen Adrenalin und Noradrenalin bestimmt werden, so sind zwei (2) Fläschchen für 48 Bestimmungen von Adrenalin und 48 Bestimmungen von Noradrenalin zu poolen. Die Lösung kann trüb sein. Ohne Schaumbildung mischen. * Wenn nur ein Teil der COMT Lösung benötigt wird, kann der Rest bei -20 C aliquotiert eingefroren werden. Die COMT Lösung ist unter diesen Bedingungen 1-2 Monate stabil Enzymatische Derivatisierung der Proben, Standards und Kontrollen (Mikrotiterplatte) Es wird empfohlen, mit Adrenalin zu beginnen, wenn sowohl Adrenalin als auch Noradrenalin bestimmt werden sollen. Wenn mit Überhub pipettiert wird, muss die Restflüssigkeit aus der Pipettenspitze in die entsprechenden Wells der Extraktionsplatte zurückgegeben werden, da sonst die Extrakte möglicherweise nicht mehr für die Bestimmung von Noradrenalin ausreichen. Es ist außerdem hilfreich, die Extraktionsplatte schräg zu halten. Vor der Verwendung der Mikrotiterplatten müssen die entsprechenden Wells für Adrenalin und Noradrenalin ausgewählt und beschriftet werden Zur Bestimmung von Gewebehomogenaten und Zellkulturüberständen können generell folgende Empfehlungen gegeben werden: Das Arbeiten mit Zellkulturüberständen ist abhängig von den zu erwartenden Konzentrationen und dem Medium: Wenn nach dem Urin-Protokoll (Extraktion von mindestens 20 µl Überstand) gearbeitet wird, kann eine Sensitivität von 0.6 ng/ml erwartet werden. Enthält die Matrix zusätzlich Serum (FCS), kann nach dem Plasma Protokoll (500 µl Überstand) mit der entsprechenden Sensitivität für Plasma (siehe 16. TESTCHARAKTERISTIKA) gearbeitet werden. Für Gewebehomogenate sollte keine Perchlorsäure für die Homogenisierung verwendet werden. Eine detaillierte Anleitung ist bei IBL erhältlich Noradrenalin für Urin und Plasma 1. Je 25 µl frisch hergestellte COMT Enzymlösung in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. Platte kurz schütteln. 2. Je 25 µl der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells pipettieren. Es empfiehlt sich, die Pipettenspitze dabei direkt in die COMT-Lösung zu halten. Es erfolgt ein Farbumschlag nach rosa. Platte kurz schütteln µl Noradrenalin Antiserum (blau gefärbt) in jedes Well pipettieren. 4. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 120 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) inkubieren. 5. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 4 x mit je µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 6. Je 100 µl frisch hergestelltes Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. Version / 9

7 7. Platte mit neuer Folie abdecken. 60 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler inkubieren ( U/min). 8. Folie entfernen. Inkubationslösung verwerfen. Platte 4 x mit je µl verdünntem Waschpuffer waschen. Restliche Flüssigkeit auf Papiertüchern ausklopfen. 9. Substrat- und Stopplösung möglichst mit einer 8-Kanal-Pipette pipettieren und Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. Mit positivem Vorhub pipettieren, um die Bildung von Luftbläschen zu vermeiden. 10. Je 200 µl PNPP Substratlösung in jedes Well pipettieren min bei RT (18-25 C) (ohne Folie) auf einem Orbitalschüttler inkubieren. ( U/min) 12. Die Substratreaktion durch Zugabe von 50 µl PNPP Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 13. Die optische Dichte mit einem Photometer bei 405 nm (Referenzwellenlänge: nm) innerhalb 60 min nach dem Pipettieren der Stopplösung messen. Es sollten keine Luftbläschen sichtbar sein. 11. AUTOMATISIERTE DURCHFÜHRUNG TESTVORBEREITUNGEN (automatisierte Version) Der Inhalt des Kits für 96 Bestimmungen kann in 2 Läufe aufgeteilt werden. Sichtbare Gelmengen können sich während der Extraktion ohne störenden Einfluss auf das Ergebnis von der Extraktionsplatte ablösen. Luftverunreinigungen hervorgerufen durch Peroxid-haltige Desinfektionsmittel als Puder oder Lösungen, z.b. VIRKON müssen auf jeden Fall vermieden werden, da diese das Assay System empfindlich stören können. VIRKON ist ein Handelsname von DuPont Probenverdünnung Proben mit einer erwarteten Konzentration über dem höchsten Standard müssen wie folgt verdünnt werden: Probe zu verdünnen mit Bemerkungen Plasma > höchstem Standard bidest. Wasser vor dem Extraktionsschritt Urin > höchstem Standard 0.1 N HCl vor dem Extraktionsschritt Extraktion der Proben, Standards und Kontrollen (Extraktionsplatte) (automatisierte Version) 1. Je 30 µl der Standards, Kontrollen und Urinproben und je 750 µl der Plasmaproben in die entsprechenden Wells der Extraktionsplatte pipettieren. 750 µl bidest. Wasser in alle Wells außer denen der Plasmaproben pipettieren, um das abweichende Volumen auszugleichen. 2. Je 1000 µl Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. 3. Platte mit Haftklebefolie abdecken. 30 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) extrahieren. Während der Extraktion sollte die Oberfläche der Flüssigkeit die Folie benetzen, aber die Flüssigkeit sollte nicht über 2/3 des Wells hinausgehen. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 4. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. 5. Je 2 ml bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 6. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 7. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 8. Je 150 µl Extraktionspuffer in jedes Well pipettieren. Zu jedem Well 50 µl Acylierungsreagenz hinzugeben. Sofort schütteln min bei RT (18-25 C) (ohne Folie) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) extrahieren. 10. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. 11. Je 2 ml bidest. Wasser in jedes Well pipettieren. 12. Platte mit neuer Folie abdecken. 5 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) schütteln. Die Ergebnisse werden nicht beeinflusst, wenn Tropfen die Haftklebefolie benetzen. 13. Folie entfernen. Platte sofort ausleeren und Flüssigkeitsreste durch kräftiges Klopfen auf einer Zellstoffunterlage entfernen. Flüssigkeit vollständig entfernen. Version / 9

8 14. Je 450 µl Freisetzungspuffer in jedes Well pipettieren min bei RT (18-25 C) (ohne Folie) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) schütteln. Vorbereitete Proben sollten am gleichen Tag analysiert werden. Wenn dies nicht möglich ist, kann die Extraktionsplatte abgedeckt mit Folie bei 2-8 C über Nacht gelagert werden Vorbereitung konzentrierter Komponenten (automatisierte Version) Verd. / rekonst. Die unten angegebenen Volumina sind für einen Lauf mit 6 Streifen (48 Bestimmungen). Komponente mit Diluent Verhältnis Bemerkungen Lagerung Haltbarkeit 50 ml WASHBUF CONC 450 ml bidest. Wasser 1:10 Gründlich mischen. 2-8 C 4 Wochen 190 µl ENZCONJ CONC 9.5 ml WASHBUF (verdünnt) TESTDURCHFÜHRUNG (automatisierte Version) Herstellung der COMT Enzymlösung 1:51 Frisch herstellen und nur einmal verwenden. Ohne Schaumbildung mischen C 5 Stunden Die COMT Enzymlösung muss frisch (max. 15 min) vor Gebrauch hergestellt werden. Die Kitkomponente COMT in jeweils 1.25 ml bidest. Wasser lösen und gut mischen*. Anschließend 1.25 ml Coenzymlösung, dann 1.25 ml Enzympuffer und 0.40 ml COMT Additiv in jedes Fläschchen zugeben, so dass ein Endvolumen von 4.15 ml COMT Enzymlösung pro Fläschchen resultiert. Es wird 1 Fläschchen für 48 Bestimmungen Noradrenalin benötigt. Sollen Adrenalin und Noradrenalin bestimmt werden, so sind zwei (2) Fläschchen für 48 Bestimmungen von Adrenalin und 48 Bestimmungen von Noradrenalin zu poolen. Die Lösung kann trüb sein. Ohne Schaumbildung mischen. * Wenn nur ein Teil der COMT Lösung benötigt wird, kann der Rest bei -20 C aliquotiert eingefroren werden. Die COMT Lösung ist unter diesen Bedingungen 1-2 Monate stabil Zur Bestimmung von Gewebehomogenaten und Zellkulturüberständen können generell folgende Empfehlungen gegeben werden: Das Arbeiten mit Zellkulturüberständen ist abhängig von den zu erwartenden Konzentrationen und dem Medium: Wenn nach dem Urin-Protokoll (Extraktion von mindestens 20 µl Überstand) gearbeitet wird, kann eine Sensitivität von 0.6 ng/ml erwartet werden. Enthält die Matrix zusätzlich Serum (FCS), kann nach dem Plasma Protokoll (500 µl Überstand) mit der entsprechenden Sensitivität für Plasma (siehe 16. TESTCHARAKTERISTIKA) gearbeitet werden. Für Gewebehomogenate sollte keine Perchlorsäure für die Homogenisierung verwendet werden. Eine detaillierte Anleitung ist bei IBL erhältlich Noradrenalin für Urin und Plasma 1. Je 25 µl frisch hergestellte COMT Enzymlösung in jedes Well der Mikrotiterplatte pipettieren. Platte 1 min. schütteln. 2. Je 25 µl der extrahierten Standards, Kontrollen und Proben in die entsprechenden Wells pipettieren. Platte 1 min. schütteln µl Noradrenalin Antiserum (blau gefärbt) in jedes Well pipettieren. 4. Platte abdecken. 120 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) inkubieren. 5. Inkubationslösung verwerfen. Platte 6 x mit je µl verdünntem Waschpuffer waschen. 6. Je 100 µl Enzymkonjugat in jedes Well pipettieren. 7. Platte abdecken. 60 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) inkubieren. 8. Inkubationslösung verwerfen. Platte 6 x mit je µl verdünntem Waschpuffer waschen. 9. Substrat- und Stopplösung in denselben Zeitintervallen zugeben. 10. Je 200 µl PNPP Substratlösung in jedes Well pipettieren. Version / 9

9 min bei RT (18-25 C) auf einem Orbitalschüttler ( U/min) inkubieren. Wenn die Temperatur im Automat 25 C überschreitet, sollte die Inkubationszeit auf 30 min verringert werden, um einen Signalüberlauf zu vermeiden. 12. Die Substratreaktion durch Zugabe von 50 µl PNPP Stopplösung in jedes Well stoppen. Platte kurz schütteln. 13. Die optische Dichte mit einem Photometer bei 405 nm (Referenzwellenlänge: nm) innerhalb 60 min nach dem Pipettieren der Stopplösung messen. 12. QUALITÄTSKONTROLLE Die Testergebnisse sind nur gültig, wenn der Test gemäß der vorliegenden Arbeitsanleitung abgearbeitet wurde. Ferner muss der Anwender die GLP-Regeln (Good Laboratory Practice) oder vergleichbare Normen/Gesetze beachten. Anwender und/oder Labor müssen zur Diagnosestellung ein gemäß GLP validiertes System verwenden. Alle Kit-Kontrollen müssen innerhalb der Akzeptanzbereiche, die auf den Etiketten und dem QC-Zertifikat angegeben sind, gefunden werden. Wenn die Kriterien nicht erfüllt sind, sind die Ergebnisse ungültig und der Test sollte wiederholt werden. Jedes Labor sollte darüber hinaus eigene bekannte Proben als weitere Kontrollen mitführen. Es wird empfohlen, an den einschlägigen Ringversuchen teilzunehmen. Bei Abweichungen sind die folgenden Fehlermöglichkeiten zu überprüfen: Haltbarkeit der (vorbereiteten) Reagenzien, Lagerungsbedingungen, Pipetten, Geräte und Hilfsmittel, Inkubationsbedingungen und Waschmethoden. 13. TESTAUSWERTUNG Die erhaltenen OD der Standards (y-achse, linear) gegen deren Konzentration (x-achse, logarithmisch) auftragen, entweder auf semi-logarithmischem Papier oder durch ein entsprechendes Computerprogramm. Bei Verwendung eines Computerprogramms werden die Cubic-Spline-Methode, 4-Parameter-Analyse (lin-log) oder Logit-Log-Berechnung empfohlen. Zur Berechnung der Standardkurve sollten alle Werte der Standards verwendet werden. Die Konzentrationen der Kit-Kontrollen und der Urinproben können direkt von der Standardkurve abgelesen werden. Wegen des höheren Pipettiervolumens von 500 µl (automatisierte Version: 750 µl) für die Plasmaproben im Vergleich zu den 20 µl (automatisierte Version: 30 µl) für die Standards müssen die erhaltenen Werte durch 25 geteilt werden. Um pg/ml zu erhalten, muss mit 1000 multipliziert werden. Die Werte von verdünnten Proben müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert werden. Proben, die oberhalb des höchsten Standards gemessen werden, müssen wie in TESTVORBEREITUNGEN beschrieben verdünnt und erneut analysiert werden. Für jede Urinprobe die 24 h-exkretion berechnen: µg/24 h = µg/l x L/24 h Umrechnung: 1000 pg/ml = 1 ng/ml Noradrenalin (µg/l) x = nmol/l Typische Standardkurve (Noradrenalin) (Beispiel. Nicht zur Testauswertung verwenden!) Standard Noradrenalin (ng/ml) OD Mittelwert OD/OD max (%) A B C D E F (OD) Noradrenalin ELISA (ng/l) Version / 9

10 14. NORMWERTE Therapeutische Konsequenzen sollten nicht allein aufgrund der mit diesem Test ermittelten Werte getroffen werden, sondern nur unter Berücksichtigung aller klinischen Beobachtungen und weiterer diagnostischer Mittel. Augenscheinlich gesunde Spender zeigten die folgenden Normwerte: (5 % - 95 % Perzentile) Jedes Labor sollte unter Berücksichtigung regionaler Gegebenheiten eigene Normalwertbereiche erstellen. Urin Plasma µg/d nmol/d pg/ml nmol/l Noradrenalin < 90 < 535 < 600 < GRENZEN DES VERFAHRENS Die korrekte Durchführung der Probengewinnung ist entscheidend für die Testergebnisse. Näheres siehe PROBENGEWINNUNG UND -AUFBEWAHRUNG. Angaben zu Kreuzreaktivitäten sind im Kapitel TESTCHARAKTERISTIKA zu finden. Die folgenden Blutbestandteile haben bis zu der angegebenen Konzentration keinen signifikanten Einfluss auf die Testergebnisse (+/-20 %): Hämoglobin 2.0 mg/ml Bilirubin 1.0 mg/ml Triglyceride 91 mg/ml 16. TESTCHARAKTERISTIKA Substanz Noradrenalin Adrenalin < 0.02 Analytische Spezifität Kreuzreaktivität aller anderen Noradrenalin 100 (Kreuzreaktivität) getesteten Substanzen < 0.02 % Metanephrin < Normetanephrin < Analytische Sensitivität Urin 0.6 ng/ml (Nachweisgrenze) Plasma 20 pg/ml Mittleres Signal (Nullstandard) + 2SD Präzision Bereich (ng/ml) VK (%) Intra-Assay Urin Plasma Inter-Assay Urin Plasma Bereich (ng/ml) Höchste Verdünnungsstufe Bereich (%) Linearität Urin : Plasma : Kein High Dose Hook Effekt erkennbar. Wiederfindung Mittelwert (%) Bereich (%) % Wiederfindung nach Spiken Methodenvergleich versus HPLC Urin Plasma IBL = 0.75 x HPLC r = 0.945; n = LITERATUR ÜBER DAS PRODUKT 1. Creces J., Appleton Ch.: Catecholamines and their Metabolites: Evaluation of a commercial ELISA. Clin. Biochem., QML Pathology, Brisbane QLD (2004) 2. Westermann J, Hubl W, Kaiser N, Salewski L, Simple, rapid and sensitive determination of epinephrine and norepinephrine in urine and plasma by non-competitive enzyme immunoassay, compared with HPLC method. Clin. Lab., 48: (2002) Version / 9

11 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /