Untersuchungen zum anaeroben Abbauprozess ausgewählter Abfallsubstrate mit Hilfe spezieller Mikroorganismen und Enzyme. Nelson Caballero-Arzápalo

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1 Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt Untersuchungen zum anaeroben Abbauprozess ausgewählter Abfallsubstrate mit Hilfe spezieller Mikroorganismen und Enzyme Nelson Caballero-Arzápalo Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktor-Ingenieurs genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Prüfer der Dissertation: Univ.-Prof. Dr. H. Briesen 1. Univ.-Prof. Dr. R. Meyer-Pittroff (i. R.) 2. Univ.-Prof. Dr. M. Faulstich (Technische Hochschule Clausthal) Die Dissertation wurde am bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am angenommen.

2 Dem Herrn Jesus und meinen Eltern Alejandro Caballero González und Nelly Arzápalo Coronado gewidmet

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einführung und Problemstellung Stand von Wissenschaft und Technik Grundlagen des anaeroben Abbauprozesses Einfluss von Prozessparametern Einfluss der Temperatur Einfluss der Substratzusammensetzung Einfluss der Verweilzeit und der Raumbelastung Einfluss des ph-werts Einfluss der Durchmischung Einfluss hemmender und toxischer Substanzen Beteiligte obligat und fakultativ anaerobe Mikroorganismen Anaerob-biologische Abbaubarkeit der organischen Substanz zur Bestimmung des Biogaspotentials Einfluss von Enzymen Grundlagen von enzymatischen Reaktionen Einfluss auf Kohlenhydrate Einfluss auf Proteine Einfluss auf Fette Die Protease Papain Inhibitoren für Enzyme Bacillus Spezies Mikroorganismen im Pansensaft Ballaststoffgehalte in Fruchten Stand der Forschung im Bereich der Fermentation der verwendeten Substrate Anlass der Forschung Aufgabenstellung und Zielsetzung Allgemeine Zielsetzung Spezifische Zielsetzung Hypothesen Reaktoren im Kleinmaßstab... 96

4 5.2 Reaktoren im Großmaßstab Anwendungsbereich der Ergebnisse Verwendete Materialien und Methoden Allgemeines Verwendete Materialien Eingesetzte Substrate Charakterisierung und Nährstoffzusammensetzung der Substrate Verwendete Bioadditive Verwendete Reaktoren Reaktoren im Kleinmaßstab (Durchstechflaschen) Reaktoren im Großmaßstab Verwendete Methoden Verwendete Methoden bei den Reaktoren im Kleinmaßstab Versuchsanordnung Erstellung der Mischproben in den Durchstechflaschen Verwendete Methoden bei den Reaktoren im Großmaßstab Versuchsanordnung Beschickungsweise und -grade Probenahme Feldparameter Verwendete analytische Methoden Verwendete statistische Methoden Parametrische Methoden Nichtparametrische Methoden Allgemeines zu den Versuchen im Kleinmaßstab Allgemeines zu den Versuchen im Großmaßstab Ergebnisse und Diskussion Ergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab Ergebnisse der Versuche mit Papayaabfällen als Substrat Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter Abbauraten der ots sowie Biogasmengen und -ausbeuten

5 Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Papayaabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss Ergebnisse der mikrobiologischen Analysen Ergebnisse der Versuche mit Bananenabfällen als Substrat Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter Abbauraten der ots sowie Biogasmengen und -ausbeuten Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Bananenabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss Ergebnisse der mikrobiologischen Analysen Ergebnisse der Versuche im Großmaßstab Ergebnisse der Versuche mit Papayaabfällen als Substrat Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter Biogasmengen und ausbeuten Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Papayaabfällen mit Rumensaft Ergebnisse der Versuche mit Bananenabfällen als Substrat Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter Biogasmengen und ausbeuten Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Bananenabfällen mit Rumensaft Schlussfolgerungen und Empfehlungen Schlussfolgerungen und Empfehlungen in Bezug auf die Prozess-, Bewertungs- und Hygieneparameter Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Versuchen im Kleinmaßstab Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Prozess- und Bewertungsparameter Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Hygieneparameter Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Hypothesen

6 Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Papayaabfällen Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Bananenabfällen Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Versuchen im Großmaßstab Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Prozess- und Bewertungsparameter Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die statistischen Hypothesen Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Papayaabfällen und Rumensaft Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Bananenabfällen und Rumensaft Wirtschaftliche Aspekte in Bezug auf eine großtechnische Umsetzung der Ergebnisse Zusammenfassung Summary Anhänge Anhang A: Stand der Produktion von Zitrusfrüchten, Banane und Papaya in Mexiko Anhang B: Ergebnisse der Versuche im Mittelmaßstab Anhang C: Weitere Ergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab Allgemeine Ergebnisse Weitere Ergebnisse der Versuche mit Papayaabfällen als Substrat Weitere Ergebnisse der Versuche mit Bananenabfällen als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Zitrusmischungsabfällen (Grapefruit, Orangen, Mandarinen, Limonen) als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Geflügelbrutabfällen als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Hühnermist als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Geflügelschlachtabwasser als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage als Substrat

7 12.4 Anhang D: Weitere Ergebnisse der Versuche im Großmaßstab Weitere Ergebnisse der Versuche mit Papayas als Substrat Weitere Ergebnisse der Versuche mit Bananen als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Zitrusmischungsabfällen als Substrat Ergebnisse der Versuche mit Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage als Substrat Literaturverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Veröffentlichungen und Kongressbeiträge Danksagung...285

8 Einführung und Problemstellung 8 1 Einführung und Problemstellung Organische Abfälle aus den anthropogenen Aktivitäten von Landwirtschaft, Viehhaltung, Industrie, Gewerbe und Haushalten stellen Kontaminationsquellen für die Umwelt dar, wenn sie unbehandelt und falsch entsorgt werden. Wegen ihres hohen Gehalts an organischen Stoffen sind sie eine Belastung in kommunalen Deponien. In Entwicklungs- und Schwellenländern werden diese Abfälle oft an den Stadträndern oder in der Nähe von Wasserressourcen unsachgemäß entsorgt. Die o. g. Aktivitäten und die unsachgemäße Entsorgung der organischen Abfälle verursachen sowohl Emissionen und damit Geruchsbelästigungen als auch Sickerwässer, die eine potentielle Gefahr für das natürlichen Gleichgewicht (chemische Elemente, Flora, Fauna etc.) von Boden und Grundwasser darstellen. Die Viehhaltung ist z. B. die größte anthropogene Methanquelle mit Emissionen von über 75 Millionen Tonnen pro Jahr. Sie verursacht direkt oder indirekt etwa 37 % des weltweit von Menschen emittierten Methans (CH4). In Deutschland ist die Landwirtschaft der zweitgrößte Methanemittent nach der Mineralölindustrie (1). Vor allem die Emissionen von Methan und Kohlendioxid (CO2) werden für den Treibhauseffekt und damit für die globale Klimaerwärmung verantwortlich gemacht (2). CO2 trägt zu ca % (3) zum natürlichen und zu etwa 60 % (4) zum anthropogenen Treibhauseffekt bei, während CH4 für ca. 4-9 % bzw. rund 20 % verantwortlich gemacht wird. Für das Klima ist freies, unverbranntes CH4 im Vergleich zu CO2 in der Atmosphäre sogar ca. 23-mal schädlicher für das Klima (5). Auf der anderen Seite stellen organische Abfälle eine Energiequelle dar, da sie die Energie der Sonneneinstrahlung direkt (bei pflanzlichem Material) oder indirekt (bei tierischem Material) umgewandelt und in Form von Kohlenstoffverbindungen gespeichert haben. Außerdem ist der Weltenergiebedarf im Laufe der Jahre gestiegen. Dieser Bedarf wird derzeit vor allem durch fossile Brennstoffe gedeckt. Dabei werden die bereits bekannten Umweltverschmutzungen (in Luft, Wasser und Boden), welche ebenso einen wichtigen Einfluss auf die Klimaveränderung haben, verstärkt. Gemessen am weltweiten Energiebedarf liegt die statistische Reichweite der fossilen Brennstoffe bei 42 Jahren für Erdöl, bei 63 Jahren für Erdgas und bei 169 Jahren für

9 Einführung und Problemstellung 9 Steinkohle (6). Aufgrund geringer eigener Reserven befinden sich die meisten Länder in einer energetischen Abhängigkeit von einigen wenigen ressourcenreichen Ländern. Eine effiziente und umweltschonende Behandlung und Verwertung organischer Abfälle sollte daher für den aktiven Umweltschutz eine unabdingbare Aufgabe für alle Länder sein. Zur Vermeidung einer weiteren Klimaerwärmung bedarf es ausgefeilter, kostengünstiger und praxistauglicher Methoden zur Reduzierung von Klimagasen. Andererseits sollten aufgrund der gegenwärtigen und zukünftigen energetischen Situationen alternative Energiequellen weiter entwickelt und gefördert werden. Auch im Hinblick auf die Wahrung des natürlichen Gleichgewichtes des Bodens und des Grundwassers müssen potentielle Gefährdungen schon von Anfang an vermieden werden. Die Verwendung und Verwertung von organischen Abfällen als Energieträger würde einen doppelten Beitrag dazu leisten. Sowohl zur Reduzierung der Kontaminationen und ihrer Folgen als auch zur Sicherung der zukünftigen Energieversorgung. Die anaerobe Fermentation wird als eine vielversprechende Alternative zur Nutzung organischer Stoffe gesehen, bevor sie verbrannt oder kompostiert werden (7), (8). Der wesentliche Vorteil dieses Prozesses besteht in der Herstellung von Biogas, das durch Verbrennung zur Wärmeerzeugung und vor allem zur effektiven Stromerzeugung genutzt werden kann (9), (10), (11). Die anaerobe Fermentation kann bei unterschiedlichen Temperaturen gefahren werden. Ein Vorteil des Betriebes bei thermophilen Temperaturen ist die verstärkte Zerstörung von pathogenen Organismen (12). Der anaerobe Abbauprozess erfordert aber noch weitere interdisziplinäre Grundlagenforschung sowie substratspezifische und anwendungsorientierte Forschung. Denn verschiedene Prozessabläufe sind noch nicht exakt untersucht worden und beinhalten daher mögliche Verbesserungspotentiale. Die anaerobe Fermentation von Obst- und Gemüseabfällen und die Vorteile der thermophilen Temperaturen zur Zerstörung von Krankheitserregern sind bislang hauptsächlich getrennt untersucht worden. Beide Aspekte wurden bisher noch nicht in Kombination untersucht, auch kam selten ein anderers Inokulumsmedium als

10 Einführung und Problemstellung 10 Faulschlamm zum Einsatz. Zudem beziehen sich viele Fermentationsstudien nur auf das Verhältnis Biogas- oder Methanausbeute zu der im anaeroben Reaktor zugegebenen Menge an Trockensubstanz (TS) oder organischer Trockensubstanz (ots). Sehr wenige Arbeiten berücksichtigen, in wie weit eine bestimmte Raumbelastung (kg ots/(m 3 d)) noch Biogas produzieren kann. Außerdem werden meist nur Raumbelastungen zwischen 1 bis 5 kg ots/(m 3 d) betrachtet. Die Raumbelastung variiert jedoch auch in Abhängigkeit des zu vergärenden Substrats. Darum ist es wichtig, je nach Substratart die maximal zu verwendende oder zulässige organische Raumbelastung zu kennen, um Reaktorüberlastungen zu vermeiden sowie Fütterungsfrequenzen zu definieren, um die erzeugte Biogasmenge und -qualität zu optimieren. In der vorliegenden Dissertation wurden mit der genannten Zielsetzung wissenschaftliche Untersuchungen zum thermophilen anaeroben Abbauprozess ausgewählter organischer Abfälle aus der Obst-, und Geflügelindustrie in zwei verschiedenen Maßstäben und unter Verwendung von verschiedenen Raumbelastungen mit Hilfe spezieller Mikroorganismen und Enzyme als Bioadditive durchgeführt und analysiert.

11 Stand von Wissenschaft und Technik 11 2 Stand von Wissenschaft und Technik 2.1 Grundlagen des anaeroben Abbauprozesses Beim anaeroben Abbauprozess werden unter Ausschluss von Sauerstoff organische Stoffe durch mikrobiologische Aktivität abgebaut (13). Im Gegensatz zum aeroben Abbau gewinnen die am anaeroben Abbau beteiligten Organismen nur wenig Energie. Eine Selbsterwärmung ist wegen des geringen Energieumsatzes kaum möglich (14). Organische Stoffe wie Kohlenhydrate, Eiweiße oder Fette werden dadurch erst bis zu organischen noch energiereichen Zwischenprodukten wie Säuren und Alkohole abgebaut. Um einen vollständigen Abbau dieser Stoffe zu erreichen, muss man ihre möglichst vollständige Umsetzung zu Biogas anstreben (15). Im Kapitel 2.3 werden die Eigenschaften von Kohlenhydraten, Eiweißen und Fetten ausführlicher behandelt. Biogas besteht im Wesentlichen aus Methan CH4 und Kohlendioxid CO2. Der Energiegehalt des Gases wird hauptsächlich durch den Methananteil bestimmt. Das Gas wird in der Regel zur Wärme- und/oder Stromerzeugung genutzt. Die Gärreste des anaeroben Abbaus sind noch nährstoffreich und können anderen Organismen als Nahrungsquelle dienen (z. B. als Pflanzendünger in der Landwirtschaft) (2). Wie Abb. 2.1 zeigt, läuft der Prozess nach heutigen wissenschaftlichen Erkenntnissen in vier aufeinanderfolgenden Abbauphasen ab (14), bei denen das abbaubare Ausgangsmaterial (Polymere: Kohlenhydrate, Eiweiße und Fette) fortlaufend zu kleineren Einheiten von jeweils verschiedenen Gruppen von Mikroorganismen umgewandelt wird. Diese Organismen verwerten jeweils die Produkte der vorangegangenen Schritte (13). Daher sind prinzipiell die Organismen, die weiter hinten in der Abbaukette der anaeroben Biozönose liegen, von dem Eingangssubstrat unabhängig (15). Die Anwesenheit der verschiedenen Mikroorganismen ist zum Teil vom abzubauenden Substrat abhängig. Handelt es sich um Rohschlamm oder Abwasser, werden mit dem Substrat bei der Inbetriebnahme und jeder Substrateinbringung die

12 Stand von Wissenschaft und Technik 12 Bakterien der ersten und zweiten Phase in großer Zahl mit eingebracht. Die Organismen der dritten und vierten Phase (wie bei der anaeroben Behandlung organischer Abfälle) fehlen dagegen und müssen bei der Inbetriebnahme durch Animpfen mit anaerob behandeltem Substrat eingemischt werden (15). Organische Polymere (Kohlendydrate, Eiweiß, Fette) Hydrolytische Bakterien Hydrolyse Enzyme Monomere Acidogenese (Versäuerung) Acidogene Bakterien Flüchtige Fettsäure, Alkohole H 2, C 1 Acetogenese Acetogene und Syntrophe Bakterien Homoacetogene Essigsäure (Acetat) H 2, C 1 Methanogenese Methanogene Archaea Acetotrophe Hydrogenotrophe Einphasiges Verfahren: Gesamte Prozesskette in einem Behälter CH 4, CO 2 Zweiphasiges Verfahren: Räumliche Trennung von Vorversäuerung und Methanbildung Abb. 2.1: Phasen der Biogasentstehung (13), (14)

13 Stand von Wissenschaft und Technik Phase: Hydrolyse In dieser Phase werden durch Enzyme die hochmolekularen, zumeist ungelösten Polymere biochemisch unter Anlagerung von Wasser in niedermolekulare Verbindungen gespalten. Die Enzyme können entweder von Mikroorganismen abgesondert oder gezielt dem Prozess zugefügt werden. Diejenigen der Mikroorgnismen werden ebenso als Exoenzyme bezeichnet, weil sie ihre Aktivität außerhalb der Bakterien durchführen. Sie werden entweder völlig ins Medium ausgeschieden oder haften an den Zelloberflächen der hydrolytischen Bakterien dieser Phase (16). Tab. 2.1 zeigt die wesentlichen Stoffwechselprozesse der Hydrolyse. Ob ein bestimmtes Substrat einer anaeroben Behandlung zugänglich ist, entscheiden in erster Linie die hydrolysierenden Bakterien (15). Bei pflanzlichem vergärenden Material, in dem viele Gerüstsubstanzen wie Cellulose, Hemicellulose und Lignin vorhanden sind, ist die Hydrolyse der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (17). Handelt es sich um z. B. ein fetthaltiges Substrat, dann sind die geschwindigkeitslimitierenden Schritte die Hydrolyse und Versäuerung. Denn erst dann, wenn die fermentativen Bakterien die Polymere in für die nachfolgenden Bakteriengattungen angreifbare Substanzen zersetzt haben, kann ein vollständiger Abbau bis zu CO2 und CH4 stattfinden (15). Das Abwasser einer Zucker- oder einer Stärkefabrik ist hingegen leicht zu hydrolysieren und zu versäuren. In diesen Fällen wird i. d. R. nicht die Hydrolyse der geschwindigkeitslimitierende Schritt sein, sondern die Methanbildung (15). Tab. 2.1: Stoffumsetzungen in der Hydrolyse und Beispiele beteiligter Mikroorganismen (18), (14) Substrate Kohlenhydrate Proteine Fette Beispiele Mikroorganismen Clostridium sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp. Produkte Monosacharide Aminosäuren Kurzkettige Peptide Langkettige Fettsäuren Glyzerin Allerdings verläuft der Prozess nur dann optimal, wenn die Abbaugeschwindigkeiten in allen Stufen gleich groß sind. Würde sich die Hydrolyse verlangsamen, so würde das Nährstoffangebot für die weiteren Phasen durch das Angebot der

14 Stand von Wissenschaft und Technik 14 Zwischenprodukte limitiert werden, d. h. die Methanproduktion würde sich ohne Veränderung des Prozessablaufes verringern. Wenn sich dagegen die zweite und dritte Phase verlangsamen, reichern sich die Zwischenprodukte aus der Hydrolyse an, d. h. im Biogas nimmt der CO2-Anteil zu (> 30 Vol.-%), im Substrat steigt die Säurekonzentration, der ph-wert sinkt unter 7,0 ab, und der Fermenter schlägt in die säure Gärung um (15). 2. Phase: Acidogenese (Versäuerungsphase) In dieser Phase werden von verschiedenen fakultativ und obligat anaeroben Bakterien die in Tab. 2.2 gezeigten Produkte aus den Zwischenprodukten der Hydrolyse gebildet. Hiervon sind für die Methanogenen jedoch nur Essigsäure, Wasserstoff H2, und CO2 direkt nutzbar. Tab. 2.2: Stoffumsetzungen in der Acidogenese und Beispiele beteiligter Bakterien (18), (19), (20) Substrate Monosaccharide Aminosäuren Kurzkettige Peptide Langkettige Fettsäuren Glyzerin Beispiele Mikroorganismen Clostridium sp. Bacteroides sp. Butyrivibrio sp. Produkte Niedermolekulare flüchtige, Fettsäuren (Acetat, Propionat, Butyrat), Aldehyde, Alkohole, Ketone, Ammoniak, Kohlendioxid, Wasserstoff Die Versäuerung (wie die Hydrolyse) wird von einer großen Gruppe verschiedener fakultativer Anaerobier durchgeführt. Diese Phasen weisen daher große Toleranz gegenüber Milieuschwankungen (Temperatur, ph, toxische Stoffe) auf (15). 3. Phase: Acetogenese Um möglichst viel Methan zu gewinnen, müssen die in der zweiten Phase gebildeten niedermolekularen organischen Säuren und Alkohole vor allem in Essigsäure bzw. in deren gelöstes Salz (Acetat) sowie in Wasserstoff und Kohlendioxid umgewandelt werden (siehe Tab. 2.3). Es handelt sich bei dieser Stufe, welche von den acetogenen Bakterien (obligat Protonen reduzierende Bakterien) ausgeführt wird, um den thermodynamisch aufwändigsten Schritt des Gesamtabbaus.

15 Stand von Wissenschaft und Technik 15 Tab. 2.3: Stoffumsetzungen der Acetogenese und Beispiele beteiligter Mikroorganismen (18), (21), (22) Substrate flüchtige Fettsäuren (Propionat, Butyrat) Aldehyde Alkohole Ketone Beispiele Mikroorganismen Clostridium sp. Eubacterium sp. Produkte Essigsäure, Acetat, Kohlendioxid, Wasserstoff Unter Normalbedingungen (20 ⁰C, ph = 7, alle Substratkonzentrationen = 1 Mol/l) verbrauchen diese Reaktionen Energie, d. h. sie können von den Bakterien gar nicht durchgeführt werden, da diese ja selbst Energie zum Wachstum brauchen (16). Die acetogenen (wie die methanogenen) Bakterien sind empfindliche Spezialisten, auf deren Ansprüche die Verhältnisse im Reaktor abgestimmt werden müssen. Beide Gruppen haben eine sehr geringe Wachstumsgeschwindigkeit (15). Der in dieser Phase produzierte Wasserstoff lässt den Wasserstoffpartialdruck ansteigen. Dieser hemmt als Abfallprodukt der Acetogenese den Stoffwechsel der acetogenen Bakterien. Während der Methanogenese wird Wasserstoff zur Methanbildung verbraucht, so dass diese beiden Prozesse voneinander abhängig sind und nebeneinander in einer Art Symbiose der beteiligten Organismengruppen ablaufen (19). 4. Phase: Methanogenese In der letzten Phase des anaeroben Abbaus werden durch die methanogenen Bakterien Essigsäure und Acetat zu CH4 und CO2 umgewandelt (ca. 70 Vol.-% der Methanogenese). Es ist bisher nur eine geringe Anzahl acetatverwertender Methanbakterien bekannt (z. B. Methanosarcina barkeri, Methanobakterium söhngenii, Methanobakterium thermoautotrophicum). Sie wachsen auf Acetat mit einer Generationszeit von mindestens 100 Stunden sehr langsam, wobei sich CO2 als essentiell für das Wachstum erwiesen hat. Wenn ein energiereicheres Substrat von Methanosarcina barkeri verwertet werden kann, wie z. B. Methanol oder Methylamine, liegt die Generationszeit niedriger (40 h) (15). Zusätzlich (ca Mass.-% der Methanogenese) werden das CO2 und H2, die in der Acidogenese gebildet worden sind, zu Methan und Wasser (CO2 + 4H2 -> CH4 + 2H2O) durch hydrogenotrophe Mikroorganismen - wie z. B. Methanobacterium

16 Stand von Wissenschaft und Technik 16 bryantii, (19) - umgewandelt (siehe Tab. 2.4). Diese Umwandlung wird als reduktive energetisch efektivere Methanbildung bezeichnet (15). Tab. 2.4: Stoffumsetzungen in der Methanogenese und Beispiele beteiligter Mikroorganismen (17), (22) Acetat Wasserstoff Kohlendioxid Substrate Beispiele Mikroorganismen Methanosarcina sp. Methanosaeta sp. Methanobacterium sp. Produkte Methan Kohlendioxid Die methanogenen Bakterien sind Substratspezialisten, die nur sehr wenige Verbindungen umzusetzen vermögen. Molekularer Wasserstoff kann jedoch als universelles Substrat Methanogener angesehen werden, und CO2 kann als C-Quelle und terminaler Elektronenakzeptor dienen. Die Methanogenen benötigen H2 als Elektronendonator und sind auch gegenüber höheren H2-Konzentrationen nicht empfindlich. Die Methanbakterien haben unterschiedliche Ansprüche (23), wie z. B.: - mindestens 50 Mass.-% Wassergehalt - streng anaerobe Bedingungen - Lichtabschluss. Licht ist für sie zwar nicht tödlich, hemmt aber den Prozess Einfluss von Prozessparametern Der größte Teil der im Anwendungsbereich verwendeten Biogasfermenter besteht aus einem einstufigen, semikontinuierlich betriebenen System. Dabei wird dem Fermenter in bestimmten Zeitabständen (z. B. einmal täglich) Frischsubstrat zugeführt und gleichzeitig eine identische Menge vergorenen Substrats abgezogen bzw. aus dem Fermenter verdrängt. Mit diesem Substrat werden aber auch im selben Maße Bakterien aus dem Fermenter entfernt. Damit das System im Gleichgewicht verbleibt, muss dafür gesorgt sein, dass die Zunahme der Bakterien durch das Wachstum (Wachstumrate = µ) die Verluste duch den Abzug (Verdünnungsrate = D) kompensiert, d. h. beide Größen müssen einander gleich sein (D = µ). Die Wachstumrate ist bei einem kontinuierlichen System keine Konstante, sondern hängt von der Substratkonzentration ab (16).

17 Stand von Wissenschaft und Technik 17 In einem solchen System können verschiedene Prozessgrößen beschrieben werden, die den Abbauprozess und damit auch die Biogasproduktion beeinflussen. Im Folgenden werden die wesentlichen Prozessparameter behandelt Einfluss der Temperatur Grundsätzlich laufen chemische Reaktionen umso schneller ab, je höher die Reaktionstemperatur ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit chemischer Umsetzprozesse steigt mit zunehmender Temperatur stark an. Diese Abhängigkeit gilt jedoch nur bedingt für die biologischen Abbau- und Umsetzungsvorgänge, da ihre Geschwindigkeit in hohem Maße ebenso durch Enzyme beinflusst wird (16), welche abgesondert oder zugegeben werden können. Der Unterschied gegenüber anorganischen chemischen Reaktionen besteht darin, dass der Reaktionsgeschwindigkeit Grenzen durch die Temperaturempfindlichkeit dieser Enzyme sowie der Bakterien gesetzt werden. Manche Enzyme werden bereits bei Temperaturen von 40 bis 50 ⁰C irreversibel geschädigt. Nur wenige Enzyme sind bei Temperaturen oberhalb von 60 ⁰C beständig (wie z. B. Papain). Die Zunahme der Temperatur bewirkt also zunächst eine Steigerung der Umsatzrate, die jedoch nach dem Überschreiten eines Maximums infolge der beginnenden temperaturbedingten Inaktivierung der Enzyme wieder abnimmt (siehe Abb. 2.2 a) (16). Bei den Bakterien ist die Lage des optimalen Temperaturbereiches organismenspezifisch und kann je nach Organismenart unter 20 ⁰C bis über 80 ⁰C betragen. In der Literatur werden die Bakterien nach ihren unterschiedlichen temperaturabhängigen Aktivitätsoptima in drei Gruppen eingeteilt. Diese drei Gruppen entsprechen den nachfolgenden Temperaturbereichen (16), (24), (23), (21): - psychrophiler Temperaturbereich (< 20 ⁰C) - mesophiler Temperaturbereich (20-45 ⁰C) - thermophiler Temperaturbereich (> 45 ⁰C)

18 Stand von Wissenschaft und Technik 18 Abb. 2.2: Abhängigkeit der relativen Methanproduktion von der Temperatur, a) bei Faulschlamm (16), b) bei verschiedenen Reinkulturen methanogener Bakterien (25) Der größte Teil der Boden- und Wasserbakterien ist mesophil. Thermophile Bakterien finden erst oberhalb von 45 ⁰C ihre optimale Temperatur vor, während die psychrophilen Bakterien Temperaturen von unterhalb 20 ⁰C bevorzugen. Die Methangärung findet in allen drei o. g. Temperaturbereichen statt, wobei wiederum der Großteil aller bekannten Methanbakterien ihr Temperaturoptimum im mesophilen Bereicht hat (16). Der Einfluss der Temperatur auf die Aktivität der versäuernden Bakterien wurde bisher wenig untersucht. Praktische Erfahrungen haben jedoch gezeigt, dass diese Bakterien unempfindlich und flexibel auf die Umgebungstemperatur reagieren. Bei einem zweistufigen Versuch zeigten sie in der Versäuerungsstufe zwei ausgeprägte Temperaturoptima, zum einen im mesophilen Bereich bei 35 ⁰C und zum anderen im thermophilen Bereich bei ⁰C (26). Für den Betrieb zweistufiger Anlagen mit der Hydrolyse und Versäuerung vorwiegend in der ersten Stufe sind jedoch weitere Untersuchungen bezüglich der Temperaturoptima der versäuernden Bakterien notwendig (24). Im Vergleich zu versäuernden Bakterien sind Methanbakterien bedeutend temperaturempfindlicher. Der Großteil aller bekannten Methanbakterien hat ihr Temperaturoptimum im mesophilen Bereicht (16). Sie erreichen ihre maximale Stoffwechselaktivität bei Temperaturen von 30 bis 40 ⁰C. Es wurden jedoch schon

19 Stand von Wissenschaft und Technik 19 thermophile und hochthermophile Methanbildner (z. B. Methanobakterium thermoautotrophicum) mit Optimaltemperaturen jeweils zwischen ⁰C und ⁰C isoliert (siehe Abb. 2.2 b), (27), (16). Bei steigender Temperatur nimmt die Temperaturempfindlichkeit (besonders der Methanbakterien) gegenüber Temperaturschwankungen zu, vor allem, wenn diese kurzfristig auftreten und die Temperatur sinkt. Während im mesophilen Bereich tägliche Schwankungen von 2-3 K um den Mittelwert noch verkraftet werden, sollten sie im thermophilen Bereich nicht größer als 1 K sein (23). Nach van Velsen (1981) ist der Cellulose- und Hemicelluloseabbau bei thermophilen Temperaturen höher als bei mesophilen und psychrophilen Temperaturen. Nach Schluz (1996) sind bei höheren Temperaturen die Abbaugeschwindigkeit und die Gasproduktion höher, und die erforderliche Abbauzeit im Reaktor ist kürzer, wodurch sich kleinere Reaktoren realisieren lassen. Allerdings ist der Methangehalt im Biogas etwas niedriger. Nach Baserga (1984) sinkt der Methangehalt des Biogases mit zunehmender Gärtemperatur aufgrund der sich verändernden CO2-Löslichkeit im Substrat. In seinen Versuchen wurde z. B. bei 24 ⁰C ein um 5-8 Vol.-% höherer Methangehalt gemessen als bei 36 ⁰C. Obwohl im thermophilen Temperaturbereich ein schnellerer und zum Teil vermehrter Stoffabbau stattfindet, werden die meisten Biogasanlagen bis auf wenige Ausnahmen im mesophilen Temperaturbereich betrieben. Der Grund hierfür liegt u. a. im erhöhten Prozessenergiebedarf thermophiler Anlagen (16), dessen Einfluss auf die Nettoenergieausbeute und die Gesamtwirtschaftlichkeit der Anlagen negativ sein könnte. Tab. 2.5 zeigt die Unterschiede zwischen mesophilem und thermophilem Temperaturbereich. Zusammenfassend kann gefolgert werden, dass für Praxisanlagen Gärtemperaturen von 30 bis 32 ⁰C ausreichend sind, um in den Bereich maximaler Gasausbeuten zu kommen, sofern die Verweilzeit mindestens 20 Tage beträgt. In welchem Bereich hingegen die Optimaltemperatur bezüglich einer maximalen Nettoenergieausbeute oder der Gesamtwirtschaftlichkeit einer Anlage liegt, hängt noch von einer Anzahl

20 Stand von Wissenschaft und Technik 20 weiterer Parameter wie z. B. den Gasverwertungsmöglichkeiten, den Substrateigenschaften oder den baulichen Gegebenheiten ab und muss für jede Einzelanlage an Ort und Stelle eruiert werden (16). Tab. 2.5: Vergleich zwischen dem anaeroben Abbau im mesophilen und thermophilen Temperaturbereich (2), (16), (21), (23), (28) Mesophiler Temperaturbereich - höhere Prozessstabilität auch bei Temperaturschwankungen - geringerer Prozessenergiebedarf zur Substraterwärmung Vorteile: Thermophiler Temperaturbereich - höherer Stoffumsatz (auch höherer Cellulose- und Hemicelluloseabbau) - geringere Verweilzeit des Substrats im Fermenter: 3-10 Tage. Nach Aschman et al. (2007): Tage - große Vielfalt an methanbildenden Bakterienarten, dadurch Mischpopulation mit stabilerem Abbau (auch im Falle eines Absterbens einzelner Bakterienstämme) - kleinere Reaktorvolumina - höhere Gasproduktion - Entseuchung, d. h. zuverlässige Abtötung von Krankheitserregern bei entsprechender Prozessführung (wichtig für die spätere Nutzung des ausgefaulten Substrats als Dünger für die Landwirtschaft). Die bei der mesophilen Fahrweise notwendige kostenintensive und aufwändige Pasteurisierung entfällt. Nachteile: - bessere Stabilisierung des Substrats (Substrat wird als stabil bezeichnet, wenn es nicht mehr durch weiteren mikrobiellen Abbau zersetzt werden kann. Für die Praxis ist eine relative Stabilisierung ausreichend, d. h. dass keine üblen Gerüche mehr freigesetzt werden) - Sterilisation von Pflanzensamen (außer Tomate). (wichtig für die spätere Nutzung des ausgefaulten Substrats als Dünger) - geringerer Stoffumsatz - höhere Verweilzeit des Substrats im Fermenter (20-25 Tage) - größere Reaktorvolumina - geringere Gasproduktion - Bedenklichkeit der Hygiene des vergorenen Substrats - kostenintensive und aufwändige Pasteurisierung des vergorenen Substrats bei geplanter landwirtschaftlicher Nutzung - geringere Stabilisierung des Substrats - geringere Sterilisation von Pflanzensamen - verminderte Prozessstabilität (höhere Empfindlichkeit gegenüber Temperatur- und Belastungsschwankungen, erhöhte Gefahr einer Ammoniakhemmung) - vermehrter Aufwand zur Anlagenüberwachung - höherer Prozessenergiebedarf zur Substraterwärmung (Nettoenergieproduktion kann trotz des Vorteils der Volumenreduktion des Reaktors ungenügend sein und somit keine wirtschaftlichen Vorteile bringen) - kleinere Vielfalt an methanbildenden Bakterienarten - geringerer Methangehalt im Biogas

21 Stand von Wissenschaft und Technik Einfluss der Substratzusammensetzung Für die Biogasproduktion ist die Zusammensetzung des Substrats die maßgebende Ausgangsgröße, da diese einerseits die Aufrechterhaltung der Lebensfunktionen und andererseits den Aufbau neuer Zellsubstanz der Organismen (Entwicklung der Biozönose) beeinflusst. Die wesentlichen organischen Substratinhaltstoffe, die die Organismen brauchen, lassen sich in Kohlenhydrate, Fette und Proteine unterteilen. Sie sind in erster Linie als Ausgangsstoffe für die Gasproduktion anzusehen (24). Neben den organischen Stoffen ist auch eine Vielzahl anorganischer Substanzen (Stickstoff, Phosphor, Calcium, Natrium, Kalium) für die Lebewesen erforderlich. Darüberhinaus ist noch ein ausgewogenes Angebot an Spurenelementen von Bedeutung (24), (siehe Seite 21). Der Bedarf an Nährstoffen für die anaeroben Mikroorganismen ist deutlich geringer als bei den aeroben Bakterien, da sehr viel weniger Biomasse (bezogen auf die abgebaute organische Substanz) beim anaeroben Prozess gebildet wird. Die Wachstumsgeschwindigkeit der anaeroben Bakterien ist ebenso gering (14), (15). Die anaeroben Bakterien benötigen z. B. wesentlich weniger Kohlenstoff als die aeroben Bakterien. Beim anaeroben Abbau werden nur 1-5 Mass.-% des Kohlenstoffes für den Aufbau von Biomasse, aber Mass.-% zu Biogas umgesetzt. Etwa 5 Mass.-%. verbleiben im ausgefaulten Substrat (29). Die Substratzusammensetzung ist unmittelbar mit der Zusammensetzung der entstehenden Stoffwechselprodukte verknüpft (24). So werden z. B. die Mengenanteile der Hauptstoffwechselprodukte des vollständigen anaeroben Umsatzes (CH4, CO2) vom Ausgangssubstrat maßgeblich beeinflusst. Die Bildung von Biogas lässt sich rein theoretisch mit folgender Formel für beliebige organische Stoffe berechnen (30): CaHbOcNdSe + (4a b - 2c + 3d + 2e) H2O = 1/8 (4a + b - 2c - 3d - 2e) CH4 + 1/8 (4a b + 2c + 3d + 2e) CO2 + dnh3 + eh2s Für die wesentlichen organischen Stoffgruppen ergeben sich demnach die in Tab. 2.6 dargestellten Biogaszusammensetzungen.

22 Stand von Wissenschaft und Technik 22 Fette weisen den höchsten und Eiweiße den niedrigsten Methananteil auf. Eiweiße bilden zudem die Quelle für die Produktion der Biogasbestandteile Stickstoff und Schwefelwasserstoff, der dem Biogas den fauligen Geruch und die korrosive Wirkung gibt. Bezogen auf die Masse der Ausgangssubstanz und unter Standardbedingungen von Druck und Temperatur liefern Fette das höchste spezifische Biogasvolumen ( l/kg), während Kohlenhydrate l/kg und Eiweiße etwa 700 l/kg spezifisches Gasvolumen produzieren (24), (21). Tab. 2.6: Theoretische Biogaszusammensetzung beim Abbau der wesentlichen organischen Stoffe (16) CH 4 (Vol.-%) CO 2 ( Vol.-%) NH 3 (Vol.-%) H 2S (Vol.-%) Kohlenhydrate (Glucose) Eiweiße (Durchschnitt) Fette (Tripalmitin) Stickstoffgehalt Stickstoff stellt einen essentiellen lebensnotwendigen Stoff (unter anderen wie Kohlenstoff, Phosphor, Spurenelemente etc.) bei der Abwasserreinigung und Schlammbehandlung dar. Die abbauende Bakterienpopulation wird unter entsprechend optimierten Randbedingungen (z. B. Temperatur, ph-wert etc.) einen maximalen Stoffumsatz anstreben, bis zu einem Defizit der lebensnotwendigen Nährstoffe. Der Bedarf an Stickstoff für die anaeroben Mikroorganismen ist geringer als bei den aeroben Bakterien (siehe Seite 20). Daher werden geringere Mengen Stickstoff beim anaeroben Prozess eliminiert. Allerdings führt eine derartige Limitierung lebensnotwendiger Stoffe im abbauenden Substrat zum Abbruch der Stoffwechselaktivität. Bei stickstoffreichen Schlämmen sind dementsprechend hoch die Abflußwerte für Stickstoff bei Anaerobanlagen (24). Andererseits könnte ein Überschuss an Stickstoff zur höheren Ammonifikation (organisch N, NH2 + NH4 + ) führen, was hemmend auf den anaeroben Prozess wirken kann (siehe Seite 33).

23 Stand von Wissenschaft und Technik 23 Phosphorgehalt Phosphor ist ein Schlüsselelement für lebende Organismen. In der Natur kommt Phosphor ausschließlich in gebundener Form als Phosphat (PO4 3 ) vor. Die Bakterien im Reaktor benötigen Phosphat für den Stoffwechsel des anaeroben Abbaus. In der Praxis muss bei zu geringem Phosphorgehalt eine Zudosierung von Phosphor in Form von z. B. verdünnter Phosphorsäure erfolgen, um optimale Milieubedingungen für die anaeroben Mikroorganismen einzustellen (24). Verhältnis von Kohlenstoff, Stickstoff und Phosphor Das Mindestnährstoffverhältnis für die anaerob belebte Biomasse berücksichtigt den Summenparameter des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) als Maß für den Kohlenstoffanteil (bzw. den organischen Anteil der Substratinhaltsstoffe) sowie den Gehalt an gesamtem Stickstoff und Phosphor (als anorganische Anteile der Substratinhaltsstoffe). Nach Mudrack und Kunst (1991) beträgt dieses Verhältnis für den Abbau von Kohlenhydraten: CSB:N:P ca. 300:5:1 für den Abbau von Lipiden und Proteinen: CSB:N:P etwa 800:5:1 Nach Weiland (2001) zit. nach Aschmann (2007) sollte das C:N:P:S-Verhältnis bei 600:15:5:1 (d. h. 120:3:1:0,2) liegen, um die Bakterien ausreichend mit Nährstoffen zu versorgen. Die o. g. Verhältnisse verdeutlichen, dass beim anaeroben Kohlenstoffabbau nur geringe Mengen Stickstoff und Phosphor eliminiert werden (24). Der Nährstoffgehalt und damit die Düngewirkung des ausgefaulten Biosubstrats ist somit sehr hoch (2). Schwefel ist für den Aufbau der Bakterienzellen ebenfalls ein essentieller Mineralstoff. Nach Mudrack und Kunst (1991) sollte der Schwefelbedarf dem des Phosphors entsprechen. Schwefelquellen können proteinhaltige Substrate, Schwefelsäure aus der Reinigung von Edelstahlbehältern und Sulfate, z. B. aus der Schwefelung von Kartoffeln vor der Verarbeitung, sein.

24 Stand von Wissenschaft und Technik 24 Da der Schwefel von den Methanbakterien nur in reduzierter Form aufgenommen werden kann, ergibt sich eine optimale Schwefelkonzentration von ca. 10 mg/l gelöstem Schwefelwasserstoff (H2S) (15). Substrate wie kommunale Schlämme und Abwässer verfügen meist über eine sehr ausgewogene, für die Bakterien günstige Nährstoffzusammensetzung. Fehlen hingegen (wie häufig bei Industrieabwässern) einige dieser Nährstoffe im Prozess oder kommt es während des zunehmenden Abbaus zu einem Mangel, ist eine Zugabe (z. B. über häusliches Abwasser, spezielle Nährstoffe wie Methanol als C- Quelle oder Stickstoff- oder Phosphorsalze) von Mangelsubstanzen nötig, sonst kann es zu einer Verlangsamung oder sogar der vollständigen Hemmung der Biosynthese kommen (24). Spurenelemente Spurenelemente sind Nährstoffe, die in Spuren wirken und für den normalen Ablauf von Lebensvorgängen unentbehrlich sind. Zu den wichstigsten Spurenelementen zählen Chrom, Mangan, Eisen, Kobalt, Kupfer, Zink, Selen, Molybdän, Jod, Nickel, Arsen und Fluor (24). Nach Mudrack und Kunst (1991) sind als essentielle Elemente sowohl für methanbildende Mischbiozönosen als auch für hydrolytische, acidogene und acetogene Bakterien Nickel, Kobalt, Molybdän, Eisen, Selen und Wolfram nachgewiesen worden. Bei einzelnen Gattungen der acetogenen Bakterien sind darüberhinaus Zink, Kupfer und Mangan notwendig. Während Nickel für das Wachstum anderer Bakterien allgemein nicht erforderlich ist, ist es ein essentieller Bestandteil aller Methanbakterien, da es für die Synthese der Zellkomponenten Co- Faktor F430 und der Enzyme Hydrogenase und Kohlenmonoxid-Hydrogenase einen notwendigen Baustein darstellt (1 g Zellsubstanz enthält durchschnittlich 10 μg Nickel) (15). In der Praxis ist es häufig ein Mangelfaktor, so dass die Dosierung von Nickel zu einer Verbesseung der Methanogenese führt. Das Wachstum von Methanbakterien ist weiterhin von Kobalt, Molybdän und Wolfram abhängig. Für Methanosarcina barkeri wurde z. B. ein optimales Wachstum bei 0,06 mg/l Kobalt und 0,05 mg/l Molybdän ermittelt (15). Wolfram sowie Selen sind jedoch nur für wenige Methanbakteriengattungen als essentiell nachgewiesen worden. Für Eisen wurde eine stimulierende Wirkung bei den Methanbakterien beobachtet (15).

25 Stand von Wissenschaft und Technik 25 In der Regel begrenzt ein Mangel an Spurenelementen bei den methanogenen Bakterien die Abbaugeschwindigkeit des Gesamtprozesses (15). Am ehesten wird es zum Mangel insbesondere von Kobalt und Nickel kommen (24). Die optimalen Konzentrationen der wichtigsten Spurenelemente sind in Tab. 2.7 aufgeführt. Tab. 2.7: Optimale Konzentrationen gelöster Spurenelemente im Anaerobreaktor (31), (32) Element Konzentration (mg/l) Eisen (Fe) Nickel (Ni) Kobalt (Co) Molybdän (Mo) Selen (Se) Chrom (Cr) Mangan (Mn) Blei (Pb) ,005-0,5 0,003-0,06 0,005-0,05 0,008 0, , , Feststoffgehalt Der Feststoffgehalt (auch als Trockensubstanzgehalt, Trockenmassenkonzentration, Substratkonzentration, Trockensubstanzkonzentration, Schlammgehalt und Schlammtrockensubstanz bezeichnet) ist die in einem bestimmten Volumen enthaltene Trockenmasse. Der Trockensubstanzgehalt (TS) wird z. B. in g/l gemessen. Nach Inden (1977) und Kapp (1984) zit. nach Dauber (1993) ist bis zu einem Feststoffgehalt von 10 Mass.-% kein signifikanter Einfluss des Feststoffgehalts auf den Verlauf des anaeroben Prozesses zu verzeichnen. Nach Kleemann und Meliß (1993) liegt der optimale Trockensubstanzgehalt des Substrats im Bereich von 3 bis 10 Mass.-%. Dieser Wert kann durch Zugabe von Wasser (z. B. bei Fruchtabfällen) oder durch Eindickung (z. B. bei Klärschlamm) eingestellt werden. Nach Van Velsen (1981), Baserga (1983) und Wellinger et al. (1991) ist die Grenzbelastbarkeit bei der Substratkonzentration unterschiedlich. Während in einigen Versuchen schon bei TS-Gehalten von 10 Mass.-% eine totale Hemmung, d. h. ein Umkippen des Prozesses beobachtet wurde, zeigen die Ergebnisse anderer Untersuchungen sowie Erfahrungswerte aus Praxisanlagen, dass durchaus mit höheren Feststoffgehalten gefahren werden kann, ohne Probleme mit dem Gärprozess zu bekommen. Die Gründe hierfür sind in der Substratzusammensetzung zu suchen. So sollte z. B. die obere Grenze der TS-Belastung herabgesetzt werden, wenn das Substrat einen hohen Eiweißgehalt hat und daraus eine erhöhte Ammoniakkonzentration resultiert (16).

26 Stand von Wissenschaft und Technik 26 Andererseits nehmen mit steigendem Feststoffgehalt Probleme beim hydraulischen Transport des Substrats in Leitungen und bei der Durchmischung des Reaktors zu (schlechtere Pumpfähigkeit des Substrats, ungenügende Versorgung der Bakterien mit abbaufähigem Substrat aufgrund nicht ausreichender Durchmischung etc.) (24). Der Feststoffgehalt setzt sich aus anorganischen und organischen Bestandteilen zusammen. Der anorganisch-mineralische Anteil muß zunächst als nicht nutzbare Masse angesehen werden, kann jedoch je nach Größe und Form von den Bakterien als Siedlungsfläche angenommen werden, was u. a. zur Bildung von Pellets und Granulat führt (24). Der organische Anteil (auch als organische Trockensubstanz, organischer Trockensubstanzgehalt, organische Substratkonzentration, organische Substanz bezeichnet) wird üblicherweise als ots bezeichnet und als Bemessungsgröße für Anaerobreaktoren in Form der organischen Raumbelastung verwendet. Nachteil dieser Bemessungsgröße ist, dass mit diesem Parameter keine Aussage zur Abbaubarkeit der organischen Stoffe und der wirklichen Substratversorgung der Bakterien gemacht wird. Die ots wird ebenso als Bezugsgröße für die produzierte Gasmenge verwendet (24). Üblicherweise wird die Gasproduktion als spezifische Gasmenge oder Gasausbeute mit Bezug auf die zugeführte ots angegeben [m 3 Biogas/kg otszu]. Über die ots wird in der Biogastechnik die potentiell nutzbare Energie eines Substrats definiert. Die Menge des zugeführten Substrats basiert üblicherweise auf dessen spezifischer ots. Ist die im Substrat enthaltene Konzentration an organischer Substanz zu gering, dann wird der Reaktorbehälter zu groß, was hohe spezifische Anlagenkosten zur Folge hat. Bei höherer Konzentration ist die gesamte Gasausbeute größer, aber es besteht die Gefahr, dass infolge einer Überlastung mit vergärbaren Stoffen eine Hemmung durch eine zu große Menge bestimmter Zwischenprodukte eintritt (21) Einfluss der Verweilzeit und der Raumbelastung Die hydraulische Verweilzeit ist als die mittlere Aufenthaltszeit des Substrats im Fermenter definiert. Sie ergibt sich aus dem Fermentervolumen V (m 3 ) und der Substratzulaufrate Vs (m 3 /d) durch die Beziehung (16): Verweilzeit Z = V/Vs, (d)

27 Stand von Wissenschaft und Technik 27 Die optimale Verweilzeit hängt stark von der Temperatur ab. Für mesophile Bakterien (30 ⁰C) beträgt die optimale Verweilzeit 20 bis 25 Tage, während thermophile Bakterien eine geringere Verweilzeit von nur 3 bis 10 Tagen benötigen (21). Die Substratkonzentration (TS oder ots) und die Verweilzeit des Substrats im Fermenter sind neben der Substratzusammensetzung und der Temperatur die beiden weiteren wesentlichen Prozessgrößen, welche die Gasproduktion und damit die Wirtschaftlichkeit einer Anlage beeinflussen: Hohe Substratkonzentrationen erhöhen die Ausbeute an nutzbarem Gas. Zudem reduziert sich das erforderliche Reaktorvolumen (16). Als Raumbelastung bezeichnet man die pro Volumeneinheit des Fermenters täglich zugeführte Substratmenge. Sie berechnet sich nach folgender Formel (16): Vs S S Raumbelastung = (kg/m 3 d) S = TS oder ots in kg/m 3 V Z Wie aus dieser Formel ersichtlich ist, wird die Raumbelastung einerseits durch die TS oder ots und andererseits durch die Verweilzeit bestimmt. Eine Belastungserhöhung findet also nicht nur statt, wenn das Substrat konzentrierter anfällt (höherer TS- Gehalt), sondern auch dann, wenn die Verweilzeit verkürzt wird. In beiden Fällen wird dem Fermenter bzw. den Bakterien mehr Substrat pro Zeiteinheit zugeführt. Allerdings kann die Raumbelastung nicht beliebig erhöht werden, da mit zunehmender Konzentration des Substrats die Toxizitätsgrenze verschiedener Hemmstoffe erreicht und dadurch das Wachstum der Bakterien erheblich gestört werden kann. Die kinetischen Prozessgrößen eines Biogasfermenters wie spezifische Gasmenge, Raumbelastung und Verweilzeit sind gekoppelt. Mit zunehmender TS oder ots nimmt die Raumbelastung zu, wobei bei der spezifischen Gasmenge eine Ertragseinbuße festzustellen ist (16). Um eine Optimierung des Faulprozesses im Hinblick auf eine möglichst hohe Nettoenergieausbeute durchführen zu können, ist es demzufolge notwendig zu wissen, wie sich die Substratkonzentration und die Verweilzeit auf den Prozess auswirken und wo ihre unteren und oberen Grenzen liegen (16).

28 Stand von Wissenschaft und Technik 28 Bei mesophilen Temperaturen fällt bei Unterschreitung der Mindestverweilzeiten die Gasproduktion schnell und kann die kritische Grenze (ca. 10 Tage) bezüglich der Prozessstabilität erreichen. Nach Roediger et al. (1990) sinkt der Abbaugrad bei Verweilzeiten unter 10 Tagen stark ab. Die Gaszusammensetzung bleibt jedoch über einen weiten Verweilzeitbereich (z. B. 10 bis 30 Tage bei Vergärung von Rindermastgülle) konstant (16). Wie bei der Verweilzeit sind auch der Substratkonzentration untere (Energiebilanz) und obere Grenzen (Überlastung/Hemmung des Prozesses) gesetzt. Nach Wellinger et al. (1991) nimmt die spezifische Gasmenge mit zunehmendem Trockensubstanzgehalt ab, und zwar umso stärker, je kürzer die Verweilzeit gewählt wird. Eine Verweilzeitreduktion wirkt sich umso gravierender auf die Raumbelastung aus, je höher die Substratkonzentration (TS oder ots) ist. Ganz allgemein wird mit zunehmender Raumbelastung eine Abnahme der spezifischen Gasausbeute beobachtet, was entweder auf die Verweilzeitverkürzung (Erhöhung der Raumbelastung durch Verweilzeitreduktion) oder auf gewisse Hemmprozesse wie z. B. Amoniakhemmung (Erhöhung der Raumbelastung durch Substratkonzentration) zurückgeführt werden kann (16) Einfluss des ph-werts Für das optimale Wachstum von Mikroorganismen ist ein für sie spezifischer ph-wert notwendig. Während für die meisten säurebildenden Bakterien (hydrolytische, fermentative und acetogene Bakterien) das Optimum im schwach sauren Bereich liegt, zeigt der größte Teil der methanogenen Bakterien ein Aktivitätsoptimum bei ph-werten zwischen 6,5 und 8,0 (16). Der Acetatabbau wird bei ph-werten unter 6,5 deutlich gehemmt. Bei ph-werten über 8,0 werden die Methanbakterien geschädigt (33). Laut Stadlbauer (1982) sind ph-werte unter 6,2 toxisch für Methanbakterien. Nach Mudrack & Kunst (1991) sollte für die Methanbakterien ein engerer Bereich von ph-werten zwischen 6,8 und 7,2 eingehalten werden, wenn eine ungehemmte Methanbildung erfolgen soll. Für die versäuernden Bakterien ist hingegen eher ein saurer ph-wert günstig. Bei bestimmten Substraten (z. B. Gelatine) ist sogar ein ph-

29 Stand von Wissenschaft und Technik 29 Wert von 5,3 bis 6,3 nötig, da ab einem ph-wert von 7,0 die Versäuerung gehemmt wird. Nach Schulz (1996) und Aschmann et al. (2007) sollte der ph-wert des Gärprozesses im schwach alkalischen Bereich um 7,5 liegen, während nach Kleemann & Meliß (1993) eine optimale Gasausbeute in einem ph-bereich von 6,5 bis 7,2 erreicht wird. Bedingt durch die hohe Pufferkapazität des Substrats kann der ph-wert allerdings erst spät auf Störungen reagieren. Die Pufferkapazität ist ein Mass für die Menge Saüre oder Base, die ein Puffer abfangen kann, so dass der ph-wert auch bei Zugabe oder durch die Produktion saurer oder basich reagierender Stoffe über einen weiten Bereich stabil bleibt. In einem gepufferten System werden die bei der Zugabe von Säuren oder Basen entstehenden Hydronium(H3O + )- oder Hydroxid(OH - )-Ionen abgefangen und neutralisiert, so dass keine wesentlichen ph-verschiebungen entstehen. Daher ist der ph-wert ein ungeeigneter Parameter für die Kontrolle bzw. für das frühzeitige Erkennen von Störungen des anaeroben Prozesses (16). Die bei einer Überlastung oder sonstigen Störung des Prozesses auftretende Zunahme der flüchtigen Fettsäuren wirkt sich erst bei sehr hohen Konzentrationen auf den ph-wert aus, da das Puffersystem die sauer reagierenden Fettsäuren (bzw. H3O + -Ionen) abfängt. Die Pufferkapazität (auch Säurekapazität) wird beim Faulwasser hauptsächlich durch den Gehalt an Ammoniumionen und die mol-gleiche Menge Hydrogencarbonationen bestimmt (33). Nach Aschmann et al. (2007) soll die Alkalinität als Maß für die Pufferkapazität zwischen 1500 und 5000 mg CaCO3 liegen. Nach Roediger et al. (1990) ist der ph-wert als Beurteilungskriterium für den Prozess ungeeignet, sofern er zwischen 6,9 bis 7,5 liegt. Dann ist er im Wesentlichen nur ein Maß für die Ammoniumkonzentration Einfluss der Durchmischung Um die aktive Biomasse kontinuierlich mit ausreichend abbaufähigem Material zu versorgen und um die Stoffwechselprodukte der Organismen abzutransportieren, bedarf es einer guten Durchmischung des Reaktors. Tab. 2.8 zeigt die Gegensätzlichkeiten bezüglich der Anforderungen an die Durchmischung.

30 Stand von Wissenschaft und Technik 30 Bei zu geringer Durchmischung kann das produzierte Faulgas eine Gashülle um die Zelle bilden und damit deren weitere Substrataufnahme verhindern. Man spricht dann von der sog. Diffusionslimitierung (24). Doch auch eine zu starke Durchmischung wirkt negativ auf den Abbauprozess. Die Symbiose der wasserstoffbildenden acetogenen Bakterien und der wasserstoffverbrauchenden methanogenen Organismen sollte nicht gestört werden. Eine zu intensive Durchmischung stört die Bakteriensymbiose (die Organismen werden getrennt), was zu einer Abnahme der Methanbildung führt (15). Daher muss zwischen dem Maß der notwendigen Durchmischungsenergie und dem Durchmischungssystem ein Kompromiss gefunden werden, der den Anforderungen der anaeroben Biozönose weitestgehend gerecht wird (14). Tab. 2.8: Gegensätzlichkeiten bezüglich der Durchmischung von Anaerobreaktoren (34), (23) voll durchmischter Reaktor (starke Durchmischung) - Stofftransport ist optimal (Vermischen des frischen Substrats mit dem bereits faulenden, um eine Impfung des frischen Substrats mit aktiven Bakterien zu gewährleisten, Abtransport des Faulgases) - homogene Situation im Reaktor (Temperatur, Trockenmassekonzentration, Substratverteilung, ph- Wert) - Vermeiden oder Zerstören von Schwimmdecken und Sinkschichten - Verbesserung des Stoffwechsels der Bakterien durch das Austreiben von Gasblasen und Heranführen frischer Nährstoffe - hohe Scherkraftbelastung der Methanbakterien - hoher Energiebedarf - hohe Trockenmassekonzentration im Reaktorablauf, Belastung der externen Trenneinrichtung schwach bzw. diskontinuierlich durchmischter Reaktor (schwache, schonende Durchmischung) Vorteile: Nachteile: - Reduzierung der Scherkraftbelastung auf die Bakterien - geringer Energieaufwand - Reduzierung der Trockenmassekonzentration im Reaktorabfluss - Gefahr der Bildung von Schwimm- und Sinkschichten (insbesondere bei Abwässern aus Massentierhaltungen) - Gefahr von Kurzschlussströmungen und Totzonen - Stofftransport ist nicht optimal Einfluss hemmender und toxischer Substanzen Einige Substanzen im Substrat können negative Auswirkungen auf den anaeroben Abbauprozess haben. Die hemmende oder gar toxische Wirkung auf die Mikroorganismen hängt dabei im Wesentlichen von deren Konzentration ab. Aber

31 Stand von Wissenschaft und Technik 31 auch der ph-wert und die Temperatur im Prozess beeinflussen die negativen Auswirkungen (24). Hierfür empfindlich sind vor allem methanogene Bakterien, die jedoch die wichtigsten Organismen im anaeroben Prozess sind. Ihr geringes Wachstum, die hohe Substratspezifität und die relativ hohe Anfälligkeit gegen Umweltstress machen häufig die Methanogenese zur prozesskritischen Phase. Daher sind Kenntnisse über die Wirkung von hemmenden Substanzen, besonders bei Methanbakterien, von entscheidender Bedeutung für einen optimalen Verlauf der anaeroben Gärung (35). Eine Festlegung strikter Grenzwerte ist schwierig, da sowohl chemische Prozesse toxische Stoffe binden können als auch eine gewisse Adaptation der Mikroorganismen an die Milieubedingungen möglich ist (28). Sauerstoff Fakultativ anaerobe Mikroorganismen wachsen sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Sauerstoff. Zu dieser Bakteriengruppe zählt z. B. ein Großteil der versäuernden Bakterien. Für obligat anaerobe Bakterien, wie z. B. die Methanbakterien, ist die Anwesenheit von Sauerstoff toxisch. Anstelle des Sauerstoffs dienen den Anaerobiern z. B. Nitrat, Sulfat oder Carbonat als Wasserstoffakzeptoren. Der Kontakt mit Sauerstoff kann durch entsprechende konstruktive und betriebstechnische Maßnahmen ausgeschlossen werden (24). Allerdings weist der anaerobe Prozess eine gewisse Toleranz gegenüber kleinen Mengen an Sauerstoff auf. Bis zu 50 Mass.-% der am Gesamtprozess beteiligten Bakterien sind aerob bzw. fakultativ anaerob und verbrauchen somit den mit dem Substrat eingebrachten Sauerstoff innerhalb kürzester Zeit, ohne dass für das Gesamtsystem ein Schaden entstehen würde (16). Die Abwesenheit von Sauerstoff ist nicht unbedingt entscheidend für das Wachstum von Anaerobiern. Viel wichtiger ist das sogenannte Redoxpotential, das ein Maß für die Tendenz ist, von chemischen Verbindungen oder Elementen Elektronen abzugeben oder aufzunehmen. Anaerobe Bakterien können aber nur bei einem tiefen Redoxpotential wachsen. So braucht es für den Abbau von flüchtigen Fettsäuren weniger als -100 mv (36), für die Produktion von CH4 weniger als -330 mv (37). Über Redoxmessungen im Methanreaktor kann man Störungen frühzeitig erkennen (38). Durch ein Ansteigen des Säuregehaltes fällt

32 Stand von Wissenschaft und Technik 32 der ph-wert bzw. steigt der Wasserstoffpartialdruck, und das Redoxpotential verändert sich (15). Schwefel Wie oben beschrieben ist Schwefel für den Aufbau der Bakterienbiomasse lebensnotwendig, kann aber zur Hemmung der Fermentation bei höheren Konzentrationen führen. Der Schwefelgehalt im anaeroben Prozess sollte ungefähr dem des Phosphors entsprechen. Da die Methanbakterien den Schwefel nur in reduzierter Form aufnehmen, ergibt sich eine optimale Konzentration von ca. 10 mg/l gelöster Schwefelwasserstoff (H2S) im Substrat (15). Höhere Konzentrationen können im Prozess hemmend oder toxisch wirken. Schwefelwasserstoff entsteht bei der Vergärung auf zwei verschiedene Arten. Erstens durch den Abbau eiweißhaltiger Stoffe, d. h. der schwefelhaltigen Aminosäuren Cystein und Methionin, und zweitens durch Reduktion anorganischer Schwefelverbindungen (16). Bei der Reduktion konkurrieren infolge erhöhter Sulfatkonzentrationen sulfatreduzierende Bakterien (Desulfurikanten) mit Methanbakterien. Tritt anstelle eines Methanbakteriums ein anderer H2-verbrauchender Partnerorganismus in die Symbiose aus acetogenen und methanogenen Bakterien ein, stehen den Methanbakterien weniger Nahrungsstoffe zur Verfügung, was mit einem Rückgang der Methanbildung verbunden ist. Desulfurikanten sind zudem gegenüber den Methanbakterien energetisch begünstigt, so dass die Desulfurikation bevorzugt vor der Methanisierung erfolgt (24). Die Reduktion hat einen Doppeleffekt: Einerseits bewirkt der Nährstoffentzug durch Desulfurikanten eine Verminderung der Methanbildung. Andererseits wirkt gleichzeitig eine erhöhte Konzentration an entstandenem H2S toxisch auf die Methanbakterien. Das entstehende H2S wird zum Teil mit dem entstehenden Biogas frei. Es kann auch wasserlöslich (undissoziiert und toxisch) in der Flüssigkeit verbleiben oder dissoziiert als schwache Säure zerfallen, wobei Hydrogensulfid und Sulfidionen entstehen (2). Die Toxizität wird auch durch die undissoziierte Form des H2S bestimmt, da mit ansteigendem undissoziierten Anteil die Giftigkeit zunimmt (24). Das chemische Gleichgewicht zwischen der undissoziierten und der dissoziierten Form H2S HS - + H +

33 Stand von Wissenschaft und Technik 33 ist vom ph-wert abhängig. Bei einem ph-wert von 6,0 liegen über 90 Mass.-% des Gesamtsulfides als H2S vor (weniger als 10 Mass.-% als HS - ), bei ph 7,0 ca. 50 Mass.-% (ca. 50 Mass.-% als HS - ) und bei ph 8,0 weniger als 10 Mass.-% als H2S (über 90 Mass.-% als HS - ) (24). Nach Wellinger et al. (1991) sind H2S-Gehalte über 3 mmol/l bzw. Sulfidkonzentrationen über 100 mg/l kritisch, was etwa einem H2S-Anteil im Biogas von 1 Vol.-% entspricht. Nach Scholwin et al. (2009) wirken Schwefelverbindungen wie H2S ab 50 mg/l, S 2 ab 100 mg/l und Na2S ab 160 mg/l hemmend. Adaptierte Populationen von Mikroorganismen können jedoch bis zu 600 mg/l Na2S und 1000 mg/l H2S ertragen. Die Konzentrationsgrenze der Sulfid-Anion S 2 enthaltenden Verbindungen stimmt mit derjenigen von Wellinger et al. (1991) überein. Ebenfalls hemmend können Thiol Brücken wirken, wobei die Hemmschwellen je nach Substanz unteschiedlich sein können. Darüber hinaus kann eine (Sulfid)Fällung in Anwesenheit von gewissen Metallionen erfolgen. Zusätzlich besteht die Gefahr, dass wichtige Spurenelemente (Ni, Co, Mo, Fe) als schwerlösliche Metallsulfide gefällt werden und damit den Mikroorganismen fehlen. Probleme mit zu hohen H2S Konzentrationen können bei der Vergärung von Schweine- und Hühnerexkremente auftreten (16). Wie der Hemmechanismus wirkt, ist nicht genau bekannt, doch können die oben beschriebenen Wirkungen, wie folgt zusammengefasst werden (16): - Höhere H2S -Konzentrationen wirken toxisch für Methanbakterien. - Die Fällung wichtiger Spurenelemente (Ni, Co, Mo, Fe) als schwerlösliche Metallsufide führen zu einem Mangel an diesen Elementen. - Die Sulfatreduktion (Desulfurikation) bildet eine Konzurrenzreaktion zur Methanbildung Der beste Betriebsparamenter zur Überwachung der H2S-Toxizität ist der H2S-Gehalt des Biogases. Treten erhöhte Werte auf, können folgende geeignete Maßnahmen getroffen werden: - Erhöhung des ph-werts im Reaktor - Zugabe von Eisensalzen zur H2S-Fällung als Eisensulfid - Verringerung der Raumbelastung zur Steigerung der CSB-Abbauleistung - Verdünnung mit sulfatfreiem bzw. sulfatarmem Wasser oder Abwasser (39).

34 Stand von Wissenschaft und Technik 34 Oganische Säuren Organische Säuren gelangen entweder mit dem Substrat in den Anaerobreaktor oder werden durch die Abbauprozesse im Reaktor gebildet. Im Stoffwechsel der Methangärung treten die kurzkettigen Fettsäuren (C1 bis C6: Ameisen-, Essig- Propion-, Butter, Valerian- und Capronsäure) als wichtige Stoffwechselprodukte auf (16). Die Konzentrationen und Arten der Fettsäuren wurden als Indikatoren von Stabilität und Aktivität bereits weitgehend untersucht (40). Man spricht von einem stabil verlaufenden Prozess, wenn sich Säureangebot und -abbau im Gleichgewicht befinden. Die Stabilität wird durch die Aktivität der Methanbakterien eingestellt (24). Bei einem Überangebot an Säuren geht daher automatisch die Methanbildung zurück, da die Abbaukapazität der Methanbakterien überschritten wird. Dadurch steigt die Konzentration der flüchtigen organischen Säuren, was wiederum hemmend auf den Stoffwechsel der Essigsäure abbauenden Methanbakterien wirkt (39). Der undissoziierte Anteil der Säuren (d. h. ihre Carboxygruppe COOH) wirkt vornehmlich hemmend oder toxisch. Der prozentuelle Anteil der undissoziierten Säuren an den Gesamtsäuren ist vom ph-wert abhängig. Je niedriger der ph-wert ist, desto höher ist der prozentuelle Anteil der undissoziierten Säuren (39). Nach Roediger et al. (1990) ist aber nicht zu unterscheiden, ob bei niedrigem ph-wert die Protonenkonzentration oder die Konzentration der undissoziierten organischen Säuren die Methanbakterien beeinträchtigt. Nach Kroiss (1986) liegen bei mesophilen Temperaturen und ph-werten von über 7,0 im Substrat über 99 Vol.-% der organischen Säuren dissoziiert und unter 1 Vol.-% undissoziiert vor. Ein niedriger Gehalt der Säuren bedeutet, dass der Abbau der Säuren durch die Methanbakterien gut Schritt mit deren Erzeugung hält (33). Nach Roediger et al. (1990) kann man als Schwellenwert eine Konzentration der Säuren im Gärrest von kleiner 500 mg HAcäq/l (gemessen als Essigsäureäquivalent) ansehen, der bei einem gut intensivierten Prozess üblicherweise bereits bei Verweilzeiten von 10 Tagen und mesophilen Temperaturen unterschritten wird. Man muss aber berücksichtigen, dass bei höheren Feststoffgehalten im Substrat auch etwas höhere Säuregehalte vorkommen können, ohne dass dies eine schlechtere Vergärung bedeutet.

35 Stand von Wissenschaft und Technik 35 Nach Aschmann et al. (2007) soll die Konzentration einzelner flüchtiger Fettsäuren im Bereich von mg/l liegen. Welliger et al. (1991) berichteten, dass im oberen Bereich der Belastbarkeit sich die Säurewerte im Fermenter denen der Frischgülle angleichen, wobei die Konzentration der flüchtigen Säuren rund 3000 bis mg/l beträgt. Sie berichteten ebenso, dass bei einem stabilen anaeroben Prozess die Säuren praktisch vollständig umgesetzt werden, so dass ihre Summe im ausgegorenen Material weniger als 1000 mg/l beträgt. Nach Scholwin et al. (2009) können verzweigte Fettsäuren schon ab 50 mg/l (Iso-Buttersäure) hemmend wirken. Bei längerkettigen Fettsäuren (C12 bzw. C18) wurde eine hemmende Wirkung bereits ab 1,2 mm beobachtet. Das plötzliche Absinken der Gasproduktion und der Anstieg der Säurekonzentration (vor allem Propionat bzw. Propionsäure) sind früh ansprechende Indikatoren, welche den Beginn eines instabilen Gärverlaufes anzeigen. Kritisch wird die Gärung, sobald sich Propionsäure anhäuft. Parallel dazu ist in den meisten Fällen bereits ein Rückgang der Gasproduktion zu beobachten. Zudem kann infolge der vermehrten Produktion oberflächenaktiver Fettsäuren eine zum Teil intensive Schaumentwicklung auftreten (16). Wellinger et al. (1991) haben ebenso berichtet, dass der Zusammenbruch des Prozesses durch einen hohen Säuregehalt (ab etwa mg/l) gekennzeichnet und mit einem steigenden CO2-Anteil im Biogas bei sinkender Gasproduktion und fallendem ph-wert verbunden ist. Obwohl weitere Studien (40), (41) zeigen, dass Essigsaüre mit mehr als 73 Vol.-% des produzierten Methans die Hauptquelle der Methanproduktion ist und damit sie eine wesentliche Leistung hat, kann sie nach Zhou et al. (2011) bei hohen Konzentrationen einen Inhibitor der Methanproduktion darstellen. Sie fanden ebenso, dass der Hemmefekt bei sinkendem Inokulum/Substrat-Verhältnis zunimmt und die Erhöhung der Essigsäurekonzentration dabei auf den Kohlenhydratgehalt des Substrates zurückgeführt werden kann. Zusätzlich behaupteten Mizuno et al. (1981) zit. nach Zhou et al. (2011), dass eine steigende Kohlenhydratkonzentration deutlich die produzierte Menge an Wasserstoff und Acetat erhöht. Mawson et al. (1991) zit. nach Zhou et al. (2011) stellten fest, dass höhere Mengen von 17 mm (1020,88 mg/l) Essigsäure die Methanproduktion inhibieren.

36 Stand von Wissenschaft und Technik 36 Folgende Maßnahmen wurden von Kroiss (1986) vorgeschlagen, um einer bereits vorhandenen oder sich ankündigenden Hemmung der Methanbildung durch eine erhöhte Saurekonzentration entgegenzuwirken: - Rücknahme der CSB-Belastung (Säurebelastung) des Reaktors - Erhöhung des ph-wertes durch Zugabe von Neutralisationsmittel (Ca(OH)2, Na2CO3, NaOH) - Zugabe von Verdünnungswasser zur Verringerung der Säurekonzentration. Nitrat- und Ammoniumstickstoff und Ammoniak Nitratreiche Substrate können wegen des gebundenen Sauerstoffs zur Hemmung der Methanbildung führen. Aus diesem Grund ist zunächst die Abspaltung des im Nitrat gebundenen Sauerstoffs erforderlich (z. B. durch Denitrifikation) oder eine zweistufige Betriebsführung einzusetzen, da damit die Mengen des gebundenen Sauerstoffs direkt in der ersten Stufe verbraucht werden und somit die Methanstufe nicht negativ beeinflusst wird. Eine Hemmung der hydrolysierenden bzw. versäuernden Bakterien der ersten Stufe ist nicht anzunehmen (24). Ammoniumion (NH4 + ) (auch als Ammonium bezeichnet) und freies Ammoniak (NH3) sind die zwei Hauptformen von anorganischen Ammoniak-Stickstoff in wässriger Lösung (42). Der Ammonium-Stickstoff (NH4 + -N) ist ein sehr häufiges metabolisches Endprodukt der anaeroben Vergärung von proteinhaltigen Substraten (wie z. B. Gülle, angesiedelter Klärschlamm, Abwasser aus der Kartoffelstärkeindustrie, usw.) und besitzt eine relativ hohe potentielle Toxizität für methanogene Bakterien (35). Er wird entweder in g NH4 + -N/l oder in mm (1 g NH4 + -N/l = 71,4 mm NH4 + -N) gemessen. Das freie Ammoniak wird durch den Abbau stickstoffhaltiger Verbindungen, vor allem von Proteinen und Harnstoff, freigesetzt und dient den Bakterien als Stickstoffquelle (16). Bei der Analyse wird üblicherweise die Summe, NH4 + plus NH3, als Gesamtammonium oder Gesamtammonium-Sticktoff (auch als Gesamtammoniak oder Gesamtammoniak-Stickstoff bezeichnet) in g N/l or mmol N/l (auch in mm N) bestimmt (43), (44), (45). Hohe Ammoniumkonzentrationen im Substrat können erhebliche Toxizitätsprobleme beim anaeroben Abbauprozess verursachen (24). Von den vier

37 Stand von Wissenschaft und Technik 37 Mikroorganismenarten der vier Phasen des anaeroben Prozesses sind die Methanbakterien diejenigen, die am wenigsten tolerant gegenüber dem Gesamtammonium-Stickstoff sind (46). Bezüglich der Methanbakterienarten liegen widersprüchliche Informationen über die Empfindlicheit der acetotrophenen (Acetat und Essigsäure verbrauchende Bakterien) und der hydrogenotrophenen (Wasserstoff verbrauchende Bakterien) Methanogenen vor. Während einige Autoren (35), (47), (48), (49) auf Basis des Vergleiches von Methanproduktion und Wachstumrate darauf hingewiesen haben, dass die hemmende Wirkung im Allgemeinen stärker für die Acetotrophen als für die Hydrogenotrophen ist, haben andere Autoren (50), (51) einen relativ höheren Widerstand zum Gesamtammoniak-Stickstoff von den Acetat verbrauchenden als von den Wasserstoff verbrauchenden Methanogenen beobachtet. In Abhängigkeit von ph-wert und Temperatur kann Ammonium und das damit in Gleichgewicht stehende Ammoniak zu einem wesentlichen Hemmfaktor für die methanogenen Mikroorganismen werden (2). Die versäuernden Mikroorganismen werden in ihren Abbaureaktionen hingegen (wie beim Sauerstoff und Nitrat) kaum beeinträchtigt (52). Mit Wasser bildet Ammoniak das von Temperatur und ph-wert o. g. abhängige Gleichgewicht (16). Für die Hemmwirkung ist vornehmlich der undissoziierte (unionisierte) Anteil, also das nicht in Ionen zerfallene freie Ammoniak, verantwortlich. Das chemische Gleichgewicht NH4 + NH3 + H + ist (wie beim H2S und bei den organischen Säuren) stark vom ph-wert abhängig (24). Eine Erhöhung von ph-wert und/oder Temperatur verschiebt das Gleichgewicht zugunsten des freien Ammoniaks (16). Da mit zunehmender Ammoniumkonzentration der ph-wert steigt, wirkt sich dies zunächst stabilisierend auf den Anaerobprozess aus. Bei einem weiteren Anstieg der Ammoniumkonzentration nimmt, in Verbindung mit der daran gekoppelten ph-wert- Anhebung, die Toxizitätsgefahr von Ammoniak durch den absoluten und den prozentualen NH3-Anstieg verstärkt zu. Die Folge ist eine Hemmung der Essigsäure abbauenden Methanbakterien und eine Zunahme der Säurekonzentration. Nach einer ersten Erhöhung aufgrund der Ammoniumzunahme sinkt dann der ph-wert wieder. Das NH4 + /NH3-Verhältnis verändert sich zugunsten des dissoziierten NH4 + -N

38 Stand von Wissenschaft und Technik 38 Anteils. Das bedeutet, dass eine kurzfristige Toxizität des Ammoniaks durch selbständige Regulation wieder normalisiert wird (24). Nach Koster (1986) kann ein hoher ph-wert, der toxische Konzentrationen des unionisierten freien Ammoniaks während des Anpassungszeitraums der Bakterien verursacht, zu einer verringerten maximalen spezifischen methanogenen Aktivität der adaptierten Biomasse führen, was eine Anhäufung von Fettsäuren und eine Absenkung des ph-wertes verursachen kann (ph-wert < 6 ist fatal für die Methanbakterien). Ein niedriger ph-wert während des Anpassungszeitraums führt auch zu einem verzögerten Abbau von Propionsäure, wahrscheinlich aufgrund der Hemmung der Wasserstoff verbrauchenden methanogenen Bakterien durch undissoziierte flüchtige Fettsäuren, aber dieser führt nicht zu einer verminderten maximalen spezifischen methanogenen Aktivität in adaptierter Biomasse. Die Wechselwirkung zwischen freiem NH3, Fettsäuren und ph-wert kann zu einem "inhibited steady state" führen, einem Zustand, in dem der Prozess stabil ist, aber mit einer geringeren Methanausbeute (47), (53). Die verschiedenen Parameter, die zu einer Hemmung durch Gesamtammoniak- Stickstoff im anaeroben Prozess führen können, können dann wie folgt zusammengefasst werden: Gesamtammoniak-Sticksoffkonzentration, ph-wert, Temperatur, Adaptation der Bakterien, Anwesenheit von anderen Ionen und nach Zhou et al. (2011) kann das Inokulum/Substrat-Verhältnis auch ein Einflussfaktor sein. Ein breites und teilweise widersprüchliches Intervall von hemmenden Gesamtammoniak-Konzentrationen ist in der Literatur berichtet worden (54), (55), (45), (50), (56), (57), (43), (47), (58), (46), (49), (59), (60), (61). Allerdings wird die inhibitorische Gesamtammoniakkonzentration, die 50 % Reduktion der Methanproduktion verursacht, im Intervall von 1,7 bis 14,0 g N/l zusammengefasst. Der signifikante Unterschied ist auf die Unterschiede in den verwendeten Substraten und Inokula, Umgebungsbedingungen (Temperatur und ph-wert) und Adaptation der Methanogenen zurückzuführen (54), (56), (58). McCarty (1964) zit. nach Hashimoto (1983) berichtete, dass die Hemmung bei einer Gesamtammoniak-Stickstoffkonzentration (NH4 + plus NH3) zwischen 1,5 und 3,0 g N/l beim ph-wert über 7,4 bis 7,6 und die Toxizität bei Konzentrationen über

39 Stand von Wissenschaft und Technik 39 3,0 g N/l eintreten. Nach Hashimoto (1986) begann eine Hemmung bei einer Gesamtammoniak-Stickstoffkonzentration von etwa 2,5 g N/l für thermophile und mesophile Fermentationen, die nicht an hohen Gesamtammoniakkonzentrationen zuvor adaptiert worden waren und bei etwa 4 g N/l für thermophile Fermentationen, die an Gesamtammoniakkonzentrationen zwischen 1,4 und 3,3 g N/l zuvor angepasst worden waren. Beginnend bei einer Gesamtammoniakonzentration von ungefähr 700 mg N/l verringerte sich nach Koster und Lettinga (1984) die maximale spezifische Aktivität von Methanbakterien bei zunehmender Ammoniakkonzentrationen. Nach diesen Autoren und nach Van Velsen (1981) hört die Methanogenese bei nicht adaptiertem methanogenen Bakterienschlamm auf, wenn die Gesamtammoniak-Konzentration auf etwa 1,7-2,0 mg N/l angehoben wurde. In weiteren Vergärungsversuchen mit Kartoffelsaft mit granulärem Schlamm beobachteten Koster und Lettinga (1988), dass die adaptierte Methanogenese noch bei 11,8-16 g Gesamtammoniak-Stickstoff pro Liter laufen konnte. Ab 16 g/l wurde dann die Methanogenese Null. Beim Rückgang der Konzentration des Gesamtammoniaks konnten diese Autoren aufgrund eines guten Verhältnisses zwischen der Gesamtammoniakkonzentration und der methanogenen Aktivität noch bestätigen, dass die Toxizität des Gesamtammoniaks reversibel ist. Bei abnehmendem Inokulum/Substrat-Verhältnis wurden von Zhou et al. (2011) höhere Gesamtammoniakkonzentrationen festgestellt. Diese Tatsache war vorhersehbar, da es allgemein bekannt ist, dass einige organische Stickstoffverbindungen (hauptsächlich Eiweiß und Harnstoff) zu Gesamtammoniak bei der anaeroben Vergärung umgewandelt werden. Nach Kroiss (1986) sowie Koster und Lettinga (1983), beide Referenze zit. nach Dauber (1993), wurden zulässige NH4 + -N-Konzentrationen in Abhängigkeit von ph- Wert und Temperatur festgestellt. Bei konstanter Temperatur und abnehmendem ph- Wert sowie bei konstantem ph-wert und abnehmender Temperatur nehmen die Grenzen der kritischen NH4 + -N-Konzentrationen im anaeroben Prozess zu. Bei einer Temperatur von 38 ⁰C liegt z. B. die untere Konzentrationsgrenze ohne Hemmung bei ca. 0,5 g NH4 + -N /l, wenn der ph-wert 8,0 beträgt, und die obere Grenze bei ca. 4 g NH4 + -N/l, wenn der ph-wert 7,0 beträgt. Bei einer niedrigen Temperatur (30 ⁰C) liegt aber die untere Grenze ohne Hemmung bei ca. 1 g NH4 + -N/l, wenn der ph-wert

40 Stand von Wissenschaft und Technik 40 8,0 beträgt, und die obere Grenze bei ca. 6 g NH4 + -N/l, wenn der ph-wert 7,0 beträgt. Durch einen Versuch bei 30±1 ⁰C mit methanogenem Schlamm hat Koster (1986) beobachtet, dass bei zunehmendem Ammonium-Stickstoff die Methanogenese bei 1,9-2 g NH4 + -N/l fast auf Nulll abgefallen war und nach der Adaptation der Methanbakterien die Methanstufe erneut und sogar bei noch höheren NH4 + -N- Konzentrationen aktiv war. Eine kinetische Analyse der Methanproduktion während des Anpassungsprozesses der Methanbakterien zeigte, dass die Anpassung das Ergebnis einer metabolischen Veränderung der bereits vorhandenen methanogenen Bakterien anstatt des Wachstums neuer Bakterien war. Nach Scholwin et al. (2009) sind NH4 + -N-Konzentrationen zwischen 2,7 und 10,0 g/l hemmend. Adaptierte Methanogene können aber bei relativ niedrigem ph-wert bis zu 30 g/l ertragen. Nach den Versuchen von Hendriksen und Ahring (1991) begann eine Hemmung von verschiedenen thermophilen H2-verbrauchenden Methanbakterien ab 3,0-4,0 g NH4 + -N/l ( mm), und die Methanogenese sank bei 6,0 g NH4 + -N/l (428 mm) auf 50 %. Des Weiteren waren bei fast 9,0 g NH4 + -N/l (643 mm) alle verwendeten H2- verbrauchenden Methanbakterien sehr instabil oder ganz gehemmt. Kroeker et al. (1979) und De Baere et al. (1984) beobachteten, dass freies Ammoniak (anstatt des Ammoniumions) die Hauptursache für die Hemmung der Methanogenese zu sein scheint, da es frei membran-permeabel ist. Das hydrophobe Ammoniakmolekül kann passiv in die Zelle diffundieren und dadurch Protonen- Unausgeglichenheit und/oder Kaliummangel verursachen. Van Velsen (1981) sowie Stevens und Schulte (1979) zit. nach Hashimoto (1983) haben ebenso die niedrigere Gasproduktion auf die Hemmung durch freien Ammoniak zurückgeführt. Koster und Koomen (1988) haben danach bestätigt, dass NH3 ein stärkerer Inhibitor als NH4 + ist. Da die freie Ammoniakkonzentration zunimmt, wenn Temperatur und ph-wert zunehmen, wird dann erwartet, dass mehr freies Ammoniak bei höheren Temperaturen vorliegen würde. Van Velsen (1981) hat bei einer Gesamtammoniakkonzentration von 3,5 g N/l und einem ph-wert von 8 eine freie Ammoniakkonzentration von 0,97 g N/l (28 Mass.-%) bei 55 ⁰C im Vergleich zu

41 Stand von Wissenschaft und Technik 41 0,26 g N/l (7,43 Mass.-%) bei 35 ⁰C beobachtet. Daher ist er zu der Aussage gekommen, dass die Hemmwirkung von Gesamtammoniak-Stickstoff erheblich größer unter thermophilen als unter mesophilen Temperaturen ist. Nach Angelidaki und Ahring (1994) führt eine erhöhte Prozesstemperatur im Allgemeinen zu einem positiven Effekt auf die Stoffwechselrate der Bakterien, aber andererseits zu einer höheren Konzentration an freiem Ammoniak, was bei hohen Gesamtammoniakkonzentrationen einen negativen Effekt auf den Prozess haben kann. Aus der Erhöhung der Ammoniak-Hemmung mit der Temperatur würden in der Regel höhere Fettsäurenkonzentrationen bei thermophilen als bei mesophilen Vergärungstemperaturen folgen. Zeeman et al. (1985) hatten ebenso höhere Fettsäurenkonzentrationen bei thermophilen Vergärungstemperaturen im Vergleich zu den mesophilen beobachtet. Bei ihren Versuchen beobachteten sie, dass höhere Gesamtammoniakkonzentrationen eine Reduktion der maximalen tolerierbaren Temperatur zur Folge hatten. Niedrige Prozessleistung wurde beobachtet, wenn aus der Kombination Temperatur-Gesamtammoniak eine berechnete Konzentration von ionisiertem freien Ammoniak höher als ca. 0,7 g N/l bei einer Verweilzeit von 15 Tagen erfolgte. Wenn die Gesamtammoniakbelastung noch hoch war, führte eine Absenkung der Temperatur unter 55 ⁰C zu einer Zunahme der Biogasausbeute und einer besseren Prozessstabilität, welche durch eine Absenkung der Konzentration von flüchtigen Fettsäuren im Abfluss gekennzeichnet wurde. McCarty und McKinney (1961) berichteten, dass eine Gesamtammoniaktoxizität bei freiem Ammoniakkonzentration von 150 mg/l auftritt. Nach Van Velsen (1981) muss ab einer NH3/NH4 + Gesamtkonzentration von ca mg/l mit einer beginnenden Hemmung gerechnet werden. Durch gute Adaptation ist es jedoch möglich, eine Bakterienflora zu erhalten, die selbst bei Ammoniakkonzentrationen von 5000 mg/l zufriedenstellend arbeitet. Allerdings wird es nach Liu und Sung (2002) zit. nach Chen (2008) allgemein angenommen, dass Ammoniak-Konzentrationen unter 200 mg/l positiv für den anaeroben Prozess sind, da Stickstoff ein wichtiger Nährstoff für die anaeroben Mikroorganismen ist. Nach Scholwin et al. (2009) ist auch Ammoniak ab150 mg/l hemmend. Nach Wellinger et al. (1991) kommen als Gegenmaßnahmen bei einer Hemmung eine Verdünnung des Substrats sowie eine Senkung von Temperatur und ph-wert in Frage.

42 Stand von Wissenschaft und Technik 42 McCarty und McKinney (1961) sowie weitere Autoren (55), (43) haben bestätigt, dass bestimmte Ionen wie Ca 2+, Na + und Mg 2+ sich antagonistisch zur Gesamtammoniakhemmung erwiesen haben. Das ist ein Phänomen, bei dem die Toxizität eines Ions durch die Gegenwart von anderem(n) Ion(en) verringert wird. Nach Krylova et al. (1997) kann das Kaliumion K + auch antagonistisch zur Gesammoniakhemmung wirken. Bei ihren Versuchen haben sie auch beobachtet, dass die Hemmung mit mehr als 50 g/l NH4 + Cl (13 g NH4 + -N) irreversibel war, da diese mit weiterer Zugabe von Phosphorit (darin K +, Ca 2+ und Mg 2+ ) nicht eliminiert werden konnte (59). Andere Autoren (62) haben Zeolith (darin verschiedene Mineralien) gegen die Ammoniakhemmung verwendet. Der Zeolith wirkte in gewissem Maße der hemmenden Wirkung von Ammoniak entgegen. Nach Scholwin et al. (2009) kann Ammonium je nach Organismen eine Wechselwirkung mit Ca 2+ oder Na + haben. Schwermetalle Schwermetalle wirken nicht grundsätzlich toxisch, sondern können in geringen Konzentrationen auch als wichtige Nährstoffe stimulierend auf die Mikroorganismenaktivität einwirken. Die Grenzen zwischen Stimulation, Hemmung und Toxizität sind je nach Metallart und konzentration sowie den chemischen und physikalischen Milieubedingungen (ph-wert und Redoxpotential) stark differierend. Je nach Herkunft schwanken die Konzentrationen in den Ausgangssubstraten. Auch Schlämme aus der Behandlung von industriellen und gewerblichen Abwässern können mit verschiedenen Schwermetallen belastet sein (24). Bei organischen Abfällen kommen diese aufgrund externer Einflüsse wie Medikamente, Antibiotika, Nahrungsmittel usw. vor. In Tab. 2.9 sind, soweit Daten vorliegen, die Gehalte an Schwermetallen in verschiedenen Ausgangssubstraten zusammengefasst (13). Sterritt und Lester (1990) zeigten, dass sich Schwermetalle in toxischen Konzentrationen anreichern können, da sie im Gegensatz zu vielen anderen toxischen Substanzen biologisch nicht abbaubar sind. Nach Valle und Ulner (1972) ist die toxische Wirkung durch eine Störung der Enzymfunktion und struktur gekennzeichnet. Diese entstehen durch die Bindung der Metalle mit Thiolen und anderen Gruppen von Proteinmolekülen oder durch

43 Stand von Wissenschaft und Technik 43 Ersetzen der natürlich vorkommenden Metalle in den prothetischen Gruppen des Enzyms. Nach Zayed und Winter (2000) wird allgemein angenommen, dass Acidogene widerstandsfähiger gegen Schwermetalltoxizität sind als Methanogene. Tab. 2.9: Schwermetallgehalte in Ausgangssubstraten (mg/kg TM) (13) Ausgangssubstrat Cadmium (Cd) Chrom (Cr) Kupfer (Cu) Quecksilber (Hg) Nickel (Ni) Blei (Pb) Zink (Zn) Landwirtschaftliche Einsatzsubstrate Rindergülle 0,3-0, Rindergülle (n = 35) 1) 0,1-0, ,005-0, Schweinegülle (n = 25) 1) 0,1-0, ,005-0, Schweinegülle Mast (n = 132) 2) 0,4 (0,2-0,6) 12 (4-27) 337 ( ) 0,03 (0,01-0,05) 13 (7-22) 3,3 (2-6) 1124 ( ) Schweinegülle Zucht (n = 115) 2) 0,4 (0,2-0,7) 12 (4-23) 517 ( ) 0,03 (0.01-0,06) 12 (5-24) 4,7 (2-9) 1390 ( ) Hühnergülle 0,2-0,3 <1-7, , Rindermist 0, Schweinemist 0, ,2 Hühnermist +) 1,6 26,9 992,0 0,2 38,1 11, ,3 Kartoffelkraut , Rübenblatt 0,2 < ,5 28 Getreidestroh 0, Maisstroh 0,1-0, Reststoffe aus der Industrie Apfeltrester 0,3 1,6 7, ,4 6,7 Obsttrester 0,11 0,06,12 7,8-30 0, , Rebentrester 0,03-0, ,01 2, Biertreber 0,2 0,5 34,2 0,04 2,5 0,4 88 Traubenkernmehl 0,03 6,3 52,2-3,4 1,8 16,9 Filtrationskieselgur (Bier) 0,3-0,5 7,4-16 2,8-4,9 0, ,4 0,1-3, Gemüseabfälle 0,3-0,8 1-18,5 4,4-15 0,007 2,2-7,8 1,0-4, Ölsaatenschrot 0,1-0,3 0,5-2 5,-44 0,005 0,8-6 0, Rapsschrot 0,09 0,6 5,3-5,0 0,9 65,7 Rizinusschrot 0,05-0,2 1,1-2, ,02 1,3-5,5 1-1, Vinasse 0,3 1,22 2,4 0,02 5,5 2,2 22 Einsatzstoffe nach der Nebenprodukte-VO Blutmehl 0,1 4 28,3-0,2 2,5 36 Panseninhalt (unbehandelt) Panseninhalt (n = 2) <0,2 2,0-3,2 14 0,02-0,03 1,5-1,6 <1-1,2 83 Speisereste, Großküchen (n = 10) 0,04-0,1 0,5-19 3,7-23 0,03 0,4-7,8 1,2-2, Speiseabfälle (n = 2) <0,2 1,7-2,5 8,7-9,8 0,02-0,09 <1-1,2 <1,3-2, Kommunale und gewerbliche Reststoffe Bioabfall 0,3-0, , Bioabfall (n = 10) <1-0, ,7-0, Grünschnitt 0,7-2, Grünguthäcksel 0,2 (0,1-0,3) 8 (3-18) 10 (16-18) 0,03 (0,01-0,07) 4 (1-10) 9,6 (3,5-27) 54 (36-92) Flotatschlamm Fettabscheiderinhalt 0,03-0,5 2,3-30 4,8-70 0,02-0,6 0,7-40,5 1,5-27, ) Untersuchungen BDF-Programm, 1999 Bayer. Landesanstalt für Landwirtschaft (5 %, 95 % Fraktilen) (Müller, 2005) 2 ) Untersuchungen Güllemonitoring Forschungsprojekt LfL TUM LS Tierhygiene Überprüfung und Neubewertung von Wirtschaftsdüngern (Daten in ( ) 5 %, 95 % Fraktilen) (Müller, 2006) + ) Ergebnisse bezogen auf 30 % ots Die wesentlichen Faktoren, die die Schwermetallhemmung kontrollieren, sind nach Chen et al. (2008) die chemische Form der Schwermetalle, ihre Konzentration und die antagonistischen oder synergistischen Effekte zwischen diesen. Bezogen auf die chemische Form können die Schwermetalle aufgrund der Komplexität der anaeroben Vergärung in viele chemisch-physikalische Prozesse

44 Stand von Wissenschaft und Technik 44 einbezogen werden, wie z. B. die Fällung als Sulfid (außer Cr), als Carbonat oder als Hydroxide (63); Sorption an festen Fraktionen (entweder an der Biomasse oder an einem inerten Partikelmaterial) (64) und Bildung von Komplexen in einer Lösung mit Zwischenprodukten oder mit aus der Fermentation anderen produzierten Verbindungen (65), (66), (67), (68). In der Fachliteratur sind sehr unterschiedliche Angaben über die schädlichen Konzentrationen von Schwermetallen auf den anaeroben Abbauprozess zu finden. In Tab sind Angaben verschiedener Autoren zusammengefasst. Tab. 2.10: Schädliche Konzentrationen von Schwermetallen Konzentrationen in mg/l Schwermetall Hemmung 1 Toxizität 1 Hemmung 2 Toxizität 2 Hemmung 3 Toxizität 3 Kupfer (Cu) Cadmium (Cd) Zink (Zn) ca Nickel (Ni) Blei (Pb) Chrom III (Cr) Chrom VI (Cr) ca Nach Köhler (1966), 2 Nach Scherber und Steiner (1982), 3 Nach Konzeli-Katsiri (1986); alle Referenzen zit. nach Dauber (1993) Die große Variationsbreite der berichteten Konzentrationen (von bis zu mehreren hundert mg/l) sowohl zur Hemmung als auch zur relativen Toxizität der Schwermetalle werden nicht nur durch die Milieubedingungen, sondern auch durch die Unterschiede in den Substraten und Bakteriengattungen erklärt (63), (65), (69), (70), (71), (72). Die relative Empfindlichkeit der Acidogenese und der Methanogenese gegenüber Schwermetallen hängt von der betreffenden Säure (Produktion bzw. Abbau) ab. Bei der Essigsäuresynthese gilt z. B. Cu > Zn > Cr > Cd > Pb > Ni mit Cu als das am toxischsten und Ni als das am wenigsten toxische Schwermetall für Essigsäure produzierende Organismen. Hingegen gilt bei der Produktion von n-buttersäure Cu > Zn > Cr > Cd > Ni > Pb mit Cu als das am toxischsten und Pb als das am wenigsten toxische Schwermetall für n-buttersäure produzierenden Organismen (73). Beim Abbau von Fettsäuren in der Methanogenese gilt beim Essigsäure- und n- Buttersäureabbau z. B. Cd > Cu > Cr > Zn > Pb > Ni und beim Propionsäureabbau Cd > Cu > = Zn = Cr > Pb > Ni (74).

45 Stand von Wissenschaft und Technik 45 Die Störung des anaeroben Abbauprozesses durch überhöhte Metallkonzentrationen äußert sich durch einen Rückgang der Gasproduktion. Mit der Inaktivierung bzw. Vergiftung der Methanbakterien geht ein Anstieg der Konzentration an flüchtigen organischen Säuren einher, was wiederum zu einer ph-wert-absenkung führt (24). Die Schwermetalle können eine synergistische bzw. antagonistische Wirkung auf die anaerobe Gärung haben. Nach Lin (1992, 1993) bilden viele Schwermetalle synergistiche Mischungen wie Cr-Cd, Cr-Pb, Cr-Cd-Pb und Zn-Cu-Ni, während nur wenige eine antagonistische Wirkung haben. Nach Babich und Stotzky (1983) wirkt Ni synergistisch in den Mischungen Ni-Cu, Ni-Mo-Co und Ni-Hg und antagonistisch in Ni-Cd, Ni-Zn. Ahring und Westermann (1985) bestätigten, dass Ni die Toxizität von Cd und Cu verringert. Weitere wesentliche Methoden zur Minderung der Schwermetalltoxizität sind Fällung, Sorption und Chelatisierung durch organische und anorganische Liganden (75). Sulfid ist in letzten Jahren der wichtigste Stoff zur Fällung von Schwermetallen geworden (42). Nach Anderson et al. (1983) zit. nach Chen et al. (2008) sollten allerdings Sulfide mit Vorsicht verwendet werden, da überschüssige Mengen wiederum ein wichtiger Hemmstoff für Methanogene sein können. Ähnlich kann die Sorption von Schwermetallen an Aktivkohle, Kaolin, Bentonit, Kieselgur und Abfallstoffen wie Kompost und Abfall aus Cellulosefleisch ebenfalls die Hemmung vermindern (76) Beteiligte obligat und fakultativ anaerobe Mikroorganismen Am anaeroben Abbauprozess sind drei unterschiedliche Bakteriengruppen beteiliegt. In Tab sind diese nach den verschiedenen Abbaustufen zusammengefasst. Der erste Abbauschritt wird von hydrolytischen Bakterien durchgeführt. Sie bilden eine Mischkultur aus vorwiegend obligat, aber auch fakultativ anaeroben Bakterien. Es können Konzentrationen von bis zu Bakterien/ml (bei kommunalem Faulschlamm) vorliegen (77). Zu diesen gehören Kohlenhydrat abbauende Bakterien (cellulolytische, hemicellulolytische, pectinolytische und aminolytische), Eiweiß abbauende Bakterien (proteolytische), Fett abbauende Bakterien (lipolytische) sowie Bakterien, die in der Lage sind, Enzyme zum Aufschluss schwer abbaubarer Stoffe zu synthetisieren und damit den Abbau dieser Stoffe zu ermöglichen.

46 Stand von Wissenschaft und Technik 46 Tab. 2.11: Unterteilung der Bakteriengruppen (14), (78), (79) GENUS SPEZIES GENUS SPEZIES GENUS SPEZIES Cellulolytische (Cellulose- u. Stärkeabbau) Acetobacterium A. woodii Ordnung: Methanobacteriales Cillobacterium C. cellulosolvens Acetohalobium A. arabaticum Familie: Methanobacteriaceae Clostridium C. thermocellum Bacillus Bacillus sp. Methanobacterium M. fomicicum* C. loch headii Bacteroides B. ruminocola M. bryantii Butyrivibrio B. fibrisolvens* Clostridium C. acetium Methanothermobacter M. thermoautotrophicus (M. thermoformicicum) Bacteroides (Fibrobacter) B. succinogenes* Desulfotomaculum Desulfotomaculum sp. Methanobrevibacter M. ruminantium* Eubacterium E. cellulosolvens* Desulfhovibrio Desulfhovibrio sp. M. arboriphilus Ruminococcus R. albus* Lactobacillus L. vitulinus (Zuckerfermentierer)* M. smithii R. flavefaciens (auch Glucoseabbau)* L. ruminus (Zuckerfermentierer)* Methanosphaera M. stadtmanae Hemicellulolytische (Hemicelluloseabbau) Haloincula H. saccharolytica Ordnung: Methanococcales Butyrivibrio B. fibrisolvens* Megasphaera M. elsdenii (Amoniakhersteller)* Familie: Methanococcaceae Bacteroides B. ruminicola* Moorella M. glycinii Methanococcus M. vannielii Lachnospira L. multiparus Propionibacterium Propionibacterium sp. M. voltae Ruminococcus Ruminococcus sp.* Selenomonas S. ruminantium* M. maripaludis Pectinolytische (Pectinabbau) S. lactilytica Ordnung: Methanomicrobiales Butyrivibrio B. fibrisolvens* Synthrophobacter S. wolonii (Propionsäureabbau) Familie: Methanomicrobiaceae Bacteroides B. ruminicola* Treponema T. briyantii (Zuckerfermentierer)* Methanoculleus M. thermophilus Lachnospira L. multiparus* Veillonella V. gazogenes M. marisnigri Streptococcus S. bovis* V. alacalescens Methanomicrobium M. mobile* Succinivibrio S. dextrinosolvens* Methanogenium M. cariaci Treponema Treponema sp.* Familie: Methanospirillaceae Amylolytische (Stärkeabbau) Methanospirillum M. hungatei Clostridium C. butyricum C. aminophilum Ordnung: Methanosarcinales Familie: Methanosarcinaceae Bacillus Bacillus sp. Methanosarcina M. barkeri* Bacteriodes B. ruminicola (Amoniakhersteller)* M. thermophila B. amylophilus* Familie: Methanosaetaceae Butyrivibrio B. fibrisolvens Methanosaeta M. concilii (Methanothrix soehngenii) Lachnospira L. multiparus M. harundinacea Mikrococcus Mikrococcus sp. M. thermophila Pseudomonas Pseudomonas sp. Prevotella P. ruminicola Ruminobacter R. amylophilus* Streptococcus S. bovis* Succinivibrio S. dextrinosolvens* Succinomonas S. amylolytica Proteolytische Clostridium C. sporogenes C. sticklandii* Bacillus B. licheniformis Bacteroides B. amylophilus* B. ruminicola (Amoniakhersteller)* Butyvibrio B. fibrisolvens* Bifidobacterium Bifidobacterium sp. Eubacterium rumiantium E. ruminantium* Peptococcus P. anaerobus, Prevotell P. ruminicola* Ruminobacter R. amylophilus* Staphylococcus Staphylococcus sp. Streptococcus S. bovis* Wolinella W. succinogenes* Lipolytische Anaerovibrio A. lypolitica* Alcaligenes Alcaligenes sp. Bacillus Bacillus sp. Butiryvibrio Butiryvibrio sp.* Micrococcus Micrococcus sp. Pseudomonas Pseudomonas Selemonas S. ruminantium (Vitamin- u. Amoniakhersteller)* von schwer abbaubaren Stoffen Clostridium C. butyricum C. pasteurianum Citrobacter C. freundii Micrococcus Aerobacter Alcaligenes Flavobacterium Pseudomonas * Bakterien in Pansensaft Hydrolytische Bakterien Fermentative und acetogene Bakterien Methanbakterien Zu den acetogenen Bakterien gehören sowohl obligat (wie Synthrophobacter wolii) als auch fakultativ anaerobe (wie Desulfovibrio) acetogene Organismen. Diese sind H2-Produzenten und können nur in Symbiose mit Methanbakterien (H2-Verbraucher) leben. Alle bisher bekannten acetogenen Spezies haben eine sehr lange Generationszeit (z. B. bei Buttersäure-Verwerter 84 h) (14). Die methanogenen Bakterien vollziehen den letzten Stoffwechselschritt von Acetat, H2 und CO2 zu CH4. Sie wurden in drei Ordnungsgruppen und vier Familien

47 Stand von Wissenschaft und Technik 47 gegliedert. Sie sind morphologisch sehr unterschiedlich (Stäbchen, Kokken, Spirillen und Sarcinen) und zählen (in Reinkultur) zu den sauerstoffempfindlichsten Keimen, die bisher bekannt sind. Zum Wachstum wird ein sehr niedriges Redoxpotential von mindestens -330 mv benötigt. Sie können in Gemeinschaften (Biozönosen) in Form von Pellets oder Flocken (stäbchen- oder kokkenförmige Methanbakterien) in anaeroben Schlämmen leben. Verschiedene Monokulturen (wie Methanosarcinen) sowie stäbchen- und fadenförmig freischwebende Methanbakterien variieren ebenso je nach Schlammart (14). 2.2 Anaerob-biologische Abbaubarkeit der organischen Substanz zur Bestimmung des Biogaspotentials Die biologische Abbaubarkeit bezeichnet die Eigenschaft eines Stoffes, in eine einfachere chemische Struktur durch mikrobiellen Abbau umgesetzt zu werden (80). Die anaerobe Behandlung organischer Abfälle wird häufig in Frage gestellt, da viele Inhaltsstoffe nicht oder nur schwer biologisch abbaubar sind. Einige Abfälle können Stoffe enthalten, die toxisch für Methanbakterien und weitere Mikroorganismen wirken. In der Vergangenheit war es schwierig, die Ursachen von Prozesstörungen aufgrund der Komplexität der anaerob zu behandelnden Stoffe zu identifizieren. Andere Schwierigkeiten verursachen auch die Bestimmung einer Vielzahl potentieller Inhibitoren sowie die bislang unbekannten Wechselwirkungen zwischen den Inhibitoren, anderen Substratbestandteilen und den Methanbakterien. Darüber hinaus war es schwer zu unterscheinden, welche Betriebsstörungen durch toxische Stoffe oder durch technische Bemessungs- oder Betriebsfehler verursacht wurden. Die anaerobe Abbaubarkeit eines Stoffes zur Überprüfung seiner Umweltverträglichkeit ist ebenfalls wichtig, weil die meisten hergestellten Chemikalien zu anoxischen Lebensräumen gelangen. In einigen Fällen verbleiben sie dort für einen längeren Zeitraum. Dabei kann es sich um Sedimente, anaerobe Abfallbehandlungssysteme, Gastrointestinaltrakte, schlecht entwässerte oder überflutete Böden oder Deponien oder Grundwasserquellen handeln (81). Es gibt verschiede Methoden zur Evaluierung der biologischen Abbaubarkeit. Dazu hat die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) unterschiedliche Methoden standardisiert. Nach ihrem Evaluierungsprinzip sollte die

48 Stand von Wissenschaft und Technik 48 biologische Abbaubarkeit eines Stoffes durch drei aufeinander folgende Prüftests ermittelt werden, d. h. ein Test zur Bestimmung der leichten Abbaubarkeit und je nach Ergebnis, ein weiterer Test zu Bestimmung der inhärenten Abbaubarkeit und abschließend ein Test zur Simulation der Abbaubarkeit (82). Gemäß OECD ist der Test zur Evaluierung der anaeroben Bioabbaubarkeit ein Simulationstest, bei dem das Ausmaß und die Geschwindigkeit des biologischen Stoffabbaus durch die Quantifizierung des Drucks des produzierten Biogases (im Wesentlichem CO2 und CH4) berechnet werden. Als Kontrolle sollten biologisch leicht abbaubare Referenzsubstanzen verwendet werden. Owen et al. (1979) erstellten die erste Beschreibung einer solchen Prüfmethode auf Basis früherer Methoden zur Gasmessung in Inkubationsflaschen. Die Messung der Überschussgasmenge (CH4 + CO2) nach der Zugabe einer Prüfsubstanz zum anaeroben Inokulum, das in gasdichten Flaschen inkubiert wurde, lag der Methode zugrunde. Das Gasvolumen wird durch die Verschiebung des Kolbens einer Glasspritze, deren Nadel in die Flasche eingelegt wurde, gemessen. Anschließend wurde diese Methode verbessert mit dem Ziel, ein einfaches Protokoll zu erstellen, so dass sie von der American Society for Testing Materials (ASTM) als Standardmethode etabliert werden konnte. Die Verwendung eines Druckwandlers, um den Gasdruck zu messen, wurde später eingeführt. 50 mg Kohlenstoff pro Liter als chemische Testkonzentration und 10 Vol.-% Faulschlamm als Inokulum wurden ebenso empfohlen (81). In der zweiten Phase der vorliegenden Forschungsarbeit wurde die von Owen et al. (1979) eingeführte Standardmethode zur Evaluierung des anaeroben Abbaus und des Biogaspotentials der verwendeten organischen Stoffe eingesetzt (mit Durchstechflaschen von 125 ml). 2.3 Einfluss von Enzymen Grundlagen von enzymatischen Reaktionen Enzyme sind Proteine, die eine chemische Reaktion katalysieren. D. h. sie ermöglichen, dass die Reaktion schneller und unter günstigeren Bedingungen abläuft

49 Stand von Wissenschaft und Technik 49 (83), (84). Die Geschwindigkeit einer entsprechenden enzymkatalysierten Reaktion kann etwa um 10 Größenordnungen (10 10 ) größer sein als die einer nicht enzymkatalysierten Reaktion. Die Steigerung der Geschwindigkeit um den Faktor verkürzt die Halbwertzeit einer Reaktion von 300 Jahren auf eine Sekunde (14). Die Reaktionsgeschwindigkeit kann sogar um einen Faktor von erhöht werden. Die unkatalysierte Decarboxylierung von Orotidin 5'-Monophosphat hat z. B. eine Halbwertszeit von 78 Mio. Jahren. Allerdings, wenn das Enzym Orotidin 5'-Phosphat- Decarboxylase (ein äußerst leistungsfähiges Enzym) hinzugefügt wird, dauert der gleiche Prozess nur ca. 25 Millisekunden (85). Aus lebenden Zellen hat man bisher über Enzyme isolieren können. Für den Abbau eines Stoffes ist das Zusammenwirken vieler Enzyme notwendig. Bisher isolierte und identifizierte Enzyme enthalten meistens Protein (84). Enzyme sind ihrem chemischen Aufbau nach Proteine und ihrer Funktion nach spezifische biochemische Katalysatoren. Sie haben eine dreidimensionale Struktur, welche mit ihrer katalytischen Wirkung unmittelbar verknüpft ist (14). Einflussfaktoren auf die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit Die Substanz, an der ein Enzym arbeitet, ist ein Substrat, und das Ergebnis dieser Reaktion ist das Produkt. Die Enzymgeschwindigkeit ist von den Lösungseigenschaften und der Substratkonzentration abhängig. Versuche haben gezeigt, dass die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion direkt proportional zu der Konzentration der Enzyme ist. Mit anderen Worten, je höher das Enzymmolekül/Substratsmolekül-Verhältnis ist, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit eines Kontaktes zwischen den beiden Molekülen (84). Bei konstanter Enzymmenge steigt die Reaktionsgeschwindigkeit direkt proportional zur Substratkonzentration, bis sie sich bei einer Maximalgeschwindigkeit stabilisiert. Bei diesem Wert verläuft die Kombination zwischen den Enzym- und Substratmolekülen in kürzest möglicher Zeit (84). Auch nimmt die Geschwindigkeit einer Reaktion mit steigender Temperatur zu. Allerdings führt bei enzymatischen Reaktionen eine Temperaturerhöhung über ein spezifisches Maximum hinaus zu einer Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit

50 Stand von Wissenschaft und Technik 50 wegen thermischer Denaturierung der Enzyme. Jedes Enzym hat einen spezifischen optimalen Temperaturbereich (84). Wie bei der Temperatur hat die Reaktionsgeschwindigkeit ein Maximum bei einem optimalen ph-wert. Nimmt der ph-wert im Vergleich zum Optimum zu oder ab, sinkt die Geschwindigkeit (84). Mechanismus der Enzyme Die katalytische Wirkung von Enzymen besteht aus zwei Vorgängen, zum einen die Fixierung am Substrat und zum anderen die Aktivierung des Substratabbaus (84). Obwohl die Stoffwechselprozesse energielieferende, exergone (Freisetzung von Energie nicht in Form von Wärme oder Licht, sondern in Form von Arbeit) Prozesse sind, laufen sie bei Zimmertemperatur nicht spontan ab. Bevor die Reaktion startet, muss den Reaktionspartnern eine bestimmte Energie als Impuls zugeführt werden (14). Diese so genannte Aktivierungsenergie kann durch einen katalytischen Agent oder ein Enzym zugeführt werden (84). Diese Energie wird durch Enzyme herabgesetzt (siehe Abb. 2.3), so dass die Reaktionen dann schon bei Temperaturen um 20 ⁰C ablaufen können, obwohl, von den chemischen Gegebenheiten her betrachtet, die Reaktionstemperaturen erheblich höher liegen müssten. Abb. 2.3: Wirkungsweise eines Enzyms (86) Dadurch treten in der lebenden Zelle keine unverträglichen Temperaturen auf (14). Die Enzyme verbinden sich mit den Substraten und bilden einen Komplex. Damit werden die Substrate schneller aufgespalten als ohne Enzym (84).

51 Stand von Wissenschaft und Technik 51 Die Abb. 2.4 zeigt die schematische Darstellung einer enzymatischen Reaktion. Das Substrat S wird am aktiven Zentrum des Enzyms gebunden und geht eine lockere Verbindung mit dem Enzym ein, den sogenannten Enzym-Substrat-Komplex. Dieser Komplex zerfällt während der weiteren Reaktion in die Produkte und das Enzym. Abb. 2.4: Schematischer Aufbau und Funktion eines substratspezifischen Enzyms (E = Enzym, S = Substrat ) (14). Der Enzym-Substrat-Komplex kann schematisch durch ein Positionierungsmodell dargestellt werden (siehe Abb. 2.5). Abb. 2.5: Schematische Darstellung eines Enzym-Substrat-Komplexes Komplexes (245) Nach diesem Modell sind die Aminosäurereste eines zu spaltenden Substrats als P1, P2, P3, P4... Pn in der Richtung des N-Terminals von der Spaltstelle und als P1', P2', P3', P4'... Pm in der Richtung des C-Terminals bezeichnet.

52 Stand von Wissenschaft und Technik 52 Eigenschaften der Enzyme Die Enzyme haben wie alle Katalysatoren folgende Eigenschaften: - Sie wirken in geringen Konzentrationen. - Sie gehen aus der Reaktion unverändert und unverbraucht hervor. - Sie haben keinen Einfluss auf die Lage des Reaktionsgleichgewichtes, sondern beschleunigen lediglich dessen Einstellung (14). - Ihre Molekülstruktur ist komplex. Das Molekül liegt dreidimensional gefaltet vor, so dass eine taschenartige Vertiefung entsteht, in der sich das aktive Zentrum des Moleküls befindet. - Sie sind reaktions- und substratspezifisch. Die Reaktion zwischen Enzym und Substrat ist mit dem Schlüssel-Schloss-Prinzip vergleichbar. Nur ein ganz bestimmtes Substrat passt in das aktive Zentrum des Enzyms. Für die Spezifität ist ihre Strukturgeometrie verantwortlich (siehe Abb. 2.4). - Sie können nach Induktion synthetisiert werden (Substrat- bzw. Enzym- Induktion). Verschiedene Enzyme werden von der Zelle erst synthetisiert, wenn das abzubauende Substrat angeboten wird. Typen, Formen und Zustände der Enzyme Anabolische Enzyme: Enzyme, die an aufbauenden Stoffwechselprozesse arbeiten. Dabei wird Energieeinsatz notwendig. Katabolische Enzyme: Enzyme, die an abbauenden Stoffwechselprozesse arbeiten. Dabei wird Energie freigesetzt. Proenzyme (auch Zyimogen): Inaktive Enzymvorstufen, d. h. Enzyme, die bei ihrer Synthese inaktiv sind. Durch den Verlust des Molekülteils, der ihre katalytische Tätigkeit blockiert, werden sie aktiviert (84). Isoenzyme (auch Isozym): Formen eines Enzyms, die aus verschiedenen Genen enstehen und sich in der Aminosäuresequenz unterscheiden, aber die gleiche chemische Reaktion katalysieren. Allozyme: Enzyme aus verschiedenen Allelen des gleichen Gens. Apoenzyme: Proteinbestandteil eines Enzyms, das sich mit einem Coenzym verbindet, um ein aktives Enzym zu bilden. Coenzyme: Coenzyme sind im Gegensatz zu Enzymen keine Proteine, sondern niedermolekulare organische Moleküle, deren katalytische Eigenschaften die

53 Stand von Wissenschaft und Technik 53 Reaktion zwischen Enzym und Substrat ermöglichen (87). Sie sind mit den Enzymen mehr oder weniger fest verbunden und dienen zur Aufnahme und Weitergabe von Bruchstücken der Substrate, z. B. von Wasserstoff, Carboxyl- und Aminogruppen (14). Coenzyme sind stabil gegenüber höherer Temperatur. Sie können aber vom Apoenzym durch thermische Trennung abgespaltet werden (84). Coenzyme können von vielen Organismen nicht synthetisiert werden, sie müssen mit der Nahrung in Form von Vitaminen aufgenommen werden (14). Induzierbare Enzyme: Enzyme, deren Synthese durch die Anwesenheit einer Substanz (Induktor) gestartet wird. Multifunktionelle Enzyme: Enzyme, die verschiedene Reaktionen katalysieren können. Holoenzyme: Enzyme, die alle ihre Bestandteile, einschließlich der Coenzyme und alle seine Untereinheiten besitzen. Allosterische Enzyme: Enzyme, die zwei Bindungsstellen besitzen, eine (aktives Zentrum) für das Substrat, die andere (allosterisches Zentrum) für Moleküle (Effektoren: Aktivatoren und Inhibitoren). Sie ändern ihre Struktur bei der Bindung eines allosterischen Effektors (siehe Abb. 2.6). Allosteric inhibitor Allosteric binding site Abb. 2.6: Allosterische Reaktionen eines Enzyms (88) Aktivatoren Substanzen, z. B. anorganische Salze oder Ionen, die die Enzymaktivitäten einiger Enzyme erhöhen. Die bekanntesten Aktivatoren sind: Eisen-, Kupfer-, Mangan-, Magnesium-, Kobalt- und Zinkionen.

54 Stand von Wissenschaft und Technik 54 Im Prinzip kann ein Enzym mit spezifischen Ionen arbeiten, in Sonderfällen können jedoch einige Ionen, ohne Störung der enzymatischen Tätigkeit, durch andere ersetzt werden (84). Amylasen benötigen z. B. Chloridionen und einige Dehydrogenasen Magnesium-, Zink- oder Manganionen als Aktivatoren. Die Aktivität dieser Enzyme und damit die Geschwindigkeit der Enzymreaktion nehmen mit steigender Konzentration der Aktivatoren solange zu, bis die optimale Konzentration enzymaktivierender Ionen erreicht ist. Eine weitere Erhöhung der Konzentration führt zu keiner weiteren Erhöhung der Aktivität (14). Verlauf und Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion Die Grundlage für die Beschreibung des Verlaufes einer enzymkatalysierten Reaktion ist die Theorie von Michaelis und Menten. Danach reagiert zuerst das Substrat (S) mit dem Enzym (E) zum Enzym-Substrat-Komplex (ES), wobei sich zwischen den Reaktionspartnern ein Gleichgewicht einstellt. Im nächsten Schritt zerfällt der ES-Komplex in das Enzym und das Produkt (P). k1 E + S ES E + P k2 k3 Die Geschwindigkeit der Gesamtreaktion (k3) wird demnach durch die Konzentration des ES-Komplexes bestimmt. Da der erste Schritt dem Massenwirkungsgesetz folgt, (E) (S)/(ES) = Km ist die Konzentration des (ES)-Komplexes bei konstanter Enzymkonzentration (E) von der Substratkonzentration (S) direkt abhängig. Daraus leitet sich die Michaelis- Menten-Beziehung v = vmax (S/(Km + S)) direkt ab, wobei die Konstante Km die drei Reaktionsgeschwindigkeiten k1, k2 und k3 zusammenfasst. Km ist keine absolute Konstante, sondern von ph, Temperatur u. ä. abhängig. Misst man die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion und trägt diese gegen die Substratkonzentration auf, so ergibt sich die in Abb. 2.7 dargestellte Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.

55 Stand von Wissenschaft und Technik 55 Abb. 2.7: Graphische Darstellung der Michaelis-Menten-Beziehung (14). Man erhält eine Kurve, die sich asymptotisch einer Parallelen zur x-achse, nämlich der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) nähert. Die Substratkonzentration bei halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit (1/2 vmax) wurde als Maß für die Enzymaktivität definiert. Der Km-Wert (Michaelis-Menten-Konstante) gibt jene Substratkonzentration S (in mol/l) an, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit 1/2 vmax ist oder bei der 50 % der aktiven Zentren des Enzyms vom Substrat belegt sind (89). Ein kleiner Wert der Michaelis-Menten-Konstante bedeutet, dass bereits bei geringer Substratkonzentration eine hohe Aktivität erreicht wird. Hohe Km-Werte weisen auf geringe Enzymaktivitäten hin. Gliederung der Enzyme Enzyme werden häufig nach dem von ihnen katalysierten Stoffwechselschritt benannt. Die Bezeichnungen tragen die Endung -ase", z. B. spaltet Amylase" Stärke in Zucker (z. B. in einer Mälzerei) oder die Urease" Harnstoff in CO2 und Ammoniak. Das Nomenklaturkomitee der International Union of Biochemistry and Molecular Biology hat das Enzym Commission Number (die EC-Nummern) als Klassifikationssystem für Enzyme empfohlen. Damit werden die Enzyme nach ihren chemischen Reaktionen, die sie katalysieren, aufgegliedert (90). Jedes Enzym wird durch die Buchstaben EC und eine Folge von vier Zahlen beschrieben. Die erste Ziffer klassifiziert den Mechanismus: - EC 1 Oxidoreduktasen - EC 2 Transferasen - EC 3 Hydrolasen - EC 4 Lyasen - EC 5 Isomerasen - EC 6 Ligasen.

56 Stand von Wissenschaft und Technik 56 Oxidoreduktasen (EC 1) katalysieren Redoxvorgänge, wie sie z. B. in der Atmungskette zur Energiegewinnung ablaufen. Die meisten Enzyme sind als Dehydrogenasen bezeichnet (14), (91). Transferasen (EC 2) katalysieren die Übertragung ganzer funktionalen Gruppen (z. B. Amino-, Carboxyl-, Phosphatgruppen) von einem Substrat auf ein anderes (14), (92) (z. B. Transesterasen, Transamidasen etc.). Viele Transferasen brauchen für diese Reaktion ein Coenzym. Diese Enzyme oder ihre Coenzyme werden kovalentweise von einem Teil der Substratmoleküle ersetzt (91). Hydrolasen (EC 3) katalysieren die Hydrolyse von mehreren chemischen Bindungen, d. h. die hydrolytische Trennung der Bindungen C-O, C-N, C-C, P-O und anderen einfachen Bindungen (durch Wasserzugabe) (92). Hydrolasen katalysieren Reaktionen folgender Art: A B + H2O A OH + B H Die Hydrolasen greifen Glykosid-, Peptid- und Esterbindungen an. Bekannte Hydrolasen sind: Esterasen (Fettspaltung), Proteasen (Eiweißspaltung) und Amylasen (Verzuckern von Stärke) (14). Sie sind eine Sonderform der Transferasen, der das Wasser als Rezeptor der transferienten Gruppe dient (91). Da diese Enzyme die wichtigsten bei der Hydrolyse eines anaeroben Prozesses sind, werden diese im Folgenden eingehender betrachtet: Nach dem Enzym Commission Number (1992) können Hydrolasen, basierend auf den chemischen Bindungen, an denen sie angreifen, weiter in verschiedenen Unterklassen unterteilt werden: - EC 3.1: Esterases - Acting on ester bonds Carboxylic-ester hydrolases Acting on ester bonds at a carboxilic group Thioesterases Acting on ester bonds at thiol group , 11, 13-16, 21-27, (Nucleases, Phosphodiesterases, Lipase, Phosphatase)

57 Stand von Wissenschaft und Technik 57 - EC 3.2: Glycosylases - Acting on sugars (DNA glycosylases, glycoside hydrolase) - EC 3.2.1: Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds - EC , 10, 20, 21, 23, 33, 43: Glucosidases - EC 3.2.2: Hydrolysing N-Glycosyl Compounds - EC 3.3: Etherases Acting on ether bonds - EC 3.4: Peptidases Acting on peptide bonds (proteases/peptidases) (deleted sub-classes), (aminopeptidases, dipeptidases, omega peptidases etc.) Serine endopeptidases Cysteine endopeptidases ( Papain) , 99 (Aspartic endopeptidases, Threonine endopeptidases etc.) - EC 3.5: Acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds - EC 3.6: Acting on acid anhydrides (acid anhydride hydrolases, including helicases and GTPase) - EC 3.7: Acting on carbon-carbon bonds - EC 3.8: Acting on halide bonds - EC 3.9: Acting on phosphorus-nitrogen bonds - EC 3.10: Acting on sulfur-nitrogen bonds - EC 3.11: Acting on carbon-phosphorus bonds - EC 3.12: Acting on sulfur-sulfur bonds - EC 3.13: Acting on carbon-sulfur bonds Lyasen (EC 4) spalten verschiedene Bindungen durch andere Prozesse als Hydrolyse und Oxidation zur Bildung von Ringen oder Doppelbindungen (91), (92). In umgekehrter Richtung katalysiert eine Lyase die Anlagerung eines Substrats zu einer Doppelbindung eines zweiten Substrats (91). Beispiele für Lyasen sind Carboxylasen, Aldehydlyasen und Hydrolyasen. Isomerasen (EC 5) katalysieren isomerische Umlagerungen von Gruppen innerhalb von Molekülen. Sie verändern ihre atomare Struktur, aber nicht ihre atomare Zusammensetzung. Beispiele davon sind Cis-Trans-Isomerasen (Umlagerung von

58 Stand von Wissenschaft und Technik 58 cis- in trans-stellung), Epymerasen, Racemasen, intramolekulare Oxidoreduktasen, Intramolekulare Transferasen etc. (91), (14), (92). Ligasen (EC 6) bewirken eine kovalente Verbindung zweier Moleküle mit Hilfe der in Form von Triphosphatnukleosiden gespeicherten Energie, z. B. von ATP (14), (91). Beim anaeroben Abbau werden die wesentlichen organischen Stoffe durch verschiedene Enzyme gespalten und unter Mitwirkung weiterer Enzyme der Bakterienzelle verfügbar gemacht. Kohlenhydrate (Polysaccharide) werden z. B. durch Amylasen oder Cellulasen in niedermolekulare Verbindungen wie Disaccharide (Cellobiose, Maltose) und Monosaccharide (Glucose, Fructose) gespalten und unter Mitwirkung weiterer Enzyme (die sogenannten Permeasen) durch die Zellmembran in die Bakterienzelle aufgenommen. Der Abbau der Proteine verläuft ähnlich wie die Hydrolyse der Kohlenhydrate. Die hydrolytische Spaltung der Proteine durch Proteasen ist nur wenigen Bakterien möglich. Fette sind dem anaeroben Abbau am schwersten zugänglich. Durch Lipasen werden die Fette zunächst in Glyzerin und Fettsäuren gespalten. Fettsäuren, insbesondere längerkettige Fettsäuren müssen Zug um Zug weiter gespalten werden, bis sie zu CH4, CO2 und anorganischen Endprodukten abgebaut sind (24). Im Folgenden werden etwas näher die Einflüsse der Enzyme auf die drei wesentlichen organischen Stoffe beschrieben Einfluss auf Kohlenhydrate Kohlenhydrate sind organische Moleküle, die meist aus Kohlenstoff, Wasserstoff und weniger aus Sauerstoff über kovalente Bindungen verknüpft sind. Der Name stammt aus der chemischen Nomenklatur des neunzehnten Jahrhunderts, als die ersten isolierten Substanzen der empirischen Formel Cn(H2O)n, (n 3) entsprachen. Das H:O Atomverhältnis ist 2:1 wie bei Wasser. Obwohl später bemerkt wurde, dass andere Substanzen mit gleichen chemischen Eigenschaften (Polysaccharide ohne Wasser) nicht mit dieser Formel übereinstimmten, wurde dieser Name beibehalten. Man unterscheidet drei Gruppen von Kohlenhydraten: Monosaccaride (1 Molekül) Oligosaccharide (2-20 Moleküle) und Polysaccharide (> 20 Moleküle) (91). Allerdings variiert bei den verschiedenen Autoren die Länge eines Kohlenhydrats zur Eingliederug zu den Oligo- oder Polysacchariden. Die mehrmolekularen Saccharide

59 Stand von Wissenschaft und Technik 59 sind über sogenannte Glykosidbindung verknüpft, die ebenso kovalent sind. Die Bindung erfolgt zwischen den Hydroxylgruppen (OH) zweier Moleküle unter Wasserabspaltung (Dehydratation). Dabei handelt es sich um den Verlust von einem Wasserstoffatom des einen und einer Hydroxylgruppe des anderen Moleküls mit der daraus folgenden Bildung von einem Molekül H2O (siehe Abb. 2.8). Diese Bindungen können sich zwischen allen Hydroxylgruppen zweier Monosacchride ausbilden. Abb. 2.8: O-Glykosidbindung der Kohlenhydrate (Maltose: Glucose-O-Glucose) (93) Dissaccharide (2 Moleküle) sind die häufigsten Oligosaccharide (91). Die bekanntesten Polysaccharide sind Cellulose (1-4 ß-glykosidisch verknüpft) und Stärke (hauptsächlich 1-4 α-glykosidisch verknüpft). Sie finden als Gerüstbausteine bzw. Speicherform für Glucose Anwendung. 1-4 α-glycosidisch weist auf eine Bindung zwischen zwei α-d-glucosen hin, die zwischen dem C1 des einen und dem C4 des anderen Moleküls ausgebildet wurde. Hierbei bildet sich eine Etherbindung unter Wasserabspaltung aus. Die Glykosidbindungen von Kohlenhydraten können ebenso wie Peptid- oder Esterbindungen von Proteinen und Fetten unter anderem durch enzymatische Katalyse hydrolysiert werden. Enzyme helfen dabei, die Polymere in die Monosaccharide (Glucose, Fructose und Galactose) zu spalten. Glucose ist die Hauptenergiequelle für viele Tiere mit Ausnahme der Wiederkäuer. Komplex gebaute Kohlenhydrate wie z. B. Stärke und Cellulose werden jedoch in mehreren Spaltvorgängen meist in Glucose umgesetzt. Die hier katalytisch aktiven Enzyme sind die Glykosidasen (auch als Glykosiden oder Glykosidhydrolasen bezeichnet). Sie sind eine Untergruppe der Hydrolasen/Glykosylasen. In der Regel spalten sie glykosidische O- und S-

60 Stand von Wissenschaft und Technik 60 Bindungen, entweder an den α- oder β-glykosidischen Bindungen (nicht aber an beiden) zur Aufteilung in kleinere Zucker. Zusammen mit Glykosyltransferasen bilden Glykosidasen die größte katalytische Enzymgruppe für Synthese und Spaltung der glykosidischen Bindungen (siehe Abb. 2.9): Abb. 2.9: Mechanismus einer Hydrolase (94) Glykosidasen sind sehr häufige Enzyme mit Funktionen in verschiedenen Bereichen: - in der Natur (einschließlich Abbau von Biomasse wie Cellulose und Hemicellulose) - in antibakteriellen Abwehrstrategien (z. B. Lysozyme) - in Pathogenese-Mechanismen (z. B. virale Neuraminidase) - in normal zellulärer Funktion (z. B. Trimming von Mannosidasen beteiligt in N- linked-glycoprotein-biosynthese). Eine weitere Untergruppe der Glykosidasen sind die Glucosidasen, die die Abspaltung von einzelnen Glucosylresten aus verschiedenen Glycokonjugaten einschließlich α- oder ß-vernetzter Polymere von Glucose katalysieren. α- Glucosidasen sind Enzyme für den Abbau von komplexen Kohlenhydraten wie Stärke und Glycogen (95). Diese Enzyme sind unter der EC Nummer gegliedert. Verschiedene Quellen schließen unterschiedliche Mitglieder in diese Klasse ein (siehe Tab. 2.12). Tab. 2.12: Glucosidasen (96) Name EC Description α-amylase EC is a digestive enzyme in mammals ß-Amylase EC is a plant enzyme to break down starch γ-amylase EC is a digestive enzyme Cellulase # EC breaks down cellulose from plant material Sucrase-isomaltase EC Acid α-glucosidase # EC is associated with Glycogen storage disease type II Beta-glucosidase # EC is associated with gaucher's disease Lactase EC one member of the ß-galactosidase family, breaks down milk sugars, and its absence in Adulthood causes lactose intolerance Debranching enzyme # EC Pullulanase EC has been used as a detergent Members marked with a "#" are considered by MeSH to be glucosidases Cellulasen sind Enzyme (Hydrolasen/Glykosidasen/Glucosidasen), die in der Lage sind, Cellulose in ihren Grundbaustein ß-Glucose aufzuspalten. Sie werden nur von

61 Stand von Wissenschaft und Technik 61 einem kleinen Teil der Pflanzen abbauenden Organismen, u. a. bestimmten Einzellern (speziellen Bakterien und Flagellaten) sowie von Holz abbauenden Organismen (vor allem von Pilzen) gebildet. Bakterien, z. B. aus dem Magen von Wiederkäuern und Termiten, können Cellulase produzieren. Darüber hinaus können weder die meisten Tiere noch der Mensch Cellulase in ihrem Körper bilden. Daher sind sie nicht in der Lage, einen Großteil der in den Pflanzen enthalten Energie auszunutzen. Bisher konnten nur bei steril gehaltenen Silberfischchen Celluloseabbau (97) und bei einer in Käfern lebenden Fadenwurmart sogar entsprechende Gene (98) nachgewiesen werden Einfluss auf Proteine Proteine sind Peptide aus 100 bis 1000 Aminosäuren, die miteinander über die sogenannten Peptidbindungen verknüpft sind. Die Ausbildung einer Peptidbindung erfolgt enzymkatalytisch zwischen einer Carboxylgruppe und einer Aminogruppe aus zwei Aminosäuren unter Wasserabspaltung (siehe Abb. 2.10). Abb. 2.10: Peptidbindung der Proteine (99) Die Spaltung der Peptidbindung und damit der Abbau des Proteins erfolgt durch Hydrolyse unter Wassereinlagerung. Die diese Reaktion katalysierenden Enzyme werden als Proteasen oder Peptidasen bezeichnet. Man unterscheidet zwischen Exopeptidasen, die endständige Aminosäuren von der Polypeptidkette entfernen, und Endopeptidasen, die in der Lage sind, Peptidbindungen auch inmitten der Polypeptidkette zu hydrolysieren. Die hydrolytische Spaltung der Proteine durch Proteasen können nur wenige Bakterien. Die so gebildeten kurzkettigen Peptide und Aminosäuren werden durch Permeasen der Zelle verfügbar gemacht (24). Jede Art von Protein wird um seine konstituierenden Aminosäuren in verschiedenen Geschwindigkeiten abgebaut. Niedrige Temperaturen senken die

62 Stand von Wissenschaft und Technik 62 Reaktionsgeschwindigkeit auf ein Minimum ab, da sie die Aktivität der Proteasen vermindern (91). Enzyme mit ähnlichen Funktionen haben oft sehr unterschiedliche Strukturen. Eine wichtige Ähnlichkeit liegt in ihren aktiven Zentren. Proteasen benutzen unterschiedliche Aminosäurereste (Serin, Cystein, Aspartyl usw.) als Nucleophil in ihrem aktiven Zentrum, so entstehen die Serin-Proteasen (z. B. Chymotrypsyn, Trypsin oder Subtilisin), Cystein-Proteasen (z. B. Papain) und Aspartyl-Proteasen (z. B. Pepsin) (89). Enzyme können die Proteine selektiv an spezifischen Kettenstellen der Peptidbindungen in ihre Aminosäuren aufspalten. Trypsin katalysiert z. B. die Hydrolyse der Peptidbindungen am sogeannten C-Terminal (Carbonylgruppe) von Aminosäuren, die eine positiv geladene R-Gruppe (Lysin- und Argynin-Reste) haben. Eine Protease aus Staphylococcus aureus-v8 katalysiert die Hydrolyse der Peptidbindungen ebenfalls am C-Terminal von Aminosäuren, die aber eine negativ geladene R-Gruppe (Glutamat- und Aspartat-Reste) haben (91). Das Enzym Chymotrypsin ist weniger spezifisch als die anderen und katalysiert die Auftrennung der Peptidbindungen am C-Terminal mit aromatischen seitlichen Aminosäuren wie Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin (89) Einfluss auf Fette Lipide (Fette) bestehen haupsächlich aus Kohlenstoff, Wasserstoff und wenig Sauerstoff. Einige Arten enthalten auch Stickstoff und Phosphor. Bei ihrer vollständigen Oxidation wird doppelt so viel Energie freigesetzt wie bei der von Kohlenhydraten und Proteinen (84). Allerdings sind Lipide im Gegensatz zu Proteinen und Kohlenhydraten hoch polymorph und schwer strukturell zu definieren. Eher operativ werden sie als organische Verbindungen, die in biologischen Systemen zu finden und in Wasser gar nicht oder nur wenig löslich sind, definiert. Lipide können hydrophoben (unpolaren) oder amphipathischen (mit unpolaren und polaren Substituenten) Charakter haben (91). Lipide werden unter Veresterung (Esterbildung) aufgebaut. Diese ist eine Gleichgewichts- und Kondensationsreaktion, bei der ein Alkohol oder Phenol mit einer Säure zu einem Ester reagiert. Die Säure kann eine organische Carbonsäure (z. B. Essigsäure, Benzoesäure, Zitronensäure) oder eine anorganische Säure (z. B. Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure)

63 Stand von Wissenschaft und Technik 63 sein. Die Reaktion kann in Gegenwart einer starken Säure als Katalysator (meist konzentrierte Schwefelsäure) stattfinden. Dabei kommt es zu einer Additionsreaktion mit anschließender Eliminierungsreaktion (100). Die Reaktionsgleichung der Veresterung einer Carbonsäure kann so wie in Abb dargestellt werden. Abb. 2.11: Veresterung einer Carbonsäure (101) Ein Lipidmolekül besteht aus einem Glyzerin-Alkohol mit drei organischen Fettsäuren, die eine Kette von 4 bis 24 Kohlenstoffatomen haben (84), (102). Kurzkettige Fettsäuren sind wasserlöslich (hydrophil), langkettige hingegen nicht (hydrophob) (84). Abb zeigt die Veresterung eines Alkohols mit Fettsäuren unter Wasserabspaltung bei der Fettsynthese. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Eiweißen und Lipiden besteht darin, dass jedes Lipid nur aus der Verbindung von Glycerin mit drei Fettsäuren besteht, aber diese nicht zu Ketten verbunden sind. Daher wird jedes Lipid bei entsprechend hoher Temperatur flüssig, während dies bei Eiweißen oder Kohlenhydraten nicht möglich ist (102). Abb. 2.12: Fettsynthese durch Veresterung (103) Je nach Aggregatzustand des Fettes bei Raumtemperatur unterscheidet man feste Fette, halbfeste Fette und fette Öle. Der unterschiedliche Aggregatzustand ist in erster Linie durch die Länge der C-Ketten der organischen Säuren bedingt. Je länger der aliphatische Rest ist, desto fester wird das Fett. Zudem nehmen Einfluss auf die Konsistenz des Fettes auch Doppelbindungen zwischen C-Atomen (siehe Abb. 2.13)

64 Stand von Wissenschaft und Technik 64 in der Kette (ungesättigte Fettsäuren). Je mehr ungesättigte Fettsäuren vorhanden sind, desto weicher ist das Fett, da sich zunehmend schwache nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen den Säureresten ausbilden können und der mögliche kristalline Charakter verloren geht. Abb. 2.13: Beispiel eines ungesättigten Fettes (103) Lipide können allgemein in die folgenden Stoffklassen unterteilt werden: 1.) Nicht hydrolysierbare Lipide - Kohlenwasserstoffe (Alkane, Carotinoide) - Alkohole (langkettige Alkanole C10 und höher, Sterole) - Carbonsäuren (C10 und höher) 2.) Einfache Ester - Fette (Fettsäuren + Glycerol) - Wachse (Fettsäure + Alkanol) - Sterolester (Fettsäure + Cholesterol) 3.) Phospholipide - Phosphatidsäuren (Fettsäure + Glycerol + Phosphat) - Phosphatide (Fettsäure + Glycerol+ Phosphat+ Aminoalkohol) 4.) Glycolipide - Cerebroside (Fettsäure +Sphingosin + Zucker) - Ganglioside (Fettsäure + Sphingosin + Zucker + Neuraminsäure) Die Esterbindungen der Lipide lassen sich durch Säuren, alkalische Reagenzien oder Enzyme hydrolysieren. Diese Rückreaktion wird als Esterhydrolyse bezeichnet. Dadurch werden das Glyzerin und die Fettsäuren freigesetzt (84). Die alkalische Esterhydrolyse hat einen anderen Reaktionsmechanismus. Aus historischen Gründen wird sie als Verseifung bezeichnet, da sie zu Seifebildung

65 Stand von Wissenschaft und Technik 65 führt. Seifen besitzen einen hydrophilen (lipophoben) und einen hydrophoben (lipophilen) Teil und können somit als Emulgatoren wirken. Die enzymatische Hydrolyse wird durch Lipasen, eine Untergruppe der Hydrolasen/Esterasen, durchgeführt. Esterasen sind Enzyme, die in der Lage sind, Ester hydrolytisch in einen Alkohol und eine Säure aufzuspalten. Lipasen sind Enzyme, die die Hydrolyse oder den Aufbau von Lipiden katalysieren (104). Sie kommen in den meisten Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen als zelluläre oder extrazelluläre Proteine vor und gehören zur Familie der Serin-Hydrolasen (105). Sie haben für ihre spezifischen Reaktionen ein Reaktionsgleichgewicht, das vom Wassergehalt des Gesamtsystems abhängig ist (106). Lipasen bevorzugen wasserunlösliche Substrate, sind aber durchaus in der Lage, Triglyceride aus kurzkettigen Fettsäuren umzusetzen (107). Um den Lipasen optimale Bedingungen zu bieten, sollten die Lipide wie bei der menschlichen Verdauung zerlegt, falls große Teile vorhanden sind, und emulgiert werden (z. B. mit Wasser oder Säure). Dadurch bilden sich kleine Fetttröpchen, an denen die Lipasen angreifen können. Einige Lipasen arbeiten mit anderen Substanzen zusammen. Die Pankreaslipase arbeitet z. B. in Anwesenheit von Colipase (aus Pro-Colipase durch Einwirkung von Trypsinen entstanden) und Calciumionen. Dabei werden vom Triacylglycerid ein bis zwei Fettsäuremoleküle schrittweise getrennt, so dass schließlich zwei Fettsäuren und ein 2- Monoacylglycerid entstehen. Die zweite wichtige, im Dünndarm arbeitende Lipase ist die Gallensalz-aktivierte Lipase, die auch Triglyceride, vor allem aber Cholesterinester spaltet Die Protease Papain Papain ist ein Enzym, das natürlich in relativ hoher Konzentration im Milchsaft der noch grünlichen Schalen und den Kernen der Papaya (Carica papaya) vorkommt und daraus gewonnen wird. Es ist unentbehrlich für die Pflanze bei der Abwehr von Schädlingen (108). Das Enzym wird auch als Papaya Proteinase-I bezeichnet und kann auch in der Mountain Papaya (Vasconcellea cundinamarcensis, Synomyme: Carica candamarcensis, Carica cestriflora, pubescens) gefunden werden (109). Der Milchsaft einer grünen Papaya-Frucht beinhaltet eine Mischung aus Cystein-

66 Stand von Wissenschaft und Technik 66 Endopeptidasen (wie das Papain), Chymopapain A und B, Papaya-Endopeptidase III und IV sowie Omega-Endopeptidase (110). Papain hat eine breite eiweißspaltende Wirkung (109) und wird daher als Protease bezeichnet. Es katalysiert die Hydrolyse von Proteinen mit breiter Spezifität für die Peptidbindungen. Diese können sich auch inmitten einer Polypeptidkette befinden. Darum wird dieses Enzym als Endopeptidase bezeichnet. Das hat aber Präferenz für Aminosäuren mit einer großen hydrophoben Seitenkette an der Position P2 und für Arginin sowie Lysin an der Position P1 des Positionierungsmodells eines Substrats (siehe Tab. 2.13). Es akzeptiert nicht Valin an der Position P1 (111) und bevorzugt Bindungen mit dem Carbonyl-Ende von α-nh2-substituiertem Arginin und Lysin, und in geringerem Maße, Histidin, Glycin, Glutamin und Tyrosin (112). Papain wirkt auch als Esterase, Thioesterase, Transesterase und Transamidase. Raffiniertes Papain ist fast vollständig in Wasser löslich, aber unlöslich in den meisten organischen Lösemitteln. Je nach Beschaffenheit des Substrats zeigt raffiniertes Papain eine maximale Aktivität bei ph-werten von 4,0 bis 7,0. Papain ist unter sauren Bedingungen instabil. Bei ph-werten unter 2,8 erfolgt eine rasche und irreversible Inaktivierung auch bei Raumtemperatur (112). Papain ist ein relativ hitzebeständiges Enzym mit einem optimalen Temperaturbereich zwischen 60 und 70 C (109). Tab. 2.13: Bevorzugte Spaltung des Papains (113) P6 P5 P4 P3 P2 P1 P1 P2 P3 P4 Xaa Xaa Xaa Xaa hydrophobic Arg not Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa hydrophobic Lys not Val Xaa Xaa Xaa Xaa = any amino acid residue hydrophobic = Alanine (Ala), Valine (Val) Leucine (Leu), Isoleucine (Ile), Phenylalanine (Phe), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) = cleavage site Papain findet häufig Verwendung in (114): - Diätindustrie (wegen seiner verdauungsfördernden Wirkung) --Lebensmittelindustrie (als Zartmacher für Fleisch, zur Verhinderung oder Klärung der Trübung von Getränken) - Kosmetikindustrie (als Reinigungsmittel) --Medizin (zur Heilung wegen entzündungshemmender Fähigkeit, zur Spaltung von Antikörpern in Fab-Fragmente.

67 Stand von Wissenschaft und Technik 67 --Textilindustrie (als Hilfsmittel bei der Herstellung von Wolle und Seide zur Verhinderung des Verfilzens und Schrumpfens) --Biotechnologie (häufig verwendet in Zellisolationsverfahren und in der Zellserologie). In seinem aktiven Zentrum hat Papain unter anderem Aminosäurereste von Cystein als Nucleophil und wird daher in die Gruppe der Cystein-Proteasen (EC ) eingegliedert. Papain wurde in großem Umfang seit mehr als 130 Jahren von verschiedenen Autoren untersucht (115), (116), (110), (117). Es ist die bekannteste Cystein-Protease, die 1879 aus der Papaya-Frucht isoliert wurde. Es war auch die erste Protease, für die eine kristallographische Struktur nachgewissen wurde (117). Die Moleküle des Papains bestehen aus einer Polypeptidkette aus 212 Aminosäuren mit drei internen Disulfidbrücken und einer Sulfhydryl(Thiol-)gruppe im aktiven Zentrum. Darum wird es auch als Sulfhydryl- oder Thiolprotease bezeichnet (118). Papain hat eine Molekularmasse von 23,4 kda und ist ein relativ basisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt (IEP oder pi) von 8,75 (117). Darunter versteht man den ph-wert, bei dem das Protein gleich negativ wie positiv geladen ist. Papain hat eine dreidimensionale Struktur (siehe Abb. 2.14), welche durch die o. g. Disulfidbrücken gefaltet ist. Dadurch werden zwei Domänen gleicher Größe mit dem aktiven Zentrum in dem Spalt zwischen den Domänen gebildet (118), (119). Abb. 2.14: Papain 3D-Struktur (120) Die enzymatische Aktivität von Papain wird durch die sich im aktiven Zentrum befindende katalytische Dyade durchgeführt, die aus Amisäurenresten aus Cystein an der Position 25 (Cys 25 ) und Histidin an der Position 159 (His 159 ) gebildet wird (117). Obwohl diese Aminosäurenreste in der Kette weit auseinander liegen,

68 Stand von Wissenschaft und Technik 68 kommen sie durch die Faltstruktur und die Brücken in gegenseitige Nähe. Die gemeinsame Arbeit der Aminosäuren im aktiven Zentrum ermöglicht die einzigartigen Funktionen des Papains (119). Abb zeigt den Mechanismus, durch den Papain Peptidbindungen aufbricht. Dieser kann in vier Schritte unterteilt werden: Substratbindung, S-Acylation, Hydrolyse und Deacylation. Eine Deprotonierung von Cys 25 durch His 159 findet dabei statt (109). Diese Aminosäurenreste bilden im ph-bereich von 3,5 bis 8,0 ein Ionenpaar (117), (119). Asparaginreste an der Position 175 (Asn 175 ) helfen der Orientierung des Imidazoliumrings (Salz des Imidazols) der His 159 im katalytischen Spalt (117), dass damit die o. g. Deprotonierung erfolgt. R NH2 Abb. 2.15: Enzymatischer Mechanismus der Protein-Hydrolyse durch eine Cystein-Protease (117) Die aktive Thiolgruppe (-SH) des Papains muss in reduzierter Form zur katalischen Wirkung vorliegen. Die Bildung eines kovalenten Zwischenfragments (die Hälfte eines Enzyms S-Acyl) stellt einen grundlegenden Schritt bei der Hydrolyse der Peptidspaltung dar. Dieses Zwischenfragment wird über einen nucleophilen Angriff der Thiolgruppe der Cys 25 auf die Carbonylgruppe (-CO) der hydrolysierten Amid- (Ester-)bindung gebildet. Dadurch wird das Fragment C-Terminal der Peptide frei und das Zwischenfragment gebildet. Im nächsten Schritt reagiert dann ein Wassermolekül mit dem Zwischenfragment. Dadurch wird das Fragment N-Terminal

69 Stand von Wissenschaft und Technik 69 der Peptide frei. Das regenerierte, freie Cysteinprotease-Molekül kann dann einen neuen Katalysezyklus beginnen (121) Inhibitoren für Enzyme Als Inhibitoren werden Substanzen bezeichnet, die die Enzymtätigkeit hemmen können. Abb zeigt die schematische Darstellung einer enzymatischen Reaktion mit inhibiertem aktiven Zentrum. Das aktive Zentrum ist durch einen Inhibitor (I) verändert, so dass das Substrat (S) nicht gebunden werden kann. Abb. 2.16: Hemmung eines substratspezifischen Enzyms durch einen Inhibitor (E = Enzym, S = Substrat, I = Inhibitor) (14). Es gibt folgende Arten der Hemmung von Enzymaktivitäten: - Metabolischer Antagonismus: Hemmung aufgrund der Ähnlichkeit in der Inhibitor- und Substratstruktur. Das Enzym bindet sich mit einem anderen Substrat, dessen Struktur, Größe und Funktionsgruppenbeziehungen identisch mit denen des originalen Substrats sind (84). Hier können zwei Hemmungsarten unterschieden werden: - Kompetitive Hemmung: Substrat und Inhibitor konkurrieren um den Platz am aktiven Zentrum (14). Die Hemmung kann beherrscht werden, wenn das Verhältnis Substrat zu Inhibitor (S/I-Verhältnis) zunimmt (84). D. h. durch die Erhöhung der Substratkonzentration kann sie wieder rückgängig gemacht werden (14). Dabei handelt es sich in der Regel um reversible Hemmungen. Je höher dabei die Konzentration des Inhibitors ist, desto mehr Enzymmoleküle werden blockiert. - Nicht kompetitive Hemmung: Hemmung, die unempfindlich gegenüber der Zunahme des S/I-Verhältnisses bzw. der Substratkonzentration ist.

70 Stand von Wissenschaft und Technik 70 - Endprodukthemmung: Das Endprodukt wirkt ab bestimmten Konzentrationen als Inhibitor auf einen der Anfangsschritte der Reaktionskette (84). - Katabolit-Repression (Diauxie): Die Bildung eines Enzyms zum Abbau eines Substrats wird durch das Angebot eines anderen Substrats gehemmt. Das Substrat unterdrückt die Enzymbildung. Neben diesen Arten der Hemmung durch einen Inhibitor kann das Enzym an sich funktionsunfähig werden: - Denaturierung: Zerstörung der gesamten Enzymstruktur mit einem völlig irreversiblen Verlust der Enzymaktivität, z. B. durch hohe Temperaturen (Kochen) oder starke ph-wert-schwankungen. - Ausflockung: Hemmung eines Enzyms, wenn es nur teilweise z. B. durch geringere ph-wert-änderungen ausgeflockt wird. Papain kann durch verschiedene Inhibitoren in seiner Aktivität eingeschränkt werden. Diese können unterschiedlicher Herkunft sein. Einige stammen aus mikrobiellen Quellen oder aus Protisten. Inhibitoren für Papain können ebenso in menschlichem Serum (116) und Plasma vorkommen oder werden in der Papayapflanze selbst durch mechanische Beschädigungen, Insekten oder Mikroorganismen induziert (110). So kann Papain z. B. durch die folgenden Verbindungen gehemmt werden (114), (122): - Antipain dihydrochlorid aus mikrobieller Quelle - Cystamindihydrochlorid (Konzentration 98 %) - Chymostatin mikrobiell - Cystatin aus lyophilisiertem Pulver Hühnereiweiß - 3,4-Dichloroisocoumarin - E-64 - Ebselen - Gly-Gly-Tyr-Arg 97 % (HPLC) - Leupeptin Trifluoracetatsalz 90 % (HPLC), mikrobiell - α2-makroglobulin aus lyophilisiertem Pulver menschliches Plasmas 98 % (SDS-PAGE) - Hg 2+ und andere Schwermetalle - Sulfhydryl Bindemittel

71 Stand von Wissenschaft und Technik 71 - Carbonylreagentien - Alkylierungsmittel. Antipain wurde in mehreren Actinomycetenstämmen entdeckt und isoliert (123). Viele Arten der Actinomyceten kommen im Boden vor und sind unschädlich für Tiere und Pflanzen, während einige wichtige Pathogene und viele andere Quellen von Antibiotika sind (124). Actinomyceten sind Gram-positive Bakterien. Die meisten wachsen aerob, jedoch sind einige in der Lage, auch anaerob und unter thermophilen Bedingungen zu wachsen. Außerdem gehen Actinomyceten teilweise symbiotische Lebensgemeinschaften mit Pflanzen ein und sind ein Teil der Bodenmikroflora. Einige von ihnen verursachen den typisch "muffigen" Erdgeruch. Sie gehören zu den Zersetzern vieler organischer Verbindungen, z. B. Cellulose, Lignin und Chitin (125). Auch die Mikroorganismen aus der Familie der Trypanosomen (T. cruzi) haben Cysteinproteaseinhibitoren (126). Hierbei handelt es sich um parasitäre Organismen, die über Insekten als Zwischenwirte auch Wirbeltiere befallen können (127) und somit eventuell in Hühnerabfall und Hühnermist vorhanden sein könnten. 2.4 Bacillus Spezies Da der Einfluss spezieller Bacillus Spezies auf den anaeroben Abbauprozess einer der Hauptgegenstände der vorliegenden Doktorarbeit ist, wird im Folgenden dieses Thema ausführlicher behandelt: Das Genus Bacillus besteht aus Gram-positiv obligat aeroben oder fakultativ anaeroben Bakterien. Sie sind in der Natur allgegenwärtig, meist vorkommend in Böden, Seen und Flüssen. Sie reagieren positiv auf den Enzym-Katalase-Test (128) und können frei lebende oder pathogene Spezies sein. Unter stressigen Milieubedingungen gehen sie in eine Überdauerungsform (sogenannte Endosporen) über und können so ruhend einen längeren Zeitraum überleben. Diese Eigenschaften definierten ursprünglich diese Gattung. Allerdings sind viele davon in andere Gattungen untergegliedert worden (129). Bacillus Spezies können in acidophilen, alkaliphilen, halophilen, psychrophilen, mesophilen und thermophilen Milieubedingungen leben. Das bedeutet, dass ihr Wachstum und ihr Stoffwechsel in einem breiten Spektrum von ph-werten und

72 Stand von Wissenschaft und Technik 72 Temperaturen stattfinden können. Einige Arten sind in der Lage, eine Vielzahl von Kohlenstoffquellen wie Methanol, Cellulose und Chitin abzubauen (130). Sie sind Chemoorganotrophe mit einem respiratorischen oder fermentativen Stoffwechsel (131). Viele Bacillus Spezies sind in der Lage, große Mengen an Enzymen zu sekretieren. Bacillus subtilis (auch Gras bacillus oder Heubazillus ) ist ein Gram-positives und Katalase-positives stabförmiges, begeißeltes Bakterium und eines der am besten verstandenen Prokaryonten in der Molekular- und Zellbiologie. Es hat die Fähigkeit, eine robuste schützende Endospore zu bilden, so dass der Organismus extreme Umgebungsbedingungen toleriert. Abb zeigt B. subtilis in der Gramfärbung. Die ovalen nicht gefärbten Strukturen sind die Sporen. Es ist aufgrund seiner hervorragenden genetischen Struktur und Größe in allen möglichen Aspekten untersucht worden und ist ein Modell zur Differenzierung der Gen/Protein-Regulation und des Zellzyklus in Bakterien (132). Abb. 2.17: Bacillus subtilis in der Gramfärbung (133) B. subtilis ist ubiquitär verbreitet und kann aus Böden (insbesondere Komposterde), Wasser und Luft isoliert werden. Seine natürlichen Standorte sind aber die oberen Schichten des Bodens. Dort ist es aufgrund häufig wechselnder Umgebungsbedingungen fast ständig Stress- und Hungersituationen ausgesetzt, an die es sich entsprechend anpassen muss. Die Generationszeit beträgt bei optimalem Nährstoffangebot, optimaler Sauerstoffversorgung und einer optimalen Wachstumstemperatur von 40 ⁰C ca. 26 Minuten. B. subtilis war historisch als obligat

73 Stand von Wissenschaft und Technik 73 aerob klassifiziert worden. Weitere Forschung hat gezeigt, dass es unter anaeroben Bedingungen wachsen kann (134). B. subtilis ernährt sich chemoorganoheterotroph, d. h. es nutzt von anderen Lebewesen erzeugte Nährstoffe, um Energie und körpereigene Substanz zu generieren. Es besitzt ein großes Arsenal an Glukan- (polymer verkettete Zucker) und Protein-abbauenden Enzymen, die bei Bedarf aus der Zelle exportiert werden. Forschungsergebnisse zeigten, dass das Bakterium Polysaccharide (z. B. komplexe Kohlenhydrate wie Arabinogalactan aus Pflanzen) und unverdauliche Oligosaccharide (z. B. Stachyose und Raffinose aus Gemüse und Getreide) abbauen kann (135). Es kann auch durch extrazelluläre Amylasen Stärke hydrolysieren (136). Als Kohlenstoff- und Energiequelle wird bevorzugt Traubenzucker (Glucose) genutzt. Bei ausreichender Konzentration verhindert Glucose die Aktivierung von Genen. Bei Glucoseabwesenheit können auch andere Zucker oder kohlenstoffhaltige Substrate genutzt werden (Katabolitrepression). Zur Energiegewinnung dient Sauerstoff als bevorzugter terminaler Elektronenakzeptor (Zellatmung). Auch hierbei wird die Nutzung alternativer kommender Substrate (z. B. Stickstoff) bei Sauerstoffzutritt unterdrückt. Unter anaeroben Bedingungen können die Zellen bei Glucose- und Nitratanwesenheit noch genug Energie für langsames Wachstum erzeugen. Sind keine als Elektronenakzeptor nutzbaren Substrate verfügbar, dann ist B. subtilis in der Lage, auch ausschließlich durch Gärungsstoffwechsel unter Erzeugung von Milchsäure, Ethanol, Acetoin und 2,3-Butandiol zu überleben. Widrigen Umweltbedingungen versucht sich B. subtilis durch aktive Fortbewegung mit Hilfe seiner Geißel zu entziehen. Ferner kann sich B. subtilis über die sogenannte generelle Stressantwort als vegetativ aktive Zelle mit Schwankungen von Umweltfaktoren auseinandersetzen. In letzter Konsequenz kann B. subtilis durch ein atypisches Zellteilungsprogramm Sporen bilden, die lange Perioden überdauern sowie hohe Temperaturen überleben können. Eine weitere Eigenschaft ist die Ausbildung der Fähigkeit, extrazelluläre (Fremd-)DNA aufzunehmen und diese zur Erweiterung des eigenen Genoms zu integrieren oder sie zur Ernährung zu nutzen. B. subtilis wird nicht als humanpathogen betrachtet, kann aber Lebensmittel kontaminieren. Lebensmittelvergiftungen werden selten durch B. subtilis verursacht.

74 Stand von Wissenschaft und Technik 74 Aufgrund der hohen Hitzeresistenz der B. subtilis-sporen werden diese auch als Indikator bei thermischen Sterilisationsprozessen in Pharmazie, Medizin und Lebensmittelindustrie eingesetzt. In der Landwirtschaft dient der B. subtilis Stamm QST713 als biologisches Fungizid für Samen von z. B. Baumwolle, Gemüse, Erdnüssen und Sojabohnen. Es besiedelt während der Keimung das Wurzelsystem und beugt so Verpilzungen durch Konkurrenz vor. Des Weiteren produzieren die Bakterien einige flüchtige organische Verbindungen (VOC), welche fungizid wirken. Besonders unter Glucoseanwesenheit ist die Produktion der fungiziden VOC sehr hoch. Aufgrund seiner Fähigkeit zur Sekretion extrazellulärer Enzyme wird B. subtilis insbesondere für die Herstellung von Waschmittelenzymen (z. B. Subtilisin), außerdem auch für die Synthese von Riboflavin (Vitamin B2) und des Antibiotikums Bacitracin biotechnologisch genutzt. Bacillus licheniformis (siehe Abb a) ist ein Bakterium, das im Allgemeinen im Boden und auf den Vogelfedern zu finden ist. Es ist ein Gram-positives, thermophiles Bakterium. Sein optimales Wachstum (max Zellen/ml) liegt bei etwa 50 ⁰C und geschieht innerhalb von 5 Tagen (137). Allerdings kann es bei viel höheren Temperaturen überleben. Die optimale Temperatur für die Enzym-Sekretion beträgt 37 ⁰C. Es kann entweder in Form von Sporen vorliegen, um rauen Milieubedingungen zu widerstehen, oder in einem vegetativen Zustand, wenn die Bedingungen gut sind. a) b) Abb. 2.18: Bacillus Spezies, a) B. licheniformis (138), b) B. Polymyxa (139) B. licheniformis wird in Fermentationen verwendet, um große Mengen von Exoenzymen wie Proteasen oder Amylasen wie auch das Antibiotikum Bacitracin zu erzeugen (138). Es synthetisiert eine Protease, die bei hohen ph-werten (9-10) bestehen kann. Diese ist ein gewünschter Bestandteil in Waschmittel, da sie proteinhaltigen Schmutz in der Kleidung entfernen kann, und ebenso aufgrund ihrer

75 Stand von Wissenschaft und Technik 75 Fähigkeit, Schrumpfung und Entfärbung bei niedrigen Temperaturen zu vermeiden. Sehr große Mengen von Proteasen werden als Additive zu Waschmitteln benötigt (138). Es wurde auch die Fähigkeit von B. licheniformis, Federn für landwirtschaftliche Zwecke abzubauen, untersucht. Federn enthalten hohe Mengen an unverdaulichen Proteinen (Federkeratin). Es wird vermutet, dass das Federkeratin durch Fermentation mit B. licheniformis abgebaut werden kann (137) und Federabfälle so zur Produktion von Federmehl als Viehfutter genutzt werden können. B. licheniformis wird üblicherweise mit Lebensmittelverderb und -vergiftung in Verbindung gebracht. Durch Kontamination mit diesem Bakterium wird Brot klebrig und faserig (140). Es kann ebenso Gastroenteritis (über Lebensmittel) sowie Ophthalmitis (Entzündung des Auges) verursachen (141). Bacillus polymyxa (siehe Abb b) ist als Gram-positives fakultativ anaerobes chemoorganotrophes Bakterium weitgehend im Boden vorhanden (142). Es eine der ältesten Spezies der Gattung Bacillus und ein landwirtschaftlich, industriell und medizinisch wichtiger Organismus (143). Z. B. Bredermann (1909), Grau und Wilson, (1962) und Kalisninskaya, (1968) (zitiert nach Nakamura, 1987) haben nachgewissen, dass B. polymyxa ein Stickstoff fixierendes Bakterium ist. B. polymyxa fixiert Stickstoff langsam und assimiliert Ammonium in Glutaminsäure hauptsächlich durch den Glutamat-Dehydrogenase-Weg ohne Energieaufwand (144). Es ist in Böden, Wasser, Milch, Kot und verwesendem Gemüse zu finden (145). Es kann durch die Fermentation von Glucose, Lactose und Glycerin Gas erzeugen (136), (143). Nach Nakamura (1987) synthetisieren Stämme von B. pollymyxa Polymyxin-Antibiotikum, β-amylase und 2,3-Butandiol und sind als Gas bildende Organismen wichtig für den Rotteprozess von Jute. 2.5 Mikroorganismen im Pansensaft Pansensaft ist die im Pansen vorhandene Flüssigphase mit ihren festen Schwebeteilchen und Mikroorganismen. Die Gesamtheit der im Pansen vorkommenden Mikroorganismen wird als Pansenflora und -fauna bezeichnet. Es handelt sich um Bakterien, Protozoen, Pilze, Archaen und Viren. Sie machen etwa 4 Vol.-% des Pansensafts aus. Bakterien und Protozoen sind die Mehrheit der Mikroorganismen, sie machen Mass.-% der gesamten mikrobiellen Substanz

76 Stand von Wissenschaft und Technik 76 aus. Die Temperatur im (lebendem) Pansen liegt im Bereich von ⁰C und der ph-wert zwischen 5,5 und 7,0, was sehr nah am Optimum vieler Enzymsysteme ist (78). Die im Pansen vorkommenden Mikroorganismen hydrolysieren durch mikrobielle Enzyme nicht-strukturelle Kohlenhydrate (Stärke, Zucker und Pektin), strukturelle Kohlenhydrate (Hemicellulose und Cellulose) und stickstoffhaltige Verbindungen (Proteine, Peptide und Aminosäuren). Die o. g. Kohlenhydrate werden zu Monosacchariden oder Disacchariden durch mikrobielle Enzyme abgebaut und so in die Mikroben transportiert werden. Dort können sie zu mikrobieller Biomasse umgebaut, zu den flüchtigen Fettsäuren (FFS) Acetat, Propionat, Butyrat, Lactat oder Valerat fermentiert oder durch Glycolyse oder andere biochemische Wege zu anderen verzweigten FFS zur Energiegewinnung umgesetzt werden. Proteine werden zu Peptiden und Aminosäuren durch mikrobielle Enzyme hydrolysiert und in erster Linie zum Aufbau von Zellbiomasse verwendet. Peptide, Aminosäuren, Ammonium und andere Stickstoffquellen, ursprünglich vorhanden im Tierfutter, können mit wenig bis gar keiner Hydrolyse direkt durch Mikroben verwendet werden. Nicht-Aminosäure-Stickstoff wird für die Synthese von mikrobiellen Aminosäuren verwendet. Bei Stickstoffüberschuss für das mikrobielle Wachstum können auch Proteine und seine Derivate zur Energieerzeugung fermentiert werden. Dadurch wird Ammonium freigesetzt. Lipide, Lignin, Mineralstoffe und Vitamine spielen beim Stoffwechselprozess der Mikroorganismen im Pansen eine weniger wichtige Rolle als Kohlenhydrate und Eiweiß. Lipide werden teilweise hydrolysiert und hydriert, während Glycerin, falls in den Lipiden vorhanden, fermentiert wird. Ansonsten sind Lipide im Pansen inert. Hohe Konzentrationen an Lipiden, insbesondere ungesättigten Lipiden, können für Mikroorganismen giftig sein oder die Gäraktivität unterdrücken. Lignin, eine phenolische Verbindung aus verschiedenen Monomerbausteinen, ist resistent gegenüber Verdauung und kann durch Pilze löslich gemacht werden.

77 Stand von Wissenschaft und Technik 77 Mineralien werden von den Mikroben aufgenommen und sind für das Mikrobenwachstum notwendig. Mikroben synthetisieren viele Vitamine (wie Cyanocobalamin) oft in großen Mengen, so dass sie evtl. Vitaminmangel in der Nahrung des Wiederkäuers ausgleichen können. Im Pansen sind etwa bis Bakterien/ml vorhanden, die überwiegend an den Oberflächen der Nahrungspartikel und des Pansenepithels anhaften. Sie bestehen aus ca. 250 verschiedenen Arten (78), unter anderem Ruminococcus ssp., Lactobacillus ssp., Clostridium ssp. und Bacteroides ssp. In Tab sind die im Rumensaft vorkommenden Bakterien, gegliedert nach abzubauender Substratart, gesondert gekennzeichnet. Eine Auflistung der beteiligten Ruminococcus Spezies zeigt die Tab Ruminococcus flavefaciens und Ruminococcus albus, sowie das (gattungsfremde) Gram-negative Bakterium Fibrobacter (Bacteroides) succinogenes sind die wichtigsten Bakterien für die Auflösung von Cellulose. Dazu wird das von Mikroorganismen produzierte Enzym Cellulase verwendet. Die Cellulase des Fibrobacters ist ein periplasmatisches Enzym, das heißt, es sitzt im Periplasma zwischen den beiden äußeren Zellmembranen. Das Fibrobacter ist somit gezwungen, sich an die Celullosefibrillen zu heften. Tab. 2.14: Ruminoccus sp. (78) R. albus R. hydrogenotrophicus R. bromii R. lactaris R. callidus R. luti R. flavefaciens R. obeum R. gauvreauii R. productus R. gnavus R. schinkii R. hansenii R. torques Die Ruminococcus Spezies hingegen setzen die Cellulase als Exoenzym im Pansensaft frei. Das Polysaccharid Cellulose wird dadurch in einzelne Glucose- Moleküle aufgespalten. Die Glucose wird durch die Bakterien wieder aufgenommen und durch Fermentation (Gärung) als Energiequelle nutzbar gemacht. Die ausgeschiedenen Gärungsnebenprodukte wiederum werden vom Tier als Energiequelle genutzt. Dabei handelt es sich hauptsächlich um Carbonsäuren wie Essigsäure (Acetat) und Ameisensäure (Formiat). Weitere Endprodukte der

78 Stand von Wissenschaft und Technik 78 Fermentation sind Kohlendioxid, Wasserstoff und Wasser. Fibrobacter erzeugt bei der Fermentation zusätzlich Bernsteinsäure (Succinat). Hemicellulosen unterscheiden sich von Cellulose dadurch, dass Hemicellulosen Pentosen, Hexosen und meist Uronsäure enthalten. Hemicellulosen sind Hauptbestandteile der Zellwand von Pflanzen. Organismen, die in der Lage sind, Cellulose zu hydrolysieren, können auch Hemicellulosen verwenden. Allerdings können einige Hemicellulose abbauenden Organismen keine Cellulose hydrolysieren. Dazu gehören unter anderen Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus und Bacteroides ruminícola (siehe Tab. 2.11) (78). Alle cellulolytischen Bakterien sind auch in der Lage, Stärke zu verstoffwechseln, wohingegen einige amylolytischen Mikroorganismen Cellulose nicht verwenden können. Wichtige amylolytische Spezies sind Bacteroides amylophilus, Succinomona amylolítica, Butyrividrio fibrisolvens, Bacteroides Lachnospira multíparus und ruminícola (siehe Tab. 2.11) (78). Neben den beschriebenen Abbauprozessen sind Bakterien auch an der Aufrechterhaltung des Pansenmilieus beteiligt. Die am Epithel haftenden Sauerstoff verzehrenden Bakterien halten das anaerobe Milieu aufrecht. Das negative Redoxpotential von 250 bis 300 mv sorgt dafür, dass der Abbau der Kohlenhydrate nur bis zu den kurzkettigen Fettsäuren und nicht vollständig zu Kohlendioxid und Wasser erfolgt. Die im Pansensaft befindlichen Archaee bilden aus Kohlendioxid und Wasserstoff Methan und senken somit den Wasserstoffpartialdruck im Pansen, was eine übermäßige Bildung von Ethanol und Milchsäure verhindert. Die Protozoen bilden etwa die Hälfte der Biomasse der Pansenflora und setzen sich vor allem aus Wimpertierchen (10 5 bis 10 8 Organismen/ml, vor allem Vertreter der Isotrichidae und Ophryoscolecidae) und in geringerem Maß aus Geißeltierchen (10 3 bis 10 4 Organismen/ml) zusammen. Einige davon sind Bakteriophagen (Bakterienfresser). Obwohl Protozoen für die Pansenfunktion nicht unerlässlich sind, hat ihre Präsenz Einfluss auf die stattfindenden Prozesse. Sie sind in geringem Umfang (ca. 10 Mass.-%) am Kohlenhydratabbau (besonders Stärke und Zucker) und Eiweißabbau beteiligt. Sie können die leicht abbaubaren Kohlenhydrate aufnehmen und verhindern so deren zu schnellen Abbau und damit eine Pansenazidose infolge zu hoher Konzentrationen an organischen Säuren. Außerdem

79 Stand von Wissenschaft und Technik 79 können die Protozoen schädliche Futterbestandteile (toxische Pflanzeninhaltsstoffe und Schwermetalle) abbauen oder binden. Darüber hinaus nehmen die Protozoen Bakterien auf und regulieren damit deren Population. Sie können aber auch für eine ineffiziente Stickstoffnutzung verantwortlich sein. Die Effizienz der Stickstoffnutzung kann durch ein Entfernen der Protozoen aus dem Pansen, der sogenannten Defaunierung, gesteigert werden. Weiterhin begünstigen die Protozoen die Methanbildung, indem sie als Wirt für Methanbildner dienen, die auf der Oberfläche von Protozoen siedeln (146). Pilze machen nur 5-10 Mass.-% der Mikroben im Pansen aus und fehlen bei Fütterungen, die arm an Fasern sind. Ihr Vorkommen gilt ebenfalls als nicht zwingend erforderlich. Trotz ihrer geringen Zahl besetzen die Pilze eine wichtige Nische, weil sie einige Esterbindungen zwischen Lignin und Hemicellulosen oder Cellulose hydrolysieren und somit helfen, Nahrungsbestandteile aufzubrechen. Sie verwerten in geringem Ausmaß lösliche Kohlenhydrate und Proteine und sind auch zur Bildung langkettiger Fettsäuren fähig. Archaea, ca. 3 Mass.-% aller Mikroben im Pansen, sind meist autotrophe Methanogene, die Methan durch anaerobe Atmung produzieren. Der Großteil des Wasserstoffs, der von Bakterien, Protozoen und Pilzen produziert wird, wird von diesen Methanogenen verwendet, um Kohlendioxid zu Methan zu reduzieren. Die Aufrechterhaltung des niedrigen Wasserstoffpartialdrucks durch Methanogene ist unerlässlich für die ordnungsgemäße Funktion des Pansens. Viren sind in unbekannter Anzahl vorhanden und tragen zu keiner Gärung- oder Atmungsaktivität bei. Allerdings lysieren sie Mikroben, und die so freigesetzen Inhaltsstoffe werden wiederum von anderen Mikroben (sog. mikrobielles Recycling) assimiliert oder vergoren. Jedoch ist das Recycling durch die Bakterien räuberischen Aktivitäten der Protozoen quantitativ wichtiger. 2.6 Ballaststoffgehalte in Fruchten Ballaststoffe sind weitgehend unverdauliche Nahrungsbestandteile, meist Polysaccharide, also Kohlenhydrate, die vorwiegend in pflanzlichen Lebensmitteln vorkommen. Sie bestehen aus organischen Verbindungen (Polysaccharide,

80 Stand von Wissenschaft und Technik 80 Oligosaccharide, Lignin und ähnliche Substanzen), welche im Wasser entweder löslich (wie Pektin, Inulin, Gummi und Fructoligosaccharide) (147) oder unlöslich (wie Cellulose, Hemicellulose, Lignin und resistente Stärke) sind. Nach Marlett (1992) beträgt die lösliche Faserfraktion von Früchten im Durchschnitt 13 bis 20 Mass.-% der Ballaststoffe. Der Cellulosegehalt liegt in etwa bei 33 Mass.-% der Ballaststoffe, während der von Hemicellulosen bei 25 bis 35 Mass.-% und der von Pektin zwischen 15 und 30 Mass.-% des Ballaststoffgehalts liegt. Da die faserhaltigen Ballaststoffe üblicherweise biologisch schwer abbaubar und damit schwer zu vergären sind, werden im Folgenden die wesentlichen Ballaststoffe näher beschrieben. Cellulose Cellulose (C6H10O5)n 200 ist ein komplexes nicht verzweigtes Polymer (Polysaccharid). Sie ist der grundlegende strukturelle Bestandteil von pflanzlichen Zellwänden (siehe Abb. 2.19). Bei Einjahrespflanzen macht sie etwa 25 bis 35 Mass.-% und bei Bäumen etwa 40 bis 50 Mass.-% der Zellwand aus. Insgesamt liegt ihr Anteil bei etwa 33 Mass.-% aller pflanzlichen Stoffe (bei Baumwolle und Holz jedoch jeweils 90 und 50 Mass.-%) (148). Abb. 2.19: Aufbau der Zellwand einer Pflanzenzelle (149) Cellulosen sind die häufigsten aller natürlich vorkommenden organischen Verbindungen und auch die häufigsten Polysacchride. Marlett (1992) hat ebenso einen maximalen Cellulosegehalt von etwa 33 Mass.-% der Ballaststoffe in ausgewählten Früchten festgestellt. Wie in Kapitel beschrieben, können

81 Stand von Wissenschaft und Technik 81 Cellulosen durch Cellulase, die nicht in allen Organismen (auch nicht beim Menschen) gebildet werden kann, abgebaut werden. Daher sind sie für den Menschen unverdaulich, aber ein Futtermittel für pflanzenfressende Wiederkäuer (z. B. Kühe, Pferde etc.), da diese das Futter lange genug für die Verdauung durch cellulasebildende Mikroorganismen im Verdauungstrakt behalten (148). Nach Slavin et al. (1981) und Joshi und Agte (1995) können Celullosen hingegen bis zu einem gewissenen Grad vom Menschen verdaut werden. Cellulosen bestehen aus einer linearen Kette von mehreren hundert bis mehr als β-d-glucose-molekülen (β-1,4-o-glykosidische Bindung) bzw. Cellobiose- Einheiten (zwei Glucosen). Die Cellulosemoleküle lagern sich zu höheren Strukturen zusammen, die als reißfeste Fasern in Pflanzen häufig eine Festigkeitsfunktion haben. Cellulosen sind in üblichen Lösungsmitteln unlöslich und zeigen deutliche Eigenschaften der Absorption. Mit konzentrierten Säuren (z. B. Phosphorsäure, Schwefelsäure oder anderen Mineralsäuren) können die Cellulosen bei erhöhter Temperatur ( ⁰C (150) bzw ⁰C (151)) zu Glucose abgebaut werden, indem die glykosidischen Bindungen aufgespaltet werden. Da Cellulosen eine große Anzahl von Hydroxylgruppen enthalten, reagieren sie mit Säuren zu Estern und mit Alkoholen zu Ethern (152). Hemicellulose Hemicellulose ist ein komplexes, verzweigtes Polymer (Polysaccharide), das aus verschiedenen Monosacchariden besteht. Häufig vertreten sind Pentosen (Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen), Xylosen und Arabinosen. Es finden sich auch Hexosen (Zucker mit 6 Kohlenstoffatomen) wie Glucose, Mannose und Galactose (153). Ebenso findet sich sehr häufig D-Mannose in den Hemicellulosen (154). Zusammen mit Cellulosen und Lignin sind Hemicellulosen Hauptbestandteile der pflanzlichen Zellwände, deren Matrix aus fibrillären, teilweise kristallinen Cellulosen besteht (siehe Abb. 2.19). Bei Verholzung ist diese Matrix zusätzlich von dem Makromolekül Lignin durchdrungen und bildet so Lignocellulose. Die Hemicellulosen bilden somit einen Teil der Stütz- und Gerüstsubstanz von Zellwänden und machen 1/4 bis 1/3 der Pflanzenmasse aus (153). Die Monosaccharide der Hemicellulosen sind über β- 1,4-glykosidische Bindungen verknüpft (155). Im Gegensatz zu Cellulosen bestehen Hemicellulosen aus kürzeren Ketten mit 500 bis 3000 Zuckereinheiten. Hemicellulosen lassen sich durch Alkalibehandlung oder

82 Stand von Wissenschaft und Technik 82 kurzzeitige Extraktion mit verdünnter, heißer Mineralsäure lösen. Dadurch werden einfache Zucker gebildet (154). Lignin Lignin ist ein komplexes, phenolisches Makromolekül und ein festes, hoch verzweigtes, zur Gruppe der Phenylpropanoide gehörendes Polymer (kein Polysaccharid), das durch eine irreversible Entfernung von Wasser aus Zuckern gebildet wird. Es wird in die pflanzliche Zellwand eingelagert, bewirkt dort eine Verholzung der Zelle und steigert so die Festigkeit der Zellwand, was einen verbesserten Schutz gegen Angriffe von Mikroorganismen bietet. Nach den Cellulosen ist es die häufigste in Pflanzen vorkommende organische Verbindung (156). Etwa 20 bis 30 Mass.-% der Trockenmasse verholzter Pflanzen bestehen aus Lignin. In Früchten findet es sich meist in den Kernen und Samen. Lignin hat als Stützmaterial und verhärtetes Polymer eine Reihe von wichtigen Aufgaben für die Pflanze. Es ist wesentlich für die Festigkeit von pflanzlichem Gewebe, wobei es vor allem für die Druckfestigkeit von zentraler Bedeutung ist, während die eingelagerten Cellulosefasern die Zugfestigkeit gewährleisten. Es handelt sich also um eine Durchdringung von reißfesten, biegsamen Fasern (Cellulosen) mit einem dichten und starren Polymer als Füllmaterial (Lignin) (157). Aufgrund seiner wenigen polaren Gruppen ist Lignin hydrophob und somit unlöslich in Säuren, aber löslich in starken Alkalien wie Natriumhydroxid. Abgesehen von wenigen Tieren, wie Wiederkäuern, kann Lignin weder verdaut, noch im Verdaungssystem absorbiert bzw. durch die Darmflora angegriffen werden (156). Die exakte Struktur von Lignin ist nicht bekannt, da es schwer aus den Pflanzen zu extrahieren ist und an Cellulosen und anderen Polysacchariden der Zellwand kovalent gebunden ist. Im Gegensatz zu Cellulosen, Stärke oder Gummi, scheinen jedoch die Lignineinheiten nicht in Serien verknüpft zu sein (156). Pektin Pektin ist eine komplexe Mischung aus sauren und neutralen, hoch verzweigten Polymeren (ein Polysaccharid). Nach Sriamornsak (2003) ist die Zusammensetzung und Struktur von Pektin noch nicht vollständig verstanden. Es ist im Wesentlichen ein

83 Stand von Wissenschaft und Technik 83 lineares Polysaccharid und enthält zwischen einigen hundert bis etwa 1000 Saccharideinheiten in einer kettenartigen Konfiguration. Es wird angenommen, dass es hauptsächlich aus D-Galacturonsäure-Einheiten ( 65 Mass.-%) besteht (158), (159) und die Ketten mittels α-1,4 glykosidischer Bindungen verknüpft sind. In Gegenwart von Wasser und in Abhängigkeit von Molekulargröße und Veresterungsgrad bildet Pektin Gele. Pektin kommt in allen höheren Landpflanzen vor. Es findet sich in allen festeren Bestandteilen, z. B. in den Stängeln, Blüten, Blättern etc. (160). Es ist in den Zellmittelllamellen (siehe Abb. 2.19) und den primären Zellwänden enthalten. Dort bestimmt es die Porosität der Zellwände und übernimmt eine festigende und Wasser regulierende Funktion. Pektin ist im Pflanzenreich als Begleitstoff der Cellulosen weit verbreitet (161). Die Pektinzusammensetzung ist nicht nur von Pflanze zu Pflanze unterschiedlich, sondern hängt ebenso von Typ und Alter des Pflanzengewebes ab. Besonders pektinreich sind Pflanzenteile mit relativ zähen/harten Bestandteilen, wie z. B. Zitrusfrüchte oder Fruchtstände von Sonnenblumen. Pektinarm hingegen sind weiche Früchte, z. B. Erdbeeren. 2.7 Stand der Forschung im Bereich der Fermentation der verwendeten Substrate Für die anaerobe Vergärung lassen sich verschiedene organische Substrate, darunter auch Reststoffe, Rückstände bzw. organische Abfälle aus antropogenen Aktivitäten verwenden. Handelt es sich um die sogenannte Trockenvergärung (TS Mass.-%) oder Nassvergärung (TS < 15 Mass.-%), konzentrieren sich die Forschungstätigkeiten zum einen auf das Monitoring der laufenden Anlagen und damit auf die Optimierung der Prozessführung, zum anderen werden Möglichkeiten gesucht, welche weiteren organischen Substrate verwendet werden können und wie aus den zugegebenen Substraten die Biogasproduktion gesteigert werden kann. Dies kann z. B. durch die Zugabe von Enzymen sowie durch verschiedene Möglichkeiten der Substratvorbereitung oder deren Zusammensetzung geschehen. Die Herstellung von effizienten Enzymmischungen mit Hilfe von Pilzen wurde von Hölker (2007) untersucht. Pilze passen ihre extrazellularen Enzyme an das zur

84 Stand von Wissenschaft und Technik 84 Verfügung stehende Substrat an und produzieren so genau die Enzyme, die sie z. B. zum Abbau von langen Zuckerketten benötigen. Geeignete Pilze werden mit dem zu vergärenden Substrat in Kontakt gebracht und nach ausreichender Anpassungszeit (etwa 24 h) mit dem Substrat in den Fermenter gegeben. Dort spalten die Enzyme die organische Masse und machen diese für die Methanbakterien leichter verfügbar. Im Labor konnte damit die Biogasausbeute um % gesteigert werden. Feste Abfälle aus Obst- und Gemüse sind organische Stoffe und daher stellen eine potenzielle Energiequelle dar, wenn sie in Methan umgewandelt werden. Sie sind eine erneuerbare Energiequelle mit einer ausgeglichenen CO2-Bilanz (162). Sie bestehen üblicherweise aus 8-18 Mass.-% Gesamtfeststoffgehalt, wovon Mass.-% organische Trockensubstanz sind, d. h. 6,9-16,6 Mass.-% organische Trockensubstanz des Gesamtgewichtes. Die organische Fraktion enthält 75 Mass.-% biologisch leicht abbaubarer Stoffe (Zucker und Hemicellulosen), 9 Mass.-% Cellulose und 5 Mass.-% Lignin (163). Die Obst- und Gemüsseabfälle werden seit mehreren Jahren in der anaeroben Fermentation als Substrat oder Co-Substrat unter verschiedenen Betriebsbedingungen mit verschiedenen Bioreaktortypen untersucht (77), (10), (7), (162). Die Umwandlungsrate der organischen Substanzen in Biogas liegt derzeit bei etwa Mass.-%. Mit einem zweistufigen System, das aus einem Verflüssigungsreaktor bei thermophilen Temperaturen und einem anaeroben Filter bei mesophilen Temperaturen bestand, wurden z. B. über 95 Mass.-% der organischen Trockensubstanz in Biogas bei einer volumetrischen Rate von 5,65 g ots/(l d) umgewandelt. Dabei wurde eine durchschnittliche Methanausbeute von etwa 420 l/kg ots erreicht (163). Die anaerobe Fermentation von Bananenabfällen ist vielfach unter verschiedenen Bedingungen untersucht worden (164), (162), (165), (166), (167), (168). So wurde in Batchfermenentationsversuchen mit Bananenabfällen und Kokosfasermark eine Reduktion sowohl der TS als auch der ots bei Bananenabfällen um 25,3 Mass.-% bzw. 39,6 Mass.-% und bei Kokosfasermark um 13,6 Mass.-% bzw. 21,6 Mass.-% erreicht. Die erzeugte Biogasmenge war sehr gering und lag bei 9,22 bzw. 1,69 ml/g TS und der durchschnittliche Methangehalt bei 72 Vol.-% bzw. 80 Vol.-% (166). Eine andere Fermentation von Bananenschalen aus verschiedenen

85 Stand von Wissenschaft und Technik 85 Bananensorten unter anaeroben mesophilen Bedingungen erbrachte einen Methanertrag von 0,243 bis 0,322 l/g ots und eine Kinetik (Konstante der Methanproduktionsrate) von 0,071 bis 0,122 /d (162). In anderen Versuchen mit Papayaabfällen wurde eine Reduktion der ots um ca. 20 Mass.-% erreicht (169). Die Rückstände der Nahrungsmittelindustrie eignen sich zum Teil sehr gut für eine Biogaserzeugung. Dazu gehören unter anderem auch Schlachthofabfälle (21). Allerdings muss bei einem Umgang mit organischen Abfällen sehr auf die Hygiene geachtet werden. Popova und Bolotina (1962) zit. nach Buhr und Andrews (1977) behaupteten, dass die Hygienequalität des Faulschlamms der wesentlichste Vorteil des thermophilen Verfahrens ist. Buhr und Andrews (1977) ihrerseits berichteten, dass die erhöhte Abtötungsrate von pathogenen Organismen ein Vorteil der anaeroben Vergärung bei thermophilen Temperaturen ist und was von besonderer Bedeutung im Hinblick auf die Landentsorgung des Faulschlamms ist. Die bei der anaeroben Fermentation verwendeten Bakterien sind empfindlich hinsichtlich der Substratart und -zusammensetzung. Wie in Kap. 2.1 beschrieben und wie Maya-Altamira et al. (2008) postulierten, existieren spezifische Bakterienarten, die sich gegenseitig in ihren Aktivitäten beeinflussen. Nach Hashimoto (1989) sollte bei der Biokonversion von komplexen organischen Substraten, wie Biomassen in Methan, ausreichendes Inokulum vorhanden sein, damit sichergestellt ist, dass der anaerobe Prozess abgeschlossen werden kann. Nach Liu et al. (2009) ist die Inokulumsgröße in der Fermentationsmischung ein wichtiger Faktor, der direkt die Menge an produziertem Methan beeinflusst. Sind die im Inokulum vorhandenen Mikroorganismen höher oder geringer als die benötigten Mengen, kann die Methanproduktion verringert oder sogar gestoppt werden. In der Literatur sind Inokulumsgrößen von 2 % (170) bis 67 % (171) des Fermenterfüllvolumens eingesetzt worden. Nach Raposo et al. (2006) sind unter den Faktoren, die ebenfalls die Reproduzierbarkeit eines zur Bestimmung der anaeroben Biodegradabilität durchzuführenden Tests verletzen können, die Berechnung des Inokulums als Prozentsatz des Fermenterfüllvolumens (ohne Betrachtung der methanogenen

86 Stand von Wissenschaft und Technik 86 Aktivität) und die geringen Substratkonzentrationen. Bei Versuchen im Kleinmaßstab kann dies insgesamt eine Substratmasse von 0,2 bis 0,4 g trockenes Material bedeuten. Bei heterogenem Material sind solche Teilprobemengen kaum reproduzierbar. Allerdings kann dieses Problem mit einer erhöhten Replikatanzahl (>2) reduziert werden. Nach letzten Erkenntnissen (172), (173), (174), (175) ist es jedoch exakter, die Inokulumsgröße durch das Inokulum/Substrat-Verhältnis (auch als Substrat/Inokulum-Verhältnis gekennzeichnet) bezogen auf die jeweilige Masse des ots-gehalts zu ermitteln. Allerdings, wie Raposo et al. (2006) zeigten, ist die Bestimmung der spezifischen methanogenen Aktivität des Inokulums ein zusätzlicher aussagekräftiger Faktor. Zusammenfassend ist der Einfluss des Inokulum/Substrat-Verhältnisses auf die Biogas- und Methanausbeuten im Wesentlichen von der Substrat- bzw. der Inokulumsart und -aktivität abhängig. Das kann ein Grund für die unterschiedlichen, optimalen, ots-bezogenen Inokulum/Substrat-Verhältnisse sein, die in der Literatur (172), (173), (174), (175) zu finden sind. Das Verhältnis, das Owen et al. (1979) als Standard vorschlugen, betrug etwa 1,0 wohingegen Chynoweth et al. (1993) feststellten, dass eine Erhöhung des Verhältnisses für einige Arten von Substraten nötig ist. Hashimoto (1989) studierte den Effekt des ots-bezogenen Inokulum/Substrat- Verhältnisses auf die Batch-Fermentation von gemahlenem Weizenstroh bei mesophilen Temperaturen (35 ± 1 ⁰C) mit vergorener Rindergülle verschieder ots- Konzentrationen als Inokulum. Bei allen ots-konzentrationen der Rindergülle wurde beobachtet, dass ab einem Inokulum/Substrat-Verhältnis über 0,25 sich die Methanausbeute erhöhte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die gasbezogene Leistungsfähigkeit bei ähnlichen Inokulum/Substrat-Verhältnissen bei Rindergülle mit höheren ots-konzentrationen noch anstieg. Die Methanausbeuten lagen zwischen 300 und 330 ml CH4/g otszu. Ausbeuten von 313 ml CH4/g otszu wurden z. B. bei den ots-konzentrationen der Rindergülle von 9,3, 10,2 und 10,3 g/l mit den Inokulum/Substrat-Verhältnissen von jeweils 3,27, 1,38 und 1,21 gewonnen. Tong et al. (1990) untersuchten neben anderen Stoffen das Gärverhalten von sieben lignocellulosehaltigen Materialien (Maisstroh, Napier Gras, holziges Gras, Altzeitung,

87 Stand von Wissenschaft und Technik 87 Weißtannenholz und Weizenstroh) bei mesophilen Temperaturen (35 ⁰C) mit vergorenem Faulschlamm (Primär- und Belebtschlamm einer kommunalen Kläranlage) als Inokulum. Die tägliche Methanausbeute der sieben Substrate erreichte die höchsten Werte zwischen dem 2. und dem 8. Tag und sank danach deutlich. Abgesehen von Altzeitung und Weißtannenholz, bei denen eine maximale Methanausbeute von jeweils 92 bzw. 42 ml CH4/g otszu erreicht wurde, bewegte sich die maximale Methanausbeute zwischen 288 und 360 ml CH4/g otszu. Das otsbezogene Inokulum/Substrat-Verhältnis von allen Versuchen war ca. 0,67. Chynoweth et al. (1993) zeigten, dass die maximale ots-abbaurate verschiedener Substrate wie z. B. mariner, krautiger, holziger Substrate und kommunaler Abfälle mit Rumensaft oder vergorenem Faulschlamm (Primärschlamm einer Kläranlage) als Inokulum bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von 2 erzielt wurde. Gunaseelan (1995) untersuchte die Vergärung von Parthenium bei Raumtemperatur (26 ± 2 ⁰C), d. h. im untereren Bereich der mesophilen Temperaturen. Als Inokulum wurde ausgefaulte Rindergülle aus einem laufenden Fermenter verwendet. Zwei Experimente wurden mit zwei verschiedenen ots-konzentrationen der gleichen Inokulumsart durchgeführt. Bei jeder ots-konzentration wurden unterschiedliche Mengen an Substrat eingesetzt, so dass in jedem Experiment verschiedene Inokulum/Substrat-Verhältnisse untersucht wurden. In beiden Experimenten wurde beobachtet, dass mit zunehmendem ots-bezogenem Inokulum/Substrat-Verhältnis die Biogasproduktionsrate sich beschleunigte und die Methanausbeute anstieg. Die maximalen Methanausbeuten schwankten zwischen 100 und 150 ml CH4/g ots. Bei der kleinen ots-konzentration des Inokulums waren Verhältnisse < 1,7 hemmend, während bei den höhen ots-konzentrationen des Inokulums die Hemmwirkung bei Verhältnissen < 2,4 stattfand. Bei beiden ots-konzentrationen wurde jedoch die gleiche maximale Methanausbeute erreicht. Bei den Versuchen mit der niedrigen ots-konzentration wurde die maximale Methanausbeute bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von 6,87 und bei den Versuchen mit der höheren ots- Konzentration bei einem höheren Verhältnis von 7,88 erreicht. Dies kann auf eine geringere methanogene Aktivität des im zweiten Experiment verwendeten Inokulums zurückgeführt werden.

88 Stand von Wissenschaft und Technik 88 Silva Lopes et al. (2004) verwendeten Rumensaft als Inokulum mit massenbezogenen Inokulum/Substrat-Verhältnissen von 0,17, 0,11 und 0,05, um die Fermentation der organischen Fraktion des Hausmülls bei mesophilen Temperaturen (30 ⁰C) zu studieren. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die verwendete Menge an Inokulum die Leistung des Prozesses wesentlich beeinflußte, d. h. die Biogasausbeute erhöhte sich mit ansteigendem Inokulum/Substrat-Verhältnis. Die maximalen Methanausbeuten lagen bei jeweils 550, 510 und 230 ml/g ots. Raposo et al. (2006) untersuchten das biochemische Methanpotential von grob geschnittenem Futtermais bei mesophilen Temperaturen (35 ⁰C). Als Inokulum wurde anaerober Faulschlamm einer kommunalen Kläranlage mit ots-bezogenen Inokulum/Substrat-Verhältnissen von 1,0, 1,5, 2,0, und 3,0 verwendet. Die maximalen Biogas- und Methanausbeuten von jeweils ca. 398 ml/g ots und ca. 233 ml/g ots wurden mit dem Verhältnis 1 erreicht. Liu et al. (2009) studierten den Effekt des ots-bezogenen Inokulum/Substrat- Verhältnisses auf die Biogasausbeute von Speise- und Grünabfällen und einer 50-50% ots-bezogenen Mischung von beiden Abfällen sowohl bei mesophilen (35 ± 2 ⁰C) als auch bei thermophilen (50 ± 2 ⁰C) Temperaturen mit jeweils mesophilen und thermophilem Faulschlamm einer kommunalen Kläranlage. Die Inokulum/Substrat-Verhältnisse 0,63, 0,32, 0,25 und 0,20 wurden bei thermophilen Temperaturen untersucht, während nur das Verhältnis 0,32 bei mesophilen Temperaturen untersucht wurde. Bei den thermophilen Temperaturbereichen mit den drei Substratarten erhöhten sich die Biogas- und Methanausbeuten mit zunehmendem Inokulum/Substrat-Verhältnis mit den jeweiligen maximalen Biogasund Methanausbeuten und ots-abbauraten beim maximalen verwendeten Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,63. Bei den Speiseäbfallen betrugen die maximalen Biogas- und Methanausbeuten jeweils 778 ml/g ots und 550 ml CH4/g ots, bei den Grünabfällen jeweils 631 ml/g ots und 357 ml CH4/g ots und bei der 50-50% ots-bezogenen Mischung von beiden Abfällen jeweils 716 ml/g ots und 430 ml CH4/g ots. Bei mesophilen Temperaturen waren die Biogas- und Methanausbeuten der drei Substratarten mit dem eingesetzten Inokulum/Substrat-

89 Stand von Wissenschaft und Technik 89 Verhältnis von 0,32 in ca Vol.-% niedriger als die von ihren homologen bei thermophilen Temperaturen. Zhou et al. (2011) beobachteten bei der Vergärung von Abfällen aus der Soyabohnenverarbeitung bei mesophilen Temperaturen (36 ⁰C) mit anaerobem Faulschlamm einer kommulalen Kläranlage, dass die Biogas- und Methanausbeute mit zunehmendem ots-bezogenem Inokulum/Substrat-Verhältnis bis auf ein Maximum am sechsten Tag bei einem Verhältnis von 1,67 anstiegen und danach bei den Verhältnissen 2,0, 2,5, 3,3, 5,0 und 10,0 ein abnehmendes Verhalten aufwiesen. Die maximalen Methanausbeuten bewegten sich zwischen 478 bis 495 ml/g ots. Außerdem stellte er fest, dass Verhältnisse kleiner als 1,0 eine starke Reduktion der Biogas- und Methanausbeuten und der Produktionsraten sowie der ots-abbaugrade (< 28 %) verursachen.

90 Anlass der Forschung 90 3 Anlass der Forschung Zweckmäßigkeit In Mexiko, wie in anderen tropischen und subtropischen Ländern Lateinamerikas, fallen im Bereich der Landwirtschaft vor und nach der Ernte wegen verschiedener Faktoren große Mengen an Obst- und Gemüseabfällen an. Viel davon stammt von Früchten wie Papayas, Bananen, Zitrusfrüchten, Zuckerrohr, Kokos etc., die auf großen Landflächen angebaut werden. Aufgrund der großen Mengen bietet sich die Nutzung dieser Abfälle durch anaerobe Fermentation an. Bei Bananen, Papayas und Zitrusfrüchten kommt es jedes Jahr zu Beschädigungen während der verschiedenen Anbau- bzw. Vermarktungs- und Verarbeitungsschritte. Die wesentlichen Einflussfaktoren sind extreme klimatische Bedingungen, Pflanzenkrankheiten, Plagen (z. B. Heuschrecken) bzw. Schädlinge, Kontaminationen durch Schädlingsbekämpfungsmittel und patogene Mikroorganismen wie Salmonella. Entsprechend gehen zum Teil große Produktmengen verloren, und es entstehen Millionen Tonnen pro Jahr an kommerziell nicht nutzbaren Produkten, von denen derzeit noch ein Großteil ungenutzt entsorgt wird. Nach Orozco-Santos (1991) gehen in Mexiko allein etwa. 1-1,5 Mio. Tonnen/Jahr an Bananen nur durch Plagen verloren. Ählich ist die Situation bei Papayas. So wurden 2009 in Yucatán/Mexiko 800 ha Papayaplantagen durch Dürre, extrem hohe Temperaturen und Plagen zerstört (176). Nach dem mexikanischen Bundesministerium für Landwirtschaft, Viehzucht, ländliche Entwicklung, Fischerei und Ernährung (SAGARPA), (2012) und dem mexikanischen Nationalen Institut für Forstwirtschaft, Landwirtschaft und Viehzucht (INIFAP), (2014) gehen in Mexiko und speziell im Bundesland Yucatan jährlich vor der Ernte unterschiedliche Produktmengen und nach der Ernte ca. 30 Mass.-% der Produktion verloren (siehe Tab und Tab des Anhangs A). Bei Papayas, Bananen und Zitrusfrüchten betrugen die landesweiten Verluste im Jahr 2012 jeweils ca. 0,3, 0,7 und 2 Mio. Tonnen (im Wert von ca. 57, 103 und 227 Mio. Euro) und im Bundesland Yucatán jeweils ca , 300 und Tonnen (im Wert von ca. 1,2, 0,1 und 7 Mio. Euro).

91 Anlass der Forschung 91 Neben dem wirtschaftlichen Verlust geht mit der Entsorgung des organischen Materials eine potentielle Energiequelle verloren. Außerdem treten durch die Zersetzung der beschädigten Früchte Sickerwässer, Gerüche und Insekten auf, welche die Umwelt (Boden, Grundwasser und Luft) belasten und auf die Gesundheit des Menschen negative Auswirkungen haben können. Die direkte Verwendung dieser Abfälle als Dünger in der Landwirtschaft bzw. zur Fütterung von Tieren (z. B. Schweinen) kann zu verschiedenen Problemen, wie z. B. Überdüngung der Landflächen, Ausbreitung von Pflanzenkrankheiten bzw. Übertragung von patogenen Mikroorganismen (wie Salmonella bei Papayas) führen. Ähnlich sieht es bei Abfällen aus den verschiedenen Phasen der Geflügelproduktion aus. Diese fallen über das Jahr hinweg relativ konstant an und nehmen jährlich durch den steigenden Geflügelkonsum noch zu. Allein werden in der Verpackungsanlage einer Geflügelverarbeitungsfirma (Bachoco, S. A., 2014) z. B. derzeit ca. 500 m 3 /Jahr fettiges und zum Teil dickeres Abwasser aus der Schwimmschicht der Kläranlage entfernt und zum großen Teil ohne weitere Behandlung entsorgt. Alle diese organischen Abfälle verursachen, wie bereits erwähnt, Kontaminationen. Ein zusätzliches Problem bei der energetischen Verwertung von organischen Abfällen stellt die teils geringe Verfügbarkeit von Inokulum aus Faulschlamm, das hauptsächlich zum Anfahren eines anaeroben Fermentationsprozesses verwendet wird, in vielen Ländern dar. Die Verdauung von Wiederkäuern wurde als ein sehr hoch entwickeltes, natürliches, Cellulose abbauendes System mit einer Vielzahl von anaeroben und fakultativ anaeroben Mikroorganismen in einem mesophilen Milieu erkannt (177). Da ein gezielter Anwendungsbereich des anaeroben Prozesses der ländliche Raum ist, wo üblicherweise Viehhaltung in großem Umfang betrieben wird, könnte der Panseninhalt bzw. Pansensaft bei einem Mangel an Faulschlamm eine gute Möglichkeit zur Gewinnung von Inokulumsmaterial oder Grundsubstrat darstellen. Um neben dem Problem der Entsorgung organischer Abfälle auch das der in Kap. 1 erwähnten Energieversorgung aktiv angehen zu können, muss nach kombinierten Verfahren gesucht werden, die sowohl den Umweltschutz berücksichtigen als auch wirtschaftlichen wie energetischen Nutzen bieten. Denn fehlende finanzielle

92 Anlass der Forschung 92 Ressourcen verhindern zumeist den Umweltschutz. Wenn dieser jedoch mit Energiegewinnung einhergeht, kann ein längerfristiges Umdenken erfolgen. Die Kombination von anaerobem Abbau organischer Substanzen und der damit verbundenen Biogasgewinnung z. B. zur Stromerzeugung ist ein möglicher Lösungsansatz. Die vorliegende Dissertation zielt darauf ab, einen Beitrag bei der Suche nach einer nachhaltigen Lösung für das mit mehrfachen Auswirkungen gebundene Problem der o. g. Abfälle durch ihre Verwertung als Rohstoff zur Biogaserzeugung sowie dadurch für das Problem der Energieversorgung mittels einer erneubaren Energiequelle zu leisten. Darüber hinaus soll damit die Arbeit dazu beitragen, natürliche Kreisläufe wieder zu schließen. Soziale Relevanz Die betrachteten organischen Abfälle werden durch einzelne Produzenten erzeugt, während ihre Auswirkungen die Umwelt und damit die gesamte Gesellschaft betreffen. Eine mögliche Verwertung dieser Abfälle zur Energiegewinnung würde nicht nur der Gesellschaft durch die damit erwartete Verringerung der Verschmutzungsproblematik und ihrer Folgen zugute kommen, sondern würde ebenso die Produzenten durch den Einsatz des Biogases zur eigenen Strom- und Wärmeerzeugung unterstützen. Die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit liefern keine absolute Lösung für dieses Problem. Wie oben erwähnt, wird es angsetrebt, einen Beitrag in dieser Hinsicht zu leisten. Ähnliche Verhältnisse, insbesondere bezüglich der Wetter-, Substrat- und Konsumbedingungen, können auch in andereren Regionen der Welt gefunden werden. Daher könnte die soziale Projektierung der in Mexiko aktuell und zukünftig gewonnenen Ergebnisse im diesen Bereich auch in die anderen Regionen verbreitet werden. Praktische Bedeutung und Implikationen Vor allem in Entwicklungsländern besteht sowohl großer Bedarf an Umweltschutzmaßnahmen als auch im Bereich der regenerativen

93 Anlass der Forschung 93 Energiegewinnung. Der Standort im Süden Mexikos ist für diese Forschungsarbeit insofern interessant, als hier über das Jahr hinweg annähernd konstant hohe Temperaturen vorherrschen. Da die Biogasproduktion konstante Temperaturen in den Reaktoren erfordert, herrschen daher ideale Bedingungen, um große Mengen an Prozessenergie besonders bei thermophilen Temperaturen (zur Erwärmung der Biogasreaktoren) einzusparen. Die gewonnenen Erkenntnisse dieser Forschungsarbeit könnten auch wichtige Anwendungen bei anderen praktischen Problemen wie bei der Verwertung organischer Abfälle aus der Produktion von Avocados, Ananas etc. finden. Theoretischer Wert Mehrere Studien wurden bereits über die anaerobe Vergärung von organischen Abfällen aus der Landwirtschaft und Geflügelproduktion durchgeführt (178), (164), (162), (165). Dabei sind überwiegend mesophile Temperaturbedingungen zugrunde gelegt. Ebenso sind einige Hefen und Pilze im anaeroben Prozess zur Beschleunigung der Hydrolyse eingesetzt worden. Allerdings ist noch nicht bekannt, in wie weit sich weitere organische Stoffe, die noch nicht zur Biogaserzeugung eingesetzt wurden (wie z. B. die Abfälle aus Papayafrüchten und einer Mischung von Zitrusfrüchten), vergären lassen. Auch im Hinblick auf die Optimierung sind bis heute die mikrobiologischen Prozesse des anaeroben Abbaus in Biogasreaktoren und vor allem der Einfluss von katalytischen Substanzen noch nicht ausreichend erforscht und dokumentiert worden. Bei der Ausnutzung der Vorteile der thermophilen Temperatur (Keimelimination) im anaeroben Prozess gibt es noch offene Fragen, z. B. wie die evtl. mit Keimen kontaminierten organischen Abfälle aus Papaya, Bananen, Zitrusfrüchten und aus der Gefügelproduktion abgebaut und in Biogas umgewandelt werden und wie gut die Protease Papain und eine Mischung von Mikroorganismen aus drei Bacillus Spezien im Prozess reagieren. Im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit wurden daher diese Einflüsse auf den Abbauprozess und die Biogasausbeute untersucht.

94 Anlass der Forschung 94 Eine der Variablen in der anaeroben Fermentation ist die organische Raumbelastung gemessen als kg ots/(m 3 d) oder kg CSB/(m 3 d). Die Verwendung einer höheren Raumbelastung bedeutet nicht unbedingt eine höhere Biogasqualität und quantität. Die optimale organische Raumbelastung hängt hauptsächlich von den Substrateigenschaften ab und entspricht nicht zwangsläufig der maximalen bzw. minimalen Raumbelastung, die eingesetzt werden kann. Bei einer Vielzahl von Substraten, die in der Praxis oder in anderen Forschungsarbeiten eingesetzt wurden, sollte man das Verhalten der abhängigen Variable Biogasproduktion unter verschiedenen Betriebsbedingungen kennen. Ebenso bei einer bestimmten Betriebsbedingung sollte man wissen, welche Eigenschaften der unabhängigen Variablen (z. B. die organische Raumbelastung) die Ergebnisse der abhängigen Variable maximieren (Biogasproduktion). Diese Erkenntnisse bilden die Basis für die in den entsprechenden Kapiteln dargestellten Empfehlungen zu weiteren Studien in dem Bereich. Methodologische Verwendbarkeit In dieser Studie wurden bei der Phase des Kleinmaßstabes etablierte Standardmethoden mit einigen Modifikationen verwendet. So wurde z. B. ein Vakuum im Kopfraum erzeugt und anschließend eine Mischung aus CO2 und N2, zugegeben, um den Unterdruck auf das Medium durch das erstellte Vakuum zu brechen und anaerobe Bedingungen einzustellen. Die Ergebnisse helfen, die Beziehungen zwischen den abhängigen und unabhängigen Variablen (z. B. organische Raumbelastung) zu verstehen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die in den zwei Maßstäben eingesetzten Reaktoren entworfen und gebaut. Obwohl sich die Reaktoren in manchen Aspekten nicht als optimal erwiesen haben, können sie als Basis für Empfehlungen zukünftiger Instrumente für weitere Studien zu diesem Thema dienen. Ebenso soll diese Forschung einen Beitrag leisten zu einer Idee oder einer Option zur Fermentation neuer Substrate bzw. zur Optimierung des Prozesses.

95 Aufgabenstellung und Zielsetzung 95 4 Aufgabenstellung und Zielsetzung 4.1 Allgemeine Zielsetzung Ziel dieser Arbeit ist es, den anaeroben Abbauprozess ausgewählter Abfallsubstrate aus der Landwirtschaft und der Geflügelindustrie mit Hilfe spezieller Mikroorganismen und Enzyme bei thermophilen Temperaturen zu evaluieren. 4.2 Spezifische Zielsetzung Die Evaluierung des o. g. Abbauprozesses wurde in zwei verschiedenen Versuchsmaßstäben durchgeführt. Dafür wurden Reaktoren im Kleinmaßstab zur Evaluierung der anaeroben Bioabbaubarkeit und im Großmaßstab zur Evaluierung des allgemeinen anaeroben Prozesses ausgewählter Abfallsubstrate verwendet. Im Folgenden werden die entsprechenden spezifischen Zielsetzungen dieser Versuchsmaßstäbe behandelt Reaktoren im Kleinmaßstab (Durchstechflaschen) 1. Entwurf und Aufbau der Reaktoren 2. Evaluierung des potentiellen anaeroben Abbauprozesses ausgewählter Abfallsubstrate (aus Papayas, Bananen und Zitrusfrüchten) und aus den verschiedenen Bereichen der Geflügelfleischproduktion (Brutanlage, Geflügelfarm, Schlachthof und Verpackungsbetrieb) 2.1 Untersuchung des Einflusses verschiedener Bioadditive (Rumensaft, drei Bacillus-Spezies, Papain) und verschiedener Kombinationen zwischen ihnen auf den Anaerobprozess bei jedem Abfallsubstrat 2.2 Bestimmung der maximalen Biogasmenge, des ots-abbaugrades und der Biogasausbeuten bei jeder Mischprobe Reaktoren im Großmaßstab 1. Entwurf, Konstruktion und Aufbau der Reaktoren 2. Evaluierung des anaeroben Abbauprozesses ausgewählter Abfallsubstrate (aus Papayas, Bananen und Zitrusfrüchten) und aus dem Verpackungsbereich der Geflügelindustrie mit Hilfe von Rumensaft 3. Bestimmung der maximalen Biogasmenge, des ots-abbaugrades und der Biogasausbeuten bei jedem Abfallsubstrat

96 Hypothesen 96 5 Hypothesen 5.1 Reaktoren im Kleinmaßstab Zur Aufstellung der Hypothesen dieses Versuchsmaßstabs wurden folgende Variablen bei jedem Abfallsubstrat verwendet: Raumbelastung Bioadditiv Biogasmenge Die Variable Raumbelastung bezieht sich auf die drei verwendeten organischen Raumbelastung (3, 6 und 9 g ots/l). Zur Vereinfachung der statistischen Auswertung werden unter der Variable Bioadditiv sowohl die Mischproben mit Einzelverwendung (P, B, R) und mit Kombiniertverwendung (PB, PR und PBR) der Bioadditive als auch die Mischprobe ohne Bioadditiv (KTL) verstanden. Die Variable Biogasmenge bezieht sich auf die mittlere erzeugte Biogasmenge der drei Ansätze jeder ergebende Mischprobe. Den Hypothesen liegen zwei statistische Modelle zugrunde. Ein erstes Modell zum Vergleich der mittleren erzeugten Biogasmengen aller Mischproben (bei jedem Abfallsubstrat) und ein zweites Modell zum Vergleich der mittleren erzeugten Biogasmengen aller Mischproben (bei jeder Raumbelastung). Daraus und nach der statistischen Theorie sind die folgenden Hypothesen entstanden, wobei jeweils H0 die Hypothese null und H1 die Hyphothese alternativ ist und die Indizes a, b, c, d die Hypothesen unterscheiden: Bei jedem Abfallsubstrat H0-a : Die Biogasmenge ist bei allen Bioadditiven gleich H1-a : Die Biogasmenge ist bei mindestens einem Bioadditiv verschieden H0-b : Die Biogasmenge ist bei allen Raumbelastungen gleich H1-b : Die Biogasmenge ist bei mindestens einer Raumbelastung verschieden

97 Hypothesen 97 H0-c : Die Biogasmenge ist bei allen Interaktionen (die wechselseitige Beeinflussung von jedem Bioadditiv mit jeder Raumbelastung) gleich H1-c : Die Biogasmenge ist bei mindestens einer Interaktion verschieden Bei jeder Raumbelastung: H0-d : Die Biogasmenge ist bei allen Abfallsubstraten gleich H1-d : Die Biogasmenge ist bei mindestens einem Abfallsubstrat verschieden 5.2 Reaktoren im Großmaßstab Die einbezoge Variable zur Aufstellung der Hypothesen dieses Versuchsmaßstabs war bei jedem Substrat die Biogasmenge, die bei den eingesetzten Raumbelastungen erzeugt wurde. Den Hypothesen liegt dadurch nur ein statistisches Modell zum Vergleich der erzeugten Biogasmengen bei den verschiedenen verwendeten Raumbelastungen jedes Abfallsubstrats zugrunde. Daraus sind die folgenden Hypothesen entstanden: H0-e : Die Biogasmenge ist bei allen Raumbelastungen gleich H1-e : Die Biogasmenge ist bei mindestens einer Raumbelastung verschieden

98 Anwendungsbereich der Ergebnisse 98 6 Anwendungsbereich der Ergebnisse Wie bereits erwähnt, zielt diese Forschungsarbeit darauf ab, einen Beitrag bei der Suche nach einer Lösung für die Probleme der Entsorgung organischer Abfälle und dessen Folgen sowie damit für die Probleme der jetzigen und zukünftigen Energieversorgung zu leisten. Die Arbeit soll das mögliche Potential bisher wenig beachteter Abfallsubstrate zur Biogasherstellung verdeutlichen. Dabei sind insbesonderere Fruchtabfälle aus Pflanzen, die in tropischen, subtropischen oder trockenheißen Gebieten gedeihen und angebaut werden, von Interesse. Die Biogasgewinnung unter Verwendung regional häufig vorkommender und bislang weitgehend ungenutzter Biosubstrate soll mit Hilfe kostengünstiger und praxistauglicher Verfahren leicht anwendbar und umsetzbar sein. Dadurch soll zudem die Umwelt geschont und gleichzeitig die Lebensqualität durch bessere oder günstigere Energieversorgung verbessert werden. Denn Motor für die Entwicklung eines Landes sind Energie und gesunde Umwelt- und Lebensbedingungen. Die erhaltenen Ergebnisse beider Versuchsmaßstäbe liefern Erkenntnisse, die behilflich und anwendbar sein können für die Region sowie für Regionen mit ähnlichen Verhältnissen (besonders bezüglich der Wetter-, Abfallsubstrat- und Konsumbedingungen). Sie sind Grunderkenntnisse, die auf andere Maßstäbe übertragen werden oder als Basis für weitere zukünftige Studien zur anaeroben Fermentation anderer organischer Abfallsubstrate aus der Landwirtschaft dienen können. Fachlich bezogen können sie in den Bereichen der Abfallbeseitigung, Energieversorgung, Düngerherstellung sowie der Biogastechnik, Biotechnologie, Biochemie eine Anwendung finden.

99 Verwendete Materialien und Methoden 99 7 Verwendete Materialien und Methoden 7.1 Allgemeines Abb. 7.1 zeigt die Versuchsplanung. Diese bezieht sich auf drei Versuchsphasen in drei verschiedenen Maßstäben: Klein-, Mittel- und Großmaßstab im Verhältnis 1:100:200. In der ersten Phase wurden zu Test- und Abschätzungszwecken die Gärversuche im Mittelmaßstab in Plexiglasreaktoren durchgeführt. In der zweiten Phase wurden die Versuche im Kleinmaßstab in Durchstechflaschen zur Evaluierung der anaeroben Abbaubarkeit der organischen Abfälle angesetzt. In der dritten Phase wurden Edelstahlreaktoren im Großmaßstab zur Untersuchung der anaeroben Fermentation ausgewählter Abfälle verwendet. Die erste Versuchsphase fand im Umweltlabor des Lehrstuhls für Energie- und Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie der TU München statt, während die zweite und dritte Phase an der Facultad de Ingeniería (FI) der Autonomen Universität Yucatán (UADY) in Mérida, Mexiko, durchgeführt wurden. Während jeder Versuchsphase wurden Mischproben, die aus zwei oder mehr Materialien erstellt wurden, vergoren. Als Hauptmaterialien wurden verschiedene Substrate unterschiedlicher Herkunft verwendet. Die Substrate wurden entweder durch Stichproben an den jeweiligen Entstehungsorten beschafft oder als Mischung aus den bei einer Anlage gleichzeitig entstehenden Abfällen in einem definierten Mischungsverhältnis erstellt. Die jeweiligen Trockensubstanzgehalte der zu vergärenden Mischproben wurden mit destilliertem Wasser eingestellt. Abb. 7.1 stellt ebenso die verschiedenen Analysen und Messungen dar, die vor, während und nach den Versuchen durchgeführt wurden. Da die erste Phase nur zu Test- und Abschätzungszwecken diente, werden die Daten im Anhang behandelt. Im Folgenden werden nur die Materialien und Methoden der zweiten und dritten Versuchsphase beschrieben.

100 Verwendete Materialien und Methoden Phase: Versuche zu Test- und Abschätzungszwecken Reaktorentwurf und -herstellung n Charakterisierung von Einzelsubstraten durch physikalisch-chemische Analysen (TS, ots, CSB, N, P) und einige bromatologische Analysen Substrate: 1) Papayaabfälle 2) Bananenabfälle 3) Zitrusmischung (Grapefruit, Orangen, Mandarinen, Limonen) Monitoring von Temperatur und Biogasmenge einige physikalisch-chemische und chromatographische Analysen Substrate: 1) Papayaabfälle 2) Bananenabfälle 3) Zitrusmischung (Grapefruit, Orangen, Mandarinen, Limonen) 4) Geflügelbrutabfälle 5) Hühnermist 6) Geflügelschlachtabwasser 7) Abwasser aus Geflügelverpackungen 2. Phase: Batchversuche im Kleinmaßstab in Durchstechflaschen von 125 ml Reaktorentwurf und -herstellung Physikalisch-chemische Analyse (TS, ots, CSB, N, P) und mikrobiologische Analyse von gemischten Proben n Monitoring von Temperatur und Biogasmenge Physikalisch-chemische Analyse (TS, ots, CSB, N, P) und mikrobiologische Analyse von gemischten Proben Substrate: 1) Papayaabfälle 2) Bananenabfälle 3) Zitrusmischung (Grapefruit, Orangen, Mandarinen, Limonen) 4) Abwasser aus Geflügelverpackungen 3. Phase: Versuche im Großmaßstab in Reaktoren von 25 Litern Reaktorentwurf und -herstellung n=12 Monitoring von Temperatur, Biogasmenge, ph und Redox Physikalischchemische Analysen (TS, ots, CSB, N, P) von entnommenen Proben Legende: TS: Trockensubstanzgehalt ots: organischer Trockensubstanzgehalt CSB: chemischer Sauerstoffbedarf N: Gesamtstickstoff P: Gesamtphosphor Abb. 7.1: Versuchsplanung

101 Verwendete Materialien und Methoden Verwendete Materialien Eingesetzte Substrate Als Substrate für die jeweiligen Fermentationen der o. g. Versuchsphasen wurden Stichproben von folgenden Früchten und Abfällen der Geflügelproduktion verwendet: 1) Papayas 2) Zitrusmischung (Grapefruit, Orangen, Mandarinen, Limonen) 3) Bananen 4) Geflügelbrutabfälle 5) Hühnermist 6) Geflügelschlachtabwasser (mit geringen Anteilen von Federn und Hühnermist) 7) Abwasser aus einer Geflügelverpackungsanlage Mit Ausnahme der Substrate 4 bis 6, die nur in den Versuchen im Kleinmaßstab (zweite Phase) verwendet wurden, wurden alle weiteren Substrate sowohl in den Versuchen im Kleinmaßstab (zweite Phase) als auch in den im Großmaßstab (dritte Phase) eingesetzt. Die Stichproben der verwendeten Früchtsorten (Substrate 1 bis 3) wurden nach Bedarf in einem Großmarkt für Obst und Gemüse (Central de abastos de Mérida) besorgt. Der Zustand schwankte von reif bis überreif. Die Früchte wurden mit den Schalen in Stücke von 2 bis 5 mm zerkleinert und bei 4 o C für wenige Tage bis zu ihrer Verwendung gelagert. Bei Zitrusfrüchten (Substrat 2) wurde eine Mischung aus Grapefruit, Orangen, Mandarinen, Limonen zubereitet. Die Menge jeder Frucht wurde nach gleichem ots-gehalt berechnet. Die Stichproben der Substrate 4 bis 7 wurden der Produktionskette einer Geflügelverarbeitungsfirma (Bachoco S. A. de C. V.) entnommen. Bei Geflügelbrutabfällen wurden sowohl Stichproben von den Brutrückständen als auch vom Abwasser, das zur Reinigung der Inkubationskörbe dient, aus der Brutanlage der Firma genommen. In den Brutrückständen waren hauptsächlich nicht ausgebrütete Eir sowie Eierschalen vorhanden. Zur Erstellung des zu untersuchenden Substrats wurden hier die Rückstände maschinell mit einem Haushaltsgerät (Hackmaschine) in Stücke mit einem Durchmesser < 5 mm zerkleinert. Nach der Charakterisierung (Bestimmung wesentlicher Parameter wie

102 Verwendete Materialien und Methoden 102 TS- und ots-gehalt) des Abwassers und der Rückstände wurden die zu untersuchenden ots-konzentrationen der Geflügelbrutabfälle mit bestimmten Abwassermengen eingestellt. Die Stichprobe des Hühnermists wurde in einer repräsentativen Geflügelfarm des o. g. Unternehmens gewonnen. Der Gehalt an geringen Mengen an Federn und Holzwolle in der Stichprobe war ersichtlich. Beim Geflügelschlachtabwasser wurden Stichproben aus verschiedenen Bereichen der Schlachtanlage desselben Unternehmens genommen. Beim Schlachtprozess entstehen üblicherweise Abwasser, Federn und Hühnermist. Ins Abwasser gelangen organische Rückstände (Hühnerkörperteile und Blut). Federn werden zur Verwertung getrennt erfasst, während der Hauptteil des Hühnermists als Sonderabfall entsorgt wird. Allerdings entstehen Rückstände davon, die in den Abfall gelangen. Als Abwasserstichproben wurden Proben von der schwimmenden, fetthaltigen halbfesten Schaumschicht, die sich an der Oberfläche des Fettabscheiders der Kläranlage bildet, gewonnen. Stichproben der Rückstände von Federn und Hühnermist wurden aus den Abfallcontainern genommen. Zur Erstellung des zu untersuchenden Substrats wurde dann die halbfeste Abwasserstichprobe mit einer entsprechenden Menge an Federn und Hühnermist gemischt. Die zu untersuchenden ots-gehalte des gemischten Substrats wurden dann mit destilliertem Wasser eingestellt. Beim Abwasser aus einer Geflügelverpackungsanlage wurden Stichproben aus der Kläranlage der Verpackungsanlage gleicher Firma genommen. Die Proben wurden ebenso von der schwimmenden, fetthaltigen halbfesten Schaumschicht, die sich an der Oberfläche des Abwassers der Kläranlage bildet, gewonnen. Die zu untersuchenden ots-gehalte dieses Substrats wurden mit destilliertem Wasser eingestellt. Während die Stichprobe des Hühnermists im ürsprunglichen Zustand bei Raumtemperatur bis zu ihrer Verwendung aufbewahrt wurde, wurden die Proben der anderen Substrate der Geflügelproduktion bei 4 o C für wenige Tage bis zu ihrem Einsatz gelagert.

103 Verwendete Materialien und Methoden Charakterisierung und Nährstoffzusammensetzung der Substrate Die verwendeten Substrate wurden in frischen Zuständen zur Bestimmung ihrer Haupteigenschaften charakterisiert. Bei der Charakterisieung wurden insbesondere ph-wert, TS, ots, CSB, N und NH3-N ermittelt. Der Tab. 7.1 sind die Ergebnisse davon zu entnehmen. Tab. 7.1: Eigensachften der frischen Substrate Substrat TS ots CSB N NH 3 -N ph g/kg % g/kg % mg/kg % mg/kg % mg/kg Papayas 3,97 88,28 8,83 80,80 8, ,21 9, ,67 0,15 N. D. Bananen 4,59 209,45 20,94 189,00 18, ,41 31, ,08 0,19 N. D. Grapefruit 3,24 162,08 16,21 154,75 15, ,89 33, ,48 0,18 N. D. Orangen 3,43 150,33 15,03 143,77 14, ,05 26, ,21 0,17 N. D. Mandarinen 3,64 145,05 14,50 138,52 13, ,19 24, ,99 0,23 86,91 Limonen 2,75 136,44 13,64 130,36 13, ,58 15, ,53 0,15 110,33 Zitrusmischung 3,20 148,47 14,85 116,70 14, ,43 24, ,80 0,18 98,62 Geflügelbrutabfälle (gemahlt) 7,00 720,45 72,05 170,19 17,02 Geflügelbrutabwasser 7,78 0,99 0,10 0,32 0,03 28,56 0,00 Hühnermist 7,26 720,75 72,08 594,61 59, ,63 39, ,51 2, ,20 Geflügelschlachtschaum 5,00 524,92 52,49 510,71 51, ,79 178, ,28 0,22 N. D. Federn (gemahlt) 5,75 556,04 55,60 541,99 54, ,82 54, ,88 7, ,61 Geflügelmist (beim Schlachten) 4,99 159,84 15,98 144,36 14, ,19 23, ,72 0, ,23 Abwasser aus Geflügelverpackungen 4,54 291,33 29,13 574,12 28, ,10 187, ,93 0,24 N. D. Rumensaft (pur) 50,98 5,10 41,38 4, ,78 4, ,71 0,12 588,00 Rumensaft (gesiebt) 26,90 2,69 12,94 1, ,67 3,26 745,54 0,07 359,33 Rumensaft (gedruckt aus Panseninhalt) 7,09 36,86 3,69 25,94 2,59 N. D.: Nicht detektiert Abgesehen von Geflügelbrutabfällen, Geflügelbrutabwasser, Hünermist und Rumensaft weisen alle Frischsubstrate ph-werte im sauren Bereich auf. Bei den Fruchtsubstraten zeigt Papaya die niedrigsten Werte von TS, ots und CSB, während Bananen und Grapefruit bei allen Parametern und Mandarinen nur beim Gesamtstickstoff die höchsten Werte aufweisen. Außer Geflügelbrutabwasser haben alle anderen Substrate der Geflügelproduktion höhere Werte in allen ermittelten Parametern als die andereren verwendeten Substrate (Papayas, Bananen, Grapefruit etc.). So sind z. B. die ots-gehalte der Geflügelbrutabfälle und des Hühnermists im Vergleich mit denen der Fruchtsubstrate und des Rumensaftes deutlich höher. Zugleich weisen Geflügelbrutabfälle und Hühnermist höhere TS-Gehalte als die anderen Substrate der Geflügelproduktion auf. Der niedrigere organische Anteil der Geflügelbrutabfälle im Vergleich zu denen der anderen Substrate der Geflügelproduktion (außer Geflügelmist) kann auf den Gehalt an Eierschalen zurückgeführt werden. Federn weisen den höchsten Gehalt an

104 Verwendete Materialien und Methoden 104 CSB und Gesamtstickstoff auf. Wie in Kap. 2.4 beschrieben, enthalten Feder hohe Mengen an Proteinen (137), welche aus Aminosäuren (dabei Stickstoff haltige Aminogruppen) aufgebaut sind. Das kann der Grund für den hohen Stickstoffgehalt sein. Bei der Charakterisierung konnten dazu auch einige Eigenschaften des Bio- Additivs Rumensaft mit ermittelt werden. Der TS- und ots-gehalt des puren Rumensaftes liegt jeweils bei 5,10 und 4,14 Mass.-%. Nach der Siebung verringerte der TS-Gehalt um 47,25 % auf 2,7 Mass.-% und ots-gehalt um 57,25 % auf 1,77 Mass.-%. Bezüglich der Nährstoffgehalte ist nach dem National Nutrient Database for Standard Reference of the United States Department of Agriculture (USDA), (2011) die Nährstoffzusammensetzung der verwendeten Früchte in Tab. 7.2 zusammengestellt. Tab. 7.2: Nährstoffzusammensetzung der Substrate nach USDA (179) Substrate* Papaya Bananen Grapefruit Orangen Mandarinen Limonen Zitrusmischung Carica Musa Citrus Citrus Citrus Citrus paradisi Papaya acuminata sinensis reticulata limon Nährstoff (in 100 g) Einheit Refuse 38 Refuse 50 % Refuse 26 % % (Schale Refuse 36 % (Schale, Hülse, Refuse 1 % Refuse 2 % (Schale und (Durchschnitt) und (Schale) Samen und (Samen) (Samen) Samen) Samen) Membran) Hauptbestandteile Wasser g 88,06 74,91 90,89 82,30 85,17 85,59 85,99 Energie kcal 43,00 89,00 32,00 63,00 53,00 37,28 46,32 Energie kj 179,00 371,00 134,00 262,00 223,00 155,96 193,74 Proteine g 0,47 1,09 0,63 1,30 0,81 1,28 1,01 Fette g 0,26 0,33 0,10 0,30 0,31 0,30 0,25 Kohlenhydrate g 10,82 22,84 8,08 15,50 13,34 12,39 12,33 Ballaststoffe g 1,70 2,60 1,10 4,50 1,80 6,39 3,45 Gesamtsucker g 7,82 12,23 6,98 10,58 3,27 5,21 Saccharose g 0,00 2,39 6,05 Glucose (Dextrose) g 4,09 4,98 2,13 Fruktose g 3,73 4,85 2,40 Laktose g 0,00 0,00 0,00 Maltose g 0,00 0,01 0,00 Galaktose g 0,00 0,00 0,00 Stärke g 0,00 5,38 0,00 Asche g 0,39 0,82 0,31 0,60 0,38 0,44 0,43 Mineralien Kalzium, Ca mg 20,00 5,00 12,00 70,00 37,00 74,08 48,27 Eisen, Fe mg 0,25 0,26 0,09 0,80 0,15 0,68 0,43 Magnesium, Mg mg 21,00 27,00 8,00 14,00 12,00 10,99 11,25 Phosphor, P mg 10,00 22,00 8,00 22,00 20,00 13,88 15,97 Kalium, K mg 182,00 358,00 139,00 196,00 166,00 145,14 161,54 Natrium, Na mg 8,00 1,00 0,00 2,00 2,00 3,76 1,94 Zink, Zn mg 0,08 0,15 0,07 0,11 0,07 0,14 0,10 Kupfer, Cu mg 0,05 0,08 0,05 0,06 0,04 0,06 0,05 Mangan, Mn mg 0,04 0,27 0,01 0,04 0,02 0,02 Selen, Se µg 0,60 1,00 0,30 0,70 0,10 0,53 0,41 Fluorid, F µg 2,20 1,00 *Nährwerte und Gewichte sind von essbaren Anteilen

105 Verwendete Materialien und Methoden 105 Bei allen Früchten liegt der Proteingehalt im Bereich von 0,47 bis 1,30 Mass.-%. Fette machen mit Werten zwischen 0,1 und 0,33 Mass.-% den geringsten Anteil aus, während der Kohlenhydratgehalt im Bereich von ca. 8 bis 23 Mass.-% liegt. Wie Marlett (1992) nachgewiesen hat, liegt der Ballaststoffgehalt der essbaren Fraktion frischer Früchte zwischen 1 und 3 Mass.-%. Die genannten Standardwerte der Nährstoffzusammensetzung sollen hier aber der Orientierung dienen, da sie sich meistens auf Früchte ohne Schale bzw. Samen beziehen und bei den in dieser Arbeit durchgeführten Gärversuchen alle Fruchtteile vergärt wurden. Wie in Tab. 7.2 bei Orangen und Limonen gezeigt wird, erhöhen Schalen und Samen hauptsächlich den Gehalt an Ballaststoffen. Sie bestehen aus organischen Verbindungen (Polysaccharide, Oligosaccharide, Lignin und ähnliche Substanzen), welche im Wasser entweder löslich (wie Pektin, Inulin, Gummi und Fructoligosaccharide) (147) oder unlöslich (wie Cellulose, Hemicellulose, Lignin und resistente Stärke) sind. Nach Marlett (1992) beträgt die lösliche Faserfraktion von Früchten im Durchschnitt 13 bis 20 Mass.-% der Ballaststoffe. Der Cellulosegehalt liegt in etwa bei 33 Mass.-% der Ballaststoffe, während der von Hemicellulosen bei 25 bis 35 Mass.-% und der von Pektin zwischen 15 und 30 Mass.-% des Ballaststoffgehalts liegt. Gemäß USDA (2011) beträgt der Gehalt an Ballaststoffen in frischen Orangen mit Schale ca. 4,5 Mass.-% (siehe Tab. 7.2) und ohne Schale 2,4 Mass.-%. In Orangenund Limonenschalen aber beträgt der Ballaststoffgehalt etwa 10,6 Mass.-%. Nach Ross et al. (1985) ist der Pektingehalt in Orangen höher als in anderen Früchten (Apfel, Pfirsich und Erdbeere). Nach Eisenbrand und Schreier (2006) beträgt der Pektingehalt in frischen Orangen zwischen 0,5 und 3,5 Mass.-% und in Zitrusschalen (aus Orangen und Zitronen) 30 Mass.-%. Nach May (1990) liegt der Pektingehalt in Zitrusschalen etwa Mass.- %. In der industriellen Produktion wird Pektin hauptsächlich aus Zitrusfrüchten, in erster Linie aus Zitronenschalen unter sauren Bedingungen bei ph-werten zwischen 1,3 bis 3,0 und einer erhöhten Temperatur von ⁰C extrahiert (160), (180). Im Hinblick auf den Gehalt an Proteinen, Fetten und Kohlenhydraten wurden einige spezifische verwendete Substrate mittels der in Tab. 7.7 aufgeführten Laboranalyse charakterisiert. Die Ergebnisse sind in Tab. 7.3 dargestellt. Bei Zitrusmischung

106 Verwendete Materialien und Methoden 106 ähneln Proteine und Fette die jeweiligen durchschnittlichen theoretischen Werte von USDA (2011), während der Kohlenhydratgehalt sich vom jeweiligen durchschnittlichen theoretischen USDA-Wert unterscheidet (siehe Tab. 7.2). Dies kann auf die gegenseitigen Einflüsse der verschiedenen Inhaltsstoffen der gemischten Zitrusfrüchte zurückgeführt werden. Tab. 7.3: Gehalt an Proteine, Fette und Kohlenhydrate spezifischer Substrate Nährstoff (%) Zitrusmischung Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage Rumensaft (gedruckt aus Panseninhalt) Proteine 1,02 3,67 0,38 Fette 0,68 27,15 0,09 Kohlenhydrate 3,86 Nicht gefunden Nicht gefunden Wie im Kap erwähnt, handelte es sich bei dem Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage um ein fetthaltiges Material aus der schwimmenden Schaumschicht der Kläranlage der Geflügelverarbeitungsfirma. Durch die Laboranalyse konnte der hohe Gehalt an Fett in diesem Substrat bestätigt werden, während Kohlenhydrate wie beim Rumensaft, nicht gefunden wurden. Dieser Rumensaft war das Bioadditiv, das in den Reaktoren im Großmaßstab verwendet wurde. Wie in Kap beschrieben wird, wurde der Rumensaft aufgrund des größeren benötigten Volumens aus den Panseninhalten mehrerer, frisch geschlachteter Rinder durch manuelles Auspressen und Sieben gewonnen, was die faserigen Anteile zurückhielte. Die Abwesenheit von Kohlenhydraten in diesem Substrat kann in der Zurückhaltung dieser Anteile liegen. Bei Hühnermist liegen in der Literatur einige durchschnittliche Nährstoffzusammensetzungen vor, die, obwohl sie nicht vollständig den gleichen Verhältnissen (Nahrung, Zuchtart etc.) entsprechen, als Orientierungswerte betrachtet werden können. Nach Damarys (2010) sind im Hühnermist 17,4 Mass.-% an Proteinen, 1,3 Mass.-% an Fetten und 15,2 Mass.-% an Kohlenhydraten vorhanden. Bei den anderen verwendeten Abfallsubstrate aus der Hühnerproduktion wie Geflügelbrutabfällen und Geflügelschlachtabwasser kann man sich ein Bild von den vorhandenen Nährstoffe und deren Konzentrationen machen, wenn man sich die Nährstoffe von rohem Hühnerfleisch betrachtet, weil diese durch den

107 Verwendete Materialien und Methoden 107 Produktionsprozess in die Abfälle bzw. Abwässer gelangen. Nach Honikel (1994) beträgt z. B. der Eiweißgehalt im Hähnchenfleisch etwa 20,6 Mass.-% und der Fettgehalt ca. 3,1 Mass.-%. Nach Seuß-Baum (1998) ist der Gehalt an Kohlenhydraten im Fleisch sehr gering (0,2 Mass.-%). Man kann demzufolge erwarten, dass höhere Mengen an Eiweiß in den Geflügelbrutabfällen sowie im Geflügelschlachtabwasser und Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage zu finden sind. Allerdings kann der Gehalt an Fett bei den letzten zwei Substraten noch höher liegen, da die Stichproben, wie oben beschrieben, jeweils im Fettabscheider und in der schwimmenden, fetthaltigen Schaumschicht der Kläranlage genommen wurden. Zudem hat das Fleisch auch als Lieferant von Spurenelementen insbesondere von Zink und Eisen eine große Bedeutung. Im Geflügelfleisch sind beispielweise ca. 2 mg Eisen bzw. Zink/100 g Muskelfleisch enthalten (181), (182) Verwendete Bioadditive Gemäß der Zusammensetzungen augewählter Substrate, der wesentlichen Prozessbedingungen (Anaerobmilieu und thermophiler Temperaturbereich) sowie der wesentlichen Abbauprozesse jeder Anaerobphase wurden die verwendeten Bioadditive zweckorientiert ausgewählt. Bei der Auswahl wurde angestrebt, dass jedes Bioadditiv möglichst viele Wechselwirkungen mit mehreren Bestandteilen (Proteine, Kohlenhydrate, Fette, Ballaststoffe etc.) der verwendeten Substrate in den spezifischen Phasen des Anaerobprozesses aufweist. Allerdings sollte es sich nicht um universelle Bioadditive handeln. Es sollte aber untersucht werden, ob sich die kombinierte Wirkung der Bioadditive vorteilhaft (verstärkend) oder schädlich für den Anaerobprozess herausstellt. Entsprechend wurden die drei Hauptbioadditive Papain (P), Bacillus (B), Rumensaft (R) sowie ihre Kombinationen PB, PR, BR und PBR als Bioadditive verwendet. Sie wurden mit Ausnahme des Rumensafts für die Versuche der zweiten Phase im Kleinmaßstab in den Durchstechflaschen ausgewählt. Rumensaft wurde ebenso in den Versuchen im Großmaßstab der dritten Phase in den Reaktoren eingesetzt, da er eine entscheidende Rolle bei der Biogaserzeugung in der zweiten Phase spielte, wie im Kapitel 8 (Ergebnisse und Diskussion) behandelt wird. Die in den Kapiteln 2.3.5, 2.4 und 2.5 beschriebenen Eigenschaften der Hauptbioadditive sind in Tab. 7.4 zusammengefasst.

108 Verwendete Materialien und Methoden 108 Tab. 7.4: Zusammenfassung der allgemeinen Eigenschaften der verwendeten Bioadditive Bioadditiv Papain Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Bacillus polymyxa Rumensaft Eigenschaften - hauptsächlich als Cystein-Endopeptidase (EC ): katalysiert die Hydrolyse der Peptidbindungen (109) Wirkung auch als (112): - Esterase: katalysiert die Hydrolyse der Esterbindungen - Thioesterase (EC 3.1.2): katalysiert die Hydrolyse der Esterbindungen an der Thiolgruppe - Transesterase: katalysiert den Transfer einer Estergruppe von einem Molekül zu einem anderen - Transamidase (EC 2.6.1): katalysiert den Transfer einer Amidgruppe von einem Molekül zu einem anderen - aerobes und fakultativ anaerobes Bakterium (134) - besitzt großes Arsenal an Glukan- und Proteinabbauenden Enzymen zum Abbau komplexer Polysaccharide und unverdaulicher Oligosaccharide von pflanzlichem Material (135) - kann weder Glucose noch Lactose fermentieren (136). Es kann Glucose nur unter Anwesenheit von Nitrat als Elektronenakzeptor fermentieren (183) - kann durch extrazelluläre Amylasen Stärke hydrolysieren (136) - Aerobes und fakultativ anaerobes Bakterium (183) - kann Exoenzymen wie Proteasen oder Amylasen erzeugen (138) - Abbau von unverdaulichen Federproteinen (Keratin) (137) - kann Zucker in Abwesenheit von exogenen Elektronenakzeptor fermentieren (183) - einige Stämme (NCIB 6346) können eine saure Fermentation von Glucose mit oder ohne Nitratanwesenheit zur Acetatproduktion durchführen. Dabei wird Ammonium und molekularer Stickstoff (durch sein Nitritreduktase-Enzym) produziert (183) - aerobes und fakultativ anaerobes Bakterium (183) - synthetisiert das Enzym β-amylase (143) - fixiert Stickstoff (184), (185), (186): Reduziert Nitrat zu Nitrit (143) - assimiliert Ammonium (144) - kann Casein, Pektin, Stärke (durch extrazelluläre Amylasen (136)) und Xylan (Bestanteil der Hemicellulose) hydrolysieren (143) - produziert Gas (143). kann Glucose, Lactose, Glycerin fermentieren (136), (143) - anaerobe Bakterien (ca. 50 Mass.-% der Biomasse der Pansenflora) aller Phasen des Anaerobprozesses (10 10 bis Bakterien/ml); wichtigste celluloseauflösende Bakterien: Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus und Fibrobacter succinogenes wichtige hemicelluloseabbauende Bakterien: Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira multiparus und Bacteroides ruminícola wichtige amylolytische Bakterien: Bacteroides amylophilus, Succinomona amylolítica, Butyrividrio fibrisolvens, Bacteroides Lachnospira multíparus und ruminícola Arbeitsbedingungen Temperatur ph-wert - 4,0-7,0 (maximale Wirkung) (112) - relativ hitzebeständig - optimaler Temperaturbereich: ⁰C (112) - 40 ⁰C (optimales Wachstum) (134) - hitzeresistent (> 45 ⁰C) - > 45 ⁰C - 50 ⁰C (optimales Wachstum) (137) - überlebt bei noch höheren Temperaturen ⁰C - < 2,8 (instabil und irreversible Inaktivierung) (112) - 2,8 (kritisch) (112) - saure und alkalische Bedingungen - saure und alkalische Bedingungen - saure Bedingungen - Protozoen (ca Mass.-% der Biomasse) Wimperntierchen ( /ml) und Geißeltierchen ( /ml) bauen Eiweiße und leicht abbaubare Kohlenhydrate ab und verhindern so ⁰C - 5,5-7,0 Azidoze wegen zu hoher Menge an organischen Säuren; können toxische Pflanzeninhaltsstoffe und Schwermetalle abbauen oder binden; regulieren die Bakterienpopulation - Pilze (ca Mass.-% der Biomasse) verwerten in geringem Ausmaß lösliche Kohlenhydrate und Proteine und bilden langkettige Fettsäuren; hydrolysieren Esterbindungen zwischen Lignin und Hemicellulosen oder Cellulosen; lösen Lignin auf - Archaea (3 % Mass.-% der Biomasse) bilden CH 4 aus CO 2 und H 2 und verhindern eine übermäßige Bildung von Ethanol und Milchsäure - Viren (Anzahl unbekannt) regulieren auch die Bakterienpopulation (mikrobielles Recycling)

109 Verwendete Materialien und Methoden 109 Die Erstellung bzw. Gewinnung der Bioadditive wird im Folgenden beschrieben: Bei dem verwendeten Papain handelte es sich um eine im Labor hergestellte Grundlösung von kommerziellem Papain und destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 200 mg/l, bei Bacillus um eine Grundlösung vom Bacillus-Pulver WA3 der Firma AliBio S.A. de C.V. und destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 10 mg/l. Im Bacillus-Pulver waren Bacillus licheniformis, Bacillus polimyxa und Bacillus subtilis enthalten. Der Rumensaft für die Versuche im Kleinmaßstab wurde direkt von einer Kuh des Viehhofs der Fakultät für Veterinärmedizin der UADY durch eine auf ihren Bauch mehrere Jahre zuvor angepasste Fistel übernommen (siehe Abb. 7.2). Die Kuh wurde nur mit frischem Gras und Wasser und nicht später als acht Stunden vor den Probenahmen gefüttert. Abb. 7.2: Gewinnung der Rumensaftproben Die Probe des Rumensafts wurde in einem sterilisierten Kunstoffcontainer gesammelt und ins Labor der FI-UADY transportiert. Anschließend wurde der Saft durch ein Haussieb abgetropft, um Fasern und Feststoffe zu entfernen, und in einem Inkubatorschrank bei ca ⁰C bis zu seinem Einsatz aufbewahrt. Der Rumensaft für die Versuche im Großmaßstab in den Reaktoren wurde aufgrund des größeren benötigten Volumens aus den Panseninhalten mehrerer, im Schlachthof der o. g. Fakultät frisch geschlachteter gesunder Rinder durch manuelles Auspressen und Sieben gewonnen. Für seinen Transport ins Labor der FI-UADY wurden sterilisierte Kunstoffcontainer verwendet. Anschließend wurde er in spezifisch berechneten Mengen frisch und direkt in die Reaktoren als Impfmaterial beim Anfahrprozess eingebracht.

110 Verwendete Materialien und Methoden Verwendete Reaktoren Reaktoren im Kleinmaßstab (Durchstechflaschen) Als Fermenter im Kleinmaßstab kamen Durchstechflaschen mit einem Volumen von 125 ml zum Einsatz. Zu ihrer Abdichtung wurden ein Septum und ein Aluminiumring eingesetzt. Zur Biogasentnahme und -Messung wurden sterilisierte Glasspritzen mit 5 ml (BD Yale, Dickinson Ind. Quirúrgicas, Brasil) mit Hilfe eines in stopper am Septum (siehe Abb. 7.3) verwendet. Dieses Hilfsmittel sollte die Anzahl der Injektionen zur Biogasentnahme optimieren. Zur Abdichtung wurde Epoxidharz mit Zugabe eines Härters eingesetzt. Um die Temperaturbedingungen und die Durchmischung einzustellen, wurde ein Schüttelinkubator (Hersteller New Brunswick Scientific Co. Inc., Edison, N.J. USA) verwendet, wo die Flaschen plaziert wurden. Abb. 7.3: Inkubation der Reaktoren im Schüttelinkubator Reaktoren im Großmaßstab Für die Versuchsphase im Großmaßstab wurden Stahlblechreaktoren mit einem Volumen von 25 l bei thermophiler Temperatur (55 ⁰C) und einer mechanischen kontinuierlichen Durchmischung von 30 1/min verwendet. Bei den Stahlblechreaktoren handelte es sich um 15 Reaktoren, die im Rahmen dieser Forschungsarbeit entworfen, konstruiert und gebaut wurden. Jeder Reaktor wurde mit einem Durchmesser von 30 cm und einer Höhe von 70 cm mit drei Füßen konzipiert (siehe Abb. 7.4 a und b). Die oberen 30 cm wurden zylinderförmig und die unteren 20 cm konisch ausgebildet und mit einem Absperrhahn versehen, um die spätere Schlammentnahme zu erleichtern. Auf dem Deckelblech wurden jeweils vier

111 Verwendete Materialien und Methoden 111 Kupferrohrbügel als Heizelemente (Innendurchmesser 10 mm) angeordnet, die bis in den konischen Bereich des Reaktors reichten. Im Rahmen dieser Studie wurde jedoch nur einer der vier Bügel als Heizelement genutzt. Dieser beinhaltete ein elektrisches Heizelement. Die anderen drei wurden für den späteren Anschluss von Heißwasserleitungen geplant, so dass jeder Reaktor auch z. B. mit über Solarkollektoren erwärmtem Wasser im weiteren Verlauf der Forschungstätigkeiten beheizt werden könnte. Des Weiteren befinden sich auf dem Deckelblech jeweils ein verschließbarer Einfüllstutzen (Durchmesser 5 cm) zur Substratbeschickung, ein Gasauslassstutzen und ein Rührwerksmotor mit Propellergestänge und zwei Flügeln im Innenraum des Reaktors (siehe Abb. 7.4 a). Kuferrohr für Heißwasserleitung Schlammauslasshahn a) b) b) Abb. 7.4: a) Schematischer Aufbau des Reaktors, b) Foto des gebauten Reaktors Die Temperatur der Reaktoren wurde über einen Temperatursensor im zentralen Reaktor gemessen. Temperatur und Rührwerksgeschwindigkeit wurden von zwei zentralen Kontrollschränken, bestückt mit Thermostaten und Stromtransformatoren, gesteuert. Die Messung und Sammlung des Biogases in jedem Reaktor erfolgte jeweils über einen Gaszähler und einen mit Aluminium beschichteten Gasbeutel (siehe Abb. 7.5 a). Die Gasentnahme erfolgte über einen Auslassstutzen, an dem der

112 Verwendete Materialien und Methoden 112 Gaszähler angebracht wurde. Dabei strömte das erzeugte Biogas in ein Plexiglasgefäß, das mit einer Flüssigkeit (Silikonöl) gefüllt war, und hob dort einen Schwimmer an. Der Schwimmer löste nach einer definierten Hubstrecke (das hier auf ein Gasvolumen von 50 ml kalibriert wurde) einen Kontakt aus und drehte so das Zählwerk um eins weiter. Die Anzahl der Kontakte, die auf der Anzeige wiedergegeben wurde, multipliziert mit 50 ml, ergab das erzeugte Biogasvolumen. Zum Schutz des Gaszählers und seiner Elektrik vor der Witterung wurde er in einer wasserdichten Kunststoffbox direkt neben dem Reaktor untergebracht (siehe Abb. 7.5 b und c). Die Gaszähler stammten von der TU München. Um die elektrischen Installationen auf dem Deckelblech jedes Reaktors gegen die Witterung, d. h. Regenfälle und Morgentau, zu schützen, wurden Zinkblechwannen als leicht abnehmbare Deckel auf die Reaktoren aufgesetzt (siehe Abb. 7.9). b) a) c) Abb. 7.5: a) Gaszähler und -beutel, b) Reaktor mit Gaszählerbox, c) Gaszähler im Gaszählerbox

113 Verwendete Materialien und Methoden Verwendete Methoden Verwendete Methoden bei den Reaktoren im Kleinmaßstab Wie in Kapitel beschrieben, bestand das Untersuchungsziel dieses Versuchsaufbaues darin, einen einstufigen Vergärungsprozeß durch verschiedene Sonderfaktoren (Bioadditive) phasenspezifisch zu beeinflussen. So sollten das Enzym Papain und die drei Bacillus Spezies hauptsächlich die Hydrolyse beeinflussen. Die Mikroorganismen des Rumensaftes sollten aufgrund ihrer vielfältigen Fähigkeiten alle vier Phasen des Prozesses beeinflussen (siehe Abb. 7.6). Kohlenhydrate Proteine Fette Zucker Aminosäuren Fettsäuren Kohlensäure und Alkohole Wasserstoff Kohlendioxid und Ammonium Wasserstoff Essigsäure und Kohlendioxid Methan Kohlendioxid Hydrolyse Acidogenese Acetogenese Methanogenese Enzym (Papain) Mikroorganismen (Bacillus Spezies) Mikroorganismen vom Rumensaft Abb. 7.6: Einflussbereiche der geplanten Maßnahmen Versuchsanordnung Eine Übersicht der Anordnung der Gärversuche der zweiten Phase stellt Abb. 7.7 dar. Es handelte sich um Batchversuche in o. g. Durchstechflaschen von 125 ml bei thermophilen Temperaturen (55 ⁰C). Es wurden drei Ansätze pro Mischprobe gefahren, um den experimentellen Fehler zu reduzieren, die Zuverlässigkeit zu erhöhen und repräsentative Ergebnisse zu erhalten. In jeder Flasche wurden 100 ml für das zu vergärende Substrat und 25 ml als Headspace für das Biogas vorgesehen. Es wurden drei verschiedene Raumbelastungen (3, 6 und 9 g ots/l) in den Flaschen untersucht.

114 Verwendete Materialien und Methoden 114 Abb. 7.7: Zweite Phase: Batchversuche im Kleinmaßstab in Durchstechflaschen von 125 ml Erstellung der Mischproben in den Durchstechflaschen Bei der in Kap erwähnten Charakterisierung wurde der ots-gehalt jedes Substrats ermittelt. Die eingesetzten Frischsubstratmengen, die zur Einstellung der in 100 ml Füllvolumen untersuchten Raumbelastungen verwendet wurden, wurden anhand der ots-gehalte der Substrate errechnet und werden in Tab. 7.5 dargestellt. Die Erstellung der Mischproben erfolgte, wie Tab. 7.6 zeigt. Die Frischsubstratmengen wurden in die Flaschen gefüllt und mit destilliertem Wasser zuerst auf 80 ml verdünnt. Die übrigen 20 ml wurden für die einzelnen oder kombinierten Bioadditive bzw. nur für destilliertes Wasser (bei den Blindproben, KTL) verwendet. Jeweils 6,67 ml wurden von einem, zwei oder drei der Hauptbioadditive zu den verdünnten Substraten in jeder Flasche zugegeben. Anschließend wurden je nach Versuchsandordnung (Zugabe von einem oder zwei Bioadditiven) die Flaschen mit 13,34 ml bzw. 6,67 ml destilliertem Wasser aufgefüllt, so dass das Füllvolumen 100 ml entsprach und damit die zu untersuchenden Raumbelastungen jeweils eingestellt wurden. Zu den Blindproben wurde dementsprechend lediglich 20 ml destilliertes Wasser zugegeben. Geflügelbrutabfälle Geflügelschlachtabwasser Abwasser aus Geflügelverpackungen Legende 1= Blindprobe (Kontrolle) = KTL 2= S + Papain = P 3= S + Bacillus Spezies = B 4= S + Rumensaft = R 5= S + P + B = PB 6= S + P + R = PR 7= S + B + R = BR 8= S + P + B + R = PBR Papayaabfälle Bananenabfälle Zitrusmischung Hühnermist g ots/l 6 g ots/l 9 g ots/l Substrate (S): 2. Phase: Batchversuche im Kleinmaßstab in Durchstechflaschen von 125 ml bei thermophilen Temperaturen (55 ⁰ C) in Dreifachbestimmung

115 Verwendete Materialien und Methoden 115 Tab. 7.5: Zusammensetzung und Mengen der verwendeten Substrate Einzustellende Raumbelastungen (g ots/l) Substrat Zusammensetzung 3,00 6,00 9,00 Frische Substratmenge (g) Papayaabfälle 3,7100 7, ,1400 Bananenabfälle 1,5900 3,1700 4,7600 Grapefruit 0,4840 0,9680 1,4520 Zitrusmischung Orangen 0,5216 1,0432 1,5648 Mandarinen 0,5425 1,0850 1,6275 Limonen 0,5750 1,1500 1,7250 Geflügelbrutabfälle Abwasser 79, , ,2390 Brutrückstände 1,6152 3,3806 5,1459 Hühnermist 0,5000 1,0100 1,5100 fetthaltiger halbfester Schaum 0,4552 0,9104 1,3656 Geflügelschlachtabwasser Hühnergülle 0,0227 0,0454 0,0681 Feder 0,0091 0,0182 0,0273 Abwasser aus Geflügelverpackungen 0,5200 1,0500 1,5700 Tab. 7.6: Gäransätze (jeweils dreifache Versuchsdurchführung) Mischprobe 80 Vol.-% 6,67 Vol.-% 6,67 Vol.-% 6,67 Vol.-% 1 H 2 O H 2 O H 2 O KTL 2 P H 2 O H 2 O P 3 H 2 O B H 2 O B Substrat Vergärungsvolumen 100 ml 20 Vol.-% Bioadditive Behandlung (Akronym) 4 H 2 O H 2 O R R 5 P B H 2 O PB 6 P H 2 O R PR 7 H 2 O B R BR 8 P B R PBR Sobald die Reaktoren mit einem Septum und einem Aluminiumring abgedichtet waren, wurde im Kopfraum ein Vakuum mittels einer sterilisierten Spritze erzeugt. Zur Sicherstellung der anaeroben Bedingungen wurde dann in jede Flasche ein inertes Gas zudosiert, das aus CO2 und N2 im Verhältnis 30:70 (v:v) zusammengestellt war. Der interne und externe Druck wurde durch eine sterilisierte Glasspritze (BD Yale, Dickinson Ind. Quirúrgicas, Brasil) ausgeglichen, die ebenso für die Biogassammlung verwendet wurde. Bei allen Versuchsflaschen wurde das Biogas durch entprechende sterilisierte Glasspritzen täglich aufgefangen und gemessen. Die jeweiligen Gärungen wurden beendet, sobald keine signifikante Biogasproduktion mehr beobachtet wurde.

116 Verwendete Materialien und Methoden Verwendete Methoden bei den Reaktoren im Großmaßstab Dieser Teil der Forschungsarbeit fand auf dem Versuchsgelände der Facultad de Ingeniería der UADY in Mérida, Mexiko, (siehe Abb. 7.8) statt. Beim Vesuchsgelände handelt es sich um ein umzäuntes, ca. 20 x 20 m großes Grundstück mit Stromanschluss (110 V, 220 V und Drehstrom) und fließendem Wasser. Zum Schutz der elektrischen Einrichtungen vor Witterungseinflüssen steht eine zeltartige, mobile Überdachung zur Verfügung. Abb. 7.8: Versuchsgelände an der Facultad de Ingeniería der UADY Versuchsanordnung Abb. 7.9 stellt eine Übersicht der Anordnung der Reaktorenreihe der dritten Phase dar. Diese Versuchsphase wurde mit 12 Reaktoren durchgeführt, die in 4 Serien gegliedert waren. Aufgrund gleicher statistischer Prinzipien, wie diejenigen bei den Versuchen im Kleinmaßstab (siehe ), wurde jede Serie mit drei Ansätzen (Triplikate) gefahren. Die Serien wurden von 1 bis 4 und die Ansätze von A bis C durchnummeriert (siehe Abb. 7.9). Über einen Temperatursensor, der sich im Behälter 3A befand, wurde die Elektroheizung geregelt. Die auf 30 1/min eingestellten Rührwerke in den Reaktoren waren bis auf eine Stunde pro Tag kontinuierlich in Betrieb. In den grauen Kunststoffkisten neben den Reaktoren befanden sich die Gaszähler. In den einzelnen Versuchsserien wurden verschiedene Substratarten und -mengen untersucht, wobei Rumensaft als Mikroorganismenquelle diente. Dieses Bioadditiv wurde ausgewählt, da es sich bei den Versuchen im Kleinmaßstab als

117 Verwendete Materialien und Methoden 117 leistungsfähigeres bzw. biogasfördernderes Bioadditiv als die anderen Bioaddtive erwiesen hatte. 3. Phase: Versuche im Großmaßstab in Reaktoren mit 25 Litern bei thermophilen Temperaturen (55 ⁰C) 1A 2A 3A 4A Legende Serien: 1 = Zitrusmischung 2 = Papayaabfälle 3 = Bananenabfälle 4 = Abwasser aus Geflügelverpackungen A, B, C = Dreifachbestimmung 1B 1C 2B 2C 3B 3C 4B 4C Abb. 7.9: Dritte Phase: Reaktorenreihe (Schema und Foto der Versuchsanordnung) Beschickungsweise und -grade Bezüglich der Beschickung handelte es sich bei der anaeroben Vergärung aller Abfallsubstrate um halbkontinuierliche Versuche mit unterschiedlichen Beschickungsgraden und damit verbundenen unterschiedlichen Raumbelastungen in verschiedenen Zeiträumen. Die Frischsubstratmengen, die den Reaktoren beschickt wurden, orientierten sich an den ots-gehalten der einzelnen Substrate Probenahme Zur Beurteilung und Kontrolle der in den Reaktoren stattfindenden anaeroben Prozesse wurde regelmäßig (einmal pro Woche zur gleichen Uhrzeit) aus jedem Reaktor eine Substratprobe durch den unteren Auslasshahn genommen. Dazu wurden etwa 350 ml des Reaktorinhalts in Kunstoffgefäße abgefüllt. Um repräsentative Daten zu erhalten, wurden die ersten abgefüllten 350 ml wieder in die Reaktoren zurückgeführt und erst die nächsten 350 ml beprobt. Dadurch wurde

118 Verwendete Materialien und Methoden 118 gewährleistet, dass die Proben nicht nur das im konischen Reaktorboden abgelagerte Material, sondern auch Substrat aus dem Reaktorkörper enthielten Feldparameter Als Feldparameter werden die Parameter bezeichnet, die entweder direkt bei den Reaktoren oder in den genommenen Proben noch auf dem Versuchsgelände gemessen wurden. Diese Parameter waren Temperatur, Gasproduktion, ph-wert und Redoxpotential (ORP). Temperatur und Gasproduktion wurden täglich gemessen. Die Temperatur wurde automatisch über den o. g. Temperatursensor erfasst und mit einem Quecksilberthermometer manuell kontrolliert. Dazu war in jedem Reaktor ein Thermometer in einem der für den Anschluss von Heißwasserleitungen vorgesehenen Kupferbügel eingelassen (siehe Kapitel ). Um Ungenauigkeiten bei der Temperaturmessung zu vermeiden, wurden die Bügel mit destilliertem Wasser gefüllt. Durch dieses Monitoring wurden die Temperaturen festgehalten und große Schwankungen vermieden. Die tägliche Gasproduktion wurde über die im Kapitel beschriebenen Gaszähler abgelesen. Nach dem Ablesen wurden die Zähler wieder auf Null gestellt. Der ph-wert und das Redoxpotential wurden wöchentlich in den frischen Proben gleich nach der Probennahme vor Ort mittels eines Multifunktionsgerätes ( Hydrolab der Firma Hydrolab Corp., Texas, USA) gemessen. Dazu wurden die Messfühler des Messgerätes in die Substratprobe getaucht. Nach exakt einer Minute wurden die Werte von der digitalen Anzeige abgelesen und notiert Verwendete analytische Methoden Die unterschiedlichen Proben beider Versuchsmaßstäbe wurden auf verschiedene Parameter untersucht. Unter diesen Parametern waren der Trockensubstanzgehalt, der organische Trockensubstanzgehalt, der chemische Sauerstoffbedarf, der Gesamtstickstoff, der Gesamtphosphor sowie die Protein-, Fett-, Kohlenhydrat- und Ballaststoffgehalte. Wie Tab. 7.7 zeigt, wurden die entsprechenden Analysen nach verschiedenen Standardmethoden bzw. Normen aus Deutschland, USA und Mexiko durchgeführt.

119 Verwendete Materialien und Methoden 119 Tab. 7.7: Verwendete Methoden bei den Versuchen im Kleinmaßstab und Großmaßstab Paramenter 1) Trockensubstanzgehalt und organischer Trockensubstanzgehalt Methode 2. Phase (Kleinmaßstab) 3. Phase (Großmaßstab) 2540 B / E: Solids dried at 105 ⁰C / 550 ⁰C (187) 2) Chemischer 5220 D: Closed reflux, colorimetric method (187) Sauerstoffbedarf 3.1) Schnelltest TNT plus-828 (Hach- Lange Company) 3) Gesamtstickstoff 3.2) 4500-Norg (B): TKN Macro-Kjeldahl (187) 4) Gesamtphosphor 4500-P, B(4), C: Acid colorimetric (187) 5) Gasproduktion in E (ASTM (188), 2001) und die Methode Batchversuchen von Owen et al., (1979) 6) Fettsäuren 7) Proteingehalt 8) Fettgehalt Gas-Chromatographie: Interner Standard (nach TUM) NMX-F-608-NORMEX-2002 (189) / NMX-Y-118-SCFI-2001 (190) NMX-F-615-NORMEX-2004 (191) / NMX-Y-103-SCFI-2004 (192) 9) Kohlenhydratgehalt NOM-086-SSA (193) 10) Ballaststoffgehalt NMX-Y-094-SCFI-2001 (194) Aufgrund nicht vorhandener Geräte sowie kostenaufwändiger Analyse wurde die Bestimmung von Protein-, Fett-, Kohlenhydrat- und Ballaststoffgehalten nur zur Charakterisierung spezieller Substrate (Zitrusmischung, Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage und Rumensaft) lediglich einmalig bei einem zertifizierten Labor durchgeführt. Bei den herkömmlichen Fruchtsubstraten (Papayas, Bananen, Orangen, Grapefruit, Mandarinen und Limonen) wurden der Literatur die o. g. Zusammensetzungen zur Orientierung entnommen (siehe Tab. 7.2). Die erzeugten Biogasvolumina beider Versuchsmaßstäbe wurden stets nach den Gesetzen von Boyle-Mariotte und Charles auf Normbedingungen von Temperatur und Luftdruck gemäß DIN1343 wie folgt umgewandelt: P 1 V T 1 1 P 2 V 2 T 2 V 2 P 1 V 1 T 2 P 2 T 1 Darin sind: T1: Temperatur in K am Ort der Biogasproduktion P1: Luftdruck in mm Hg am Ort der Biogasproduktion (= 756,21 mm Hg) V1: Volumen des erzeugten Biogases T2: 273 K

120 Verwendete Materialien und Methoden 120 P2: Luftdruck in mm Hg auf Meereshöhe (= 760 mm Hg) V2: korrigiertes Volumen des erzeugten Biogases Daraus erfolgt: V 2 756,21 V1 (0 273) = 0,9128 V1 760 (24,6 273) Nach der Umrechnung der erzeuten Bruttobiogasvolumina wurden sie zu weiteren Ermittlungen verwendet. Die Gaszusammensetzung der Gasproben aus den Reaktoren beider Versuchsmaßstäbe konnte aufgrund technischer Probleme im Chromatograph (Undichtigkeiten in der Säule und im Säulenzubehör) nicht ermittelt bzw. nicht genau ermittelt werden, ebenso war die Bestimmung der Fettsäuren in den Proben des Kleinmaßstäbs infolge elektrischer Probleme (hohe Spannung und Überhitzung im Spannungsregler) nicht möglich. Bei den Fettsäureanalysen des Großmaßstäbs wurde ein Gaschromatograph der Fa. Perkin Elmer mit der Kapillarsäule HP-INNOWax, 30 m, 0,25 mm 0,25 µm und einem Flammenionisationsdetektor (FID) verwendet, während bei den Gasanalysen zur Bestimmung der Gaszusammensetung ein Gaschromatograph der Fa. Varian mit einer Packed Säule Restek ShinCarbon ST 80/100, 2 m, 22 mm und einem FID eingesetzt wurde. Da die Versuche im Großmaßstab halbkontinuierlich durchgeführt wurden, können ihre Ergebnisse nicht in 100 % mit denen der Versuche im Kleinmaßstab verglichen werden, da diese als Batch-Versuche gefahren wurden. Das Gleiche gilt im Vergleich zu anderen Batch-Versuchen anderer Autoren wie die von z. B. Hickey et al. (1989), Kallaghan et al. (1999), Raposo et al. (2006), usw. sowie umgekehrt die Ergebnisse des Kleinmaßstabs im Vergleich mit denen anderer Versuchsart. Allerdings werden diese im Hinblick auf dieses Merkmal nur zur Orientierung und unabhängig von der Versuchsart verglichen Verwendete statistische Methoden Um signifikante Differenzen zwischen den Ergebnissen erzeuter Gesamtgasvolumina (dabei zwischen den verwendeten unterschiedlichen Einflussfaktoren) zu bestimmen,

121 Verwendete Materialien und Methoden 121 wurden die Ergebnisse beider Versuchsmaßstäbe auf verschiedene statistische Methoden analysiert und verglichen. Wie Tab. 7.8 zeigt wurden die Ergebnisse der Gasmessungen je nach Zutreffen bestimmter statistischer Voraussetzungen bzw. Annahmen nach verschiedenen Standardmethoden analysiert Parametrische Methoden Die parametrischen Methoden (der parametrischen Statistik) leiten Aussagen über eine unbekannte Population unter der Voraussetzung her, dass die Beobachtungen aus einer Familie vorgegebener Wahrscheinlichkeitsverteilungen (oft: der Normalverteilung) stammen, deren Elemente bis auf einen (endlich dimensionalen) Parameter eindeutig bestimmt sind (195). Wie Tab. 7.8 zeigt, wurde von den parametrischen Methoden bei den meisten Versuchen im Kleinmaßstab die Varianzanalyse (ANOVA, von Englisch ANalysis Of VAriance) verwendet. Als ANOVA bezeichnet man eine große Gruppe datenanalytischer und strukturprüfender statistischer Verfahren. Ihnen gemeinsam ist, dass sie Varianzen und Prüfgrößen berechnen, um Aufschlüsse über die hinter den Daten steckenden Gesetzmäßigkeiten zu erlangen. Die Varianz einer Zielvariable (univariate ANOVA) oder mehrerer Zielvariablen (multivariate ANOVA d. h. MANOVA) wird dabei durch den Einfluss einer oder mehrerer Einflussvariablen erklärt. Die Zielvariablen werden als abhängige Variablen und die Einflussvariablen als Faktoren oder unabhängige Variablen bezeichnet. Die Faktoren können eine oder mehrere Kategorien (Stufen) besitzen. Für die Darstellung der Effekte der Faktoren benutzt man je nach Versuchsbedingung mehrere mathematische Modelle. Die Anwendung verschiedener Formen der ANOVA ist jeweils an Voraussetzungen gebunden, deren Vorliegen vor jeder Berechnung geprüft werden muss. Allgemein gelten die Normalverteilung und die Varianzhomogenität (Homoskedastizität) der Stichprobenvariablen. Zur Überprüfung liegen mehrere graphische sowie statistische Verfahren vor, wobei die Residuen (Differenzen zwischen den beobachtenen Werten und den durch das Modell berechneten Werten) auch hilfreich sind. Wenn diese Voraussetzungen nicht erfüllt sind, bieten sich nichtparametrische Verfahren an (196). Die hier für die Biogasergebnisse verwendete Methode war die univariate und

122 Verwendete Materialien und Methoden 122 zweifaktorielle ANOVA mit festen Effekten der Faktoren, wobei der gemeinsame Einfluss (Interaktion) der Faktoren mitberücksichtigt wurde. Als Zielvariable (abhängige Variable) wurde bei jeder Analyse das Biogasvolumen festgelegt. Die zweifaktorielle Varianzanalyse setzt zur Erklärung der Zielvariablen zwei Faktoren (A und B) ein. In diesem Fall war der Faktor A ein Bioaaditiv, dessen acht unterschiedlichen Arten eine gleiche Anzahl von Stufen bildeten, während als Faktor B die Raumbelastung verwendet wurde, deren drei unterschiedliche Konzentrationen (3, 6, und 9 g ots/l) drei Faktorstufen bildeten. Das eingesetzte mathematische Modell in Effekdarstellung lautet dann: A) Darin sind: Xijk: Zielvariable; annahmegemäß in den Gruppen normalverteilt I: Anzahl der Faktorstufen des ersten Faktors (A = 8) J: Anzahl der Faktorstufen des zweiten Faktors (B = 3) K: Anzahl der Beobachtungen pro Faktorstufe (K = 3, die Triplikate) αi: Effekt der i-ten Faktorstufe des Faktors A βj: Effekt der j-ten Faktorstufe des Faktors B (αβ)ij: Interaktion (Wechselwirkung) der Faktoren auf der Faktorstufenkombination (i,j). Die Interaktion beschreibt einen besonderen Effekt, der nur auftritt, wenn die Faktorstufenkombination (i,j) vorliegt εijk: Störvariablen, unabhängig und normalverteilt mit Erwartungswert = 0 und gleichen Varianzen Wenn die ANOVA ein signifikantes Ergebnis liefert, bedeutet dies, dass zumindest eine Gruppe sich von den anderen Gruppen unterscheidet. Um den Zusammenhang ( Pattern ) der Differenz der Mittelwerte zu analysieren, wird die ANOVA häufig durch spezifische Vergleiche ergänzt, wobei der am häufigsten verwendete Vergleich der Vergleich zweier Mittelwerte ist (die sog. paarweisen Vergleiche") (197).

123 Verwendete Materialien und Methoden 123 Tab. 7.8: Verwendete statistische Methoden zum Vergleich der Ergebnisse der Versuchen im Klein- und Großmaßstab Vesuchsphasen 2. Phase (Kleinmaßstab) 3. Phase (Großmaßstab) Substrate - Papayaabfälle - Bananenabfälle - Zitrusmischung - Geflügelbrutabfälle - Hühnermist - Geflügelschlachtabwasser - Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage - Papayaabfälle - Bananenabfälle - Zitrusmischung - Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage Parametrische Methoden Unabhängige Abhängige Stichproben Stichproben - Zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit festen Effekten und Interaktion Post-hoc Analysen: - Mehrfachvergleiche und paarweise Vergleiche für die zwei Faktoren nach den Kontrastesten : LSD ( Least Significant Difference ) SNK- Test ( Student- Newman-Keuls- Test ) und Duncan- Test. Nichtparametrische Methoden Unabhängige Abhängige Stichproben Stichproben - Kruskal- Wallis-Test für die zwei Faktoren - Vorzeichentest - Wilcoxon- Vorzeichen- Rang-Test Post-hoc Analyse Als Post-hoc-Analyse wird eine multiple Vergleichstechnik bezeichent. Damit wird eine Suche in den Daten nach Patterns durchgeführt, die nicht a priori angegeben wurden sondern erst nach Abschluss des Experimentes festgelegt werden. Ansonsten würden diese Patterns undetektiert bleiben. Post-Hoc-Tests erweitern stark den betrachteten Bereich und die Fähigkeiten von Methoden, die bei Sondierungsforschung angewandt werden können. Sie verstärken die Induktion durch die Limitierung der Wahrscheinlichkeit, dass scheinbar signifikante Effekte zwischen den Untergruppen der Population entdeckt werden, ohne daß diese tatsächlich existieren (198). Wie Tab. 7.8 zeigt, wurden der LSD-Test ( Least Significant Difference ), der SNK- Test ( Student-Newman-Keuls-Test ) und der Duncan-Test als Post-hoc Tests verwendet.

124 Verwendete Materialien und Methoden 124 Der LSD-Test ist die von Fischer im Jahr 1935 entwickelte paarweise Vergleichtechnik. Sie kann nur dann verwendet werden, wenn die Prüfgröße F von ANOVA signifikant ist. Die Hauptidee des LSD-Tests ist es, die kleinste signifikante Differenz (LSD) zwischen zwei beliebigen Mittelwerten zu berechnen und jede Differenz größer als die LSD als signifikant zu stellen (197). Der SNK-Test basiert auf einem schrittweisen oder Schicht-Ansatz zur Signifikanzuntersuchung. Mittelwerte der Stichproben werden der Größe nach angeordnet. Unterschiede zwischen den Schichten werden nach Signifikanzen bei einem bestimmten α geprüft. Der SNK-Test erfordert gleiche Stichprobeanzahl (199). Der Duncan Test ist eine Variante des SNK-Tests. Er verwendet zunehmende Alphaebenen, um die kritischen Werte in jedem Schritt des SNK-Tests zu berechnen. Er wird ebenso als eine Modifikation zur größeren Power des SNK-Tests bezeichnet. Der Ducan-Test ist besonders sicher gegen falsch-negative (Typ II) Fehler auf Kosten, ein größeres Risiko von falsch-positiven (Typ I) Fehlern zu haben (200) Nichtparametrische Methoden Die nichtparametrischen oder parameterfreien Methoden (der nichtparametrischen Statistik) sind mathematische Prozeduren zum Testen statistischer Hypothesen. Anders als parametrische Tests machen sie keine Annahmen über die Wahrscheinlichkeitsverteilung der untersuchten Variablen und sind deswegen auch anwendbar, wenn die bei vielen statistischen Aussagen notwendigen Verteilungsvoraussetzungen nicht erfüllt sind (201). Diese Methoden sind robust, besitzen aber eine geringere Teststärke (196). Wie Tab. 7.8 zeigt, wurden von den nicht parametrischen Methoden bei den Versuchen im Kleinmaßstab der Kruskal-Wallis-Test und im Großmaßstab der Vorzeichentest sowie zur Bestätigung, der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test durgeführt. Der Kruskal-Wallis-Test vergleicht die Lage von mehr als zwei Gruppen unabhängiger Stichproben. So wird im Rahmen einer Varianzanalyse getestet, ob

125 Verwendete Materialien und Methoden 125 unabhängige Stichproben (Gruppen oder Messreihen) hinsichtlich einer ordinalskalierten Variable einer gemeinsamen Population entstammen. Der Test dieser Hypothese basiert auf Rangplatzsummen (202). Als Prüfgröße des Kruskal- Wallis-Tests wird ein sogenannter H-Wert berechnet (203). Der Vorzeichentest ist ein Binomialtest (Rinne, H. (2003) und Voß, W. (2000) zit. nach (204)). Mit seiner Hilfe lassen sich Verteilungshypothesen in Ein- und Zweistichprobenproblemen testen. Der Vorzeichentest ist auch dann einsetzbar, wenn ein ordinales Datenniveau vorliegt (Hartun, J Voß. (1991), Voß, W. (2000) zit. nach (204)). Der Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test vergleicht die Lage zweier abhängiger Stichproben (bspw. Paarvergleiche). Er prüft anhand zweier gepaarter Stichproben die Gleichheit der zentralen Tendenzen der zugrundeliegenden (verbundenen) Grundgesamtheiten. Im Anwendungsbereich ergänzt er den Vorzeichentest, da er nicht nur die Richtung (d. h. das Vorzeichen) der Differenzen, sondern auch die Höhe der Differenzen zwischen zwei gepaarten Stichproben berücksichtigt (Botz, J. (2008) zit. nach (205)). Nach Visauta (1997) zit. nach (206) ist er daher stärker als der Vorzeichentest. In dieser Arbeit wurden die statistischen Analyse sowohl mit der Software Statgraphics Plus, Version 5.1, als auch mit der Software SPSS, Version 17, durchgeführt. Abb zeigt das Prozessschema, das bei den Versuchen zur statistischen Analyse der Biogasergebnisse angewandt wurde. Wie oben beschrieben, ergeben sich durch parametrische Methoden nach Erfüllung bestimmter Voraussetzungen in aller Regel genauere und präzisere Schätzungen. Daher wurde als Ausgangssituation versucht, die Rohdaten (ohne statistische Transformationen) der Biogasmengen mit den parametrischen Methoden zu analysieren. Dabei sollten die Unabhängigkeit der Messprobenreihen (auch Beobachtungen), die Normalverteilung und die Gleichheit der Varianzen (auch Varianzhomogenität oder Homokedastizität) als Voraussetzungen für den Vergleich der Mittelwerte erfüllt werden. Die Unabhängigkeit der Beobachtungen kann man zwar bei entsprechend methodischer

126 Verwendete Materialien und Methoden 126 Umsicht bei der Versuchsplanung annehmen, ob diese Annahme erfüllt ist, lässt sich jedoch nicht statistich prüfen (207). Die Mittelwerte wurden in beiden Versuchsmaßstäben mit den gesunden Werten (ohne signifikante Ausreißer) der jeweiligen Triplikate berechnet. Start 1 Nein Parametrische Methode? Ja Eliminierung der Ausreißer in den Daten Ja Signifikante Ausreißer in den Daten? Nein Unabhängikeit der Messproben? Ja 1 Ja Nein Nein Unabhängikeit der Messproben? Ja Andere Teste (nicht nötig hier) ANOVA Nein Modell A verletzt? Anzahl der Messproben 3 = 2 Andere Teste (nicht nötig hier) Signifikante Ausreißer in den Residuen? Nein Ja Eliminierung der Ausreißer in den Daten Andere Teste (nicht nötig hier) -Vorzeichentest - Wilcoxon- Vorzeichen- Rang-Test Nein Normalverteilung der Residuen? Ja Transformation der Zielvariable Nein Gleicheit der Varianzen? Ja Post-Hoc Analysen Abb. 7.10: Prozessschema zur Entscheidung der statistischen Analysen Allgemeines zu den Versuchen im Kleinmaßstab Da es sich bei den Versuchen im Kleinmaßstab um getrennte unabhängige Batchversuche handelte, die daher von Anfang an jeweils nur eine bestimmte ots- Konzentration vom Substrat mit oder ohne Bioadditive und ohne Einfluss einer Substratzugabe hatten, wurde damit die Voraussetzung der Unabhängigkeit der Proben erfüllt. Die Normalverteilung, die Gleichheit der Varianzen sowie die Identifizierung der Ausreißer (atypische Werte) wurden anhand der Residuen des oben dargestellten ANOVA Models A überprüft. Die Residuen sind in der Regel die Abweichungen zwischen den gemessenen und den durch das Modell angepassten Werten. Die signifikanten Ausreißer wurden durch studentisierte Residuen identifiziert. Nach der Software Statgraphics sollten nicht signifikante Residuenausreißer im Bereich von - 3 bis + 3 liegen. Werte mit Residuen > abs(3) wurden dann abgelehnt und nicht berücksichtigt. Wie die Abb weiter zeigt,

127 Verwendete Materialien und Methoden 127 wurde die Zielvariable transformiert, wenn die Voraussetzungen der ANOVA nicht erfüllt waren. In der Statistik bezieht sich eine Datentransformation auf die Anwendung einer deterministischen mathematischen Funktion zu jedem Punkt in einem Datensatz, d. h. jeder Datenpunkt zi ist mit dem transformierten Wert yi = f(zi) ersetzt, wobei f eine Funktion ist. Transformationen werden in der Regel angewendet, damit die Daten die Annahmen eines anzuwendenden statistischen Inferenzverfahrens genauer zu erfüllen scheinen oder um die Interpretierbarkeit oder das Aussehen der Grafiken zu verbessern (208). Die logarithmische Funktion mit Box-Cox Optimierung war die für die Biogasgesamtmengen der meisten Substrate eingesetzte Transformation, mit der die Anforderungen der ANOVA am besten erfüllt wurden. Wurden dagegen diese Anforderungen trotz der Ablehnung der Ausreißer und der Transformationen nicht erfüllt, wurden nicht parametrische Methoden angewandt. Wie Tab. 7.8 darstellt, war dies bei der Betrachtung der produzierten Biogasgesamtmengen der Substrate Geflügelschlachtabwasser und Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage der Fall Allgemeines zu den Versuchen im Großmaßstab Bei den Versuchen im Kleinmaßstab wurde durch statistische Analysen nach signifikanten Differenzen zwischen den produzierten Biogasgesamtmengen, die aus der Verwendung verschiedener Bioadditive in einem Substrat resultierten, gesucht. Im Gegensatz dazu wurden die o. g. Analysen bei den Versuchen im Großmaßstab zur Identifikation signifikanter Differenzen zwischen den Biogasmengen als Folge der bei einem Substrat unterschiedlichen zugeführten Substratmengen und damit unterschiedlichen Raumbelastungen und eingesetzten Zuführrhythmen durchgeführt. Ein Vergleich der erzeugten Biogasmengen der unterschiedlichen Substrate war für die vorliegende Arbeit nicht relevant, da es sich nicht um die Suche nach dem optimalen Substrat handelt, sondern nach einem bei jedem Substrat möglichst optimalen Gärverfahren. Wie in Kapitel beschrieben, handelte es sich bei jedem dreifachen Versuch um ein halbkontinuierliches Verfahren, dem wöchentlich oder nach einer bestimmten

128 Verwendete Materialien und Methoden 128 Zeit und in Abhängigkeit der erzeugten Biogasmenge die gleiche oder ggf. eine neue Substratmenge zugeführt wurde damit eine neue Raumbelastung erfolgte. Die so auf die Biogasmengen sich ergebenden Einflüsse der eingesetzten Substratmengen und damit der Raumbelastungen können bei jedem Substrat nicht im Einzelnen betrachtet werden, weil am Ende des Versuches der Einfluss der letzten verwendeten Substratmenge mit den Einflüssen der vorhergehenden eingesetzten Substratmengen verbunden war. Somit konnte die bei parametrischen Methoden etablierte Voraussetzung der Unabhängigkeit bei allen Teilversuchen, die bei unterschiedlichen Raumbelastungen durchgeführt wurden, nicht gewährleistet bzw. erfüllt werden. Deshalb wurden hier unterschiedliche nichtparametrische Methoden verwendet, wie die Tab. 7.8 darstellt. Vor den entsprechenden Analysen wurden bei den Ergebnissen der Biogasmengen die Ausreißer (atypische Werte) nach bestimmten statistischen Verfahren identifiziert und bei den Analysen nicht berücksichtigt. Die Identifizierung der signifikanten Ausreißer wurde mit den Methoden der standardisierten Schiefe ( Skewness ) und der standisierten Wölbung (Kurtosis) sowie nach Dixon Test durchgeführt. Gemäß dieser Verfahren soll bei nicht signifikanten Ausreißern die Beziehung - 2 < standardisierte Schiefe und standardisierte Wölbung > + 2 eingehalten werden. Der Dixon Test ist ein Ausreißertest für normalverteilte Daten, der besonders einfach anzuwenden ist. Dieser Test eignet sich hervorragend für kleinere Stichprobenumfänge (< 30 Proben) (209) und wurde hier hauptsächlich zur Bestätigung verwendet.

129 Ergebnisse und Diskussion Ergebnisse und Diskussion Aufgrund des großen Umfangs der Versuchsergebnisse werden im Folgenden nur die wesentlichen Ergebnisse der Versuche mit Papaya- und Bananenabfällen sowohl aus den Versuchen im Kleinmaßstab als auch aus denen im Großmaßstab behandelt. Weitere Ergebnisse dieser sowie weiterer Substrate sind im Anhang aufgeführt. 8.1 Ergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab Die Ergebnisse dieser Reaktoren entsprechen denen der Batchversuche, wobei acht Varianten (drei Hauptbioadditive und ihre Kombinationen und eine Blindprobe als Kontrolle ohne Bioadditiv) sowie drei Raumbelastungen (3, 6, 9 g ots/l) getestet wurden (siehe Kap , und 7.3.1). Wie in Kap beschrieben wurde, wurden die Experimente bei thermophilen Temperaturen mit einer konstanten Durchmischung von 30 1/min durchgeführt. Jeder Versuch wurde dreifach (Triplikate) durchgeführt, bis keine signifikante Steigerung der Biogasproduktion mehr stattfand. Dadurch entstanden je nach Substrat unterschiedliche Versuchsdauern Ergebnisse der Versuche mit Papayaabfällen als Substrat Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter Wie in Kap erwähnt, ist die Substratzusammensetzung die maßgebende Ausgangsgröße für die Biogasproduktion. Die Zusammensetzung der entstehenden Stoffwechselprodukte ist unmittelbar mit der Zusammensetzung des Substrats verknüpft (24). Ebenso ist für die Mikroorganismen der Anteil an organischen und anorganischen Stoffen sowie an Spurenelementen von wichtiger Bedeutung. Eine Übersicht des Gehalts an organischen Stoffen wie Proteinen, Fetten und Kohlenhydraten der verwendeten Papaya ist in Tab. 7.2 dargestellt. Kohlenhydrate sind mit rund 11 Mass.-% nach Wasser ein Hauptbestandteil von Papaya. Der Gehalt an Ballaststoffen (1,7 Mass.-%) ist höher als der an Protein (0,47 Mass.-%) und Fett (0,26 Mass.-%). Der theoretische Feststoffgehalt (TS) liegt bei 12 Mass.-%. Im Rahmen der Versuche wurde jedoch ein TS-Gehalt von 8,83 Mass.-% ermittelt (siehe Tab. 7.1), was auf den höheren Wassergehalt (91,17 Mass.- %) der verwendeten Papayas zurückzuführen ist. Wie in Kap beschrieben, sollte der TS-Gehalt

130 Ergebnisse und Diskussion 130 nach Inden (1977) und Kapp (1984) zit. nach Dauber (1993), sowie nach Kleemann und Meliß (1993), bei einem Gehalt von 10 Mass.-% liegen. Dieser Wert kann durch Zugabe von Wasser (21) oder Eindickung eingestellt werden. Wie Tab. 7.5 zeigt, wurde die maximale Menge an frischer Papaya (bei 9 g ots/l) von 11,14 g mit 8,83 % TS-Gehalt eingesetzt. Durch die mit destilliertem Wasser eingestellte Raumbelastung wurde ein TS-Gehalt von ((0,01114 kg x 8,83 % / ρ = 1,028 kg/l) / 0,1 l Füllvolumen) x 100 = 0,96 % erreicht. Somit überschritten weder dieser TS- Gehalt noch die TS-Gehalte der anderen Versuche mit geringeren Raumbelastungen (3 und 6 g ots /l) den Grenzwert von 10 Mass.-%. Es ist bekannt, dass die Biogasmenge nicht nur von der TS- oder Raumbelastung, sondern auch von der internen Nährstoffbilanz des vergärenden Substrats abhängt. Beim Mindestnährstoffverhältnis für die anaerob belebte Biomasse wird der organische Anteil bzw. der Kohlenstoffanteil als CSB und der anorganische Anteil als Stickstoff und Phosphor bezeichnet. Für ein kohlenhydrathaltiges Substrat wie Papaya sollte das Nährstoffverhältnis CSB:N:P, wie in Kapitel beschrieben wurde, im Bereich von 300:5:1 liegen (15). Nach Beendigung des Versuchs wurden daher die jeweiligen Parameter CSB, N, P und die im Substrat verbleibende ots- Menge als diejenigen Parameter ermittelt, die die intern wichtigsten Bedingungen bestimmten und auch in deren Abhängigkeit die Biogasmenge produziert wurde. Aufgrund des großen Umfangs der Proben aller untersuchten Raumbelastungen wurden nur die Mischproben der mittleren verwendeten Raumbelastung (6 g ots/l) nach der Vergärung zur Auswertung ausgewählt. Damit kann eine allgemeine Übersicht sowohl der Verhältnisse beim Anfahren der Versuche dieser Mischproben als auch beim Anfahren und nach der Vergärung der Mischproben weiterer Raumbelastungen (3 und 9 g ots/l) erstellt werden. In der Tab. 8.1 sind sowohl die chemisch-physikalischen organischen und anorganischen Summenparameter, das interne Nährstoffverhältnis, die verbleibende organische Substanz sowie ihr Abbau als auch die erzeugte Biogasmenge jeder Mischprobe der Raumbelastung von 6 g ots/l aufgeführt. Die Mischproben hatten einen CSB von ca bis etwa mg/l, einen Gesamtstickstoff von ca. 130 bis 220 mg/l und einen Phosphorgehalt < 15 mg/l. Das gewünschte Nährstoffverhältnis war am Ende der Versuche in allen Mischproben der Papayaabfälle gegeben. Daher kann angenommen werden, dass

131 Ergebnisse und Diskussion 131 auch beim Anfahren dieser Versuche sowie beim Anfahren und nach der Vergärung der Versuche mit Papayaafällen bei den anderen Raumbelastungen (3 und 9 g ots/l) kein Mangel an diesen Nährstoffen bei der anaeroben Vergärung bestand. Tab. 8.1: Chemisch-physikalische Parameter, Nährstoffverhältnis und ots-abbau nach der Vergärung von Papayaabfällen mit 6 g ots/l bei thermophilen Temperaturen mit und ohne Bioadditive (Mittelwerte) Behandlung (Akronym) CSB N P KTL ,56 131,73 4, ,92 30,68 1,00 4,83 19,54 a P ,44 133,00 4, ,77 27,14 1,00 4,92 17,95 a B ,78 134,80 3, ,65 36,06 1,00 5,05 15,87 a R ,89 198,13 14,26 982,77 13,91 1,00 6,19 13,72 a PB ,33 142,33 5, ,18 25,30 1,00 5,77 5,49 b PR ,00 176,73 14,13 977,44 12,50 1,00 5,42 24,54 c BR ,22 138,60 13, ,49 10,01 1,00 5,16 28,07 c PBR ,89 222,67 13, ,39 16,79 1,00 5,47 23,86 a,c a-c : Mittelwerte mit ungleichen hochgestellten Buchtaben sind nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest signifikant unterschiedlich mit 95 %-Konfidenz (α = 0,05 %) Verhältnis (mg/l) CSB : N : P ots (g/l) ots Abbau (%) Der im Vergleich zu Kohlenhydraten niedrige Gehalt an Proteinen in Papaya ergibt sich durch einen niedrigen Gesamtstickstoff-Gehalt von ca. 1,5 g/kg in frischem Substrat (siehe Tab. 7.1). Wäre der gesamte Stickstoffgehalt durch Ammonifikation (Umwandlung in Ammoniak und Ammonium) rein theoretisch in nur NH4 + -N umgewandelt worden, betrüge der sich ergebende Ammoniumstickstoff jeweils 131,73 mg/l bzw. 222,67 mg/l bei der KTL und der Mischprobe mit dem höchsten Stickstoffgehalt (PBR). Wie in Kap beschrieben wurde, hängt nach Kroiss (1986) und Koster und Lettinga (1983) die Hemmschwelle der NH4 + -N-Konzentration vom ph-wert und der Temperatur ab. Bei einem ph-wert von 7,0 und einer Temperatur von 38⁰ C liegt die Hemmschwelle bei einer NH4 + -N-Konzentration von ca. 4 g/l. Nach anderen Autoren (210), (43), (211) kann jedoch der Grenzwert zur Hemmung der Methanbakterien ebenso in Abhängigkeit von ph-wert und Temperatur noch höher liegen. Nach Schlowin (2009) wirken Ammoniumkonzentrationen zwischen 2,7 und 10,0 g/l hemmend. Aus diesen Angaben kann gefolgert werden, dass bei der Vergärung von Papayaabfällen keine Gefahr der Ammoniumhemmung bestand. Es könnte also die in einem Liter frischer Papaya vorliegende Stickstoffkonzentration von 1,542 g/l (= 1,5 g/kg x ρ = 1,028 kg/l)

132 Ergebnisse und Diskussion 132 vollständig in Ammonium umgewandelt werden, ohne dass dies zu einer Hemmung führen würde. Ebenso kann aufgrund des niedrigen Proteingehalts bei der Vergärung von Papaya eine Schwefelhemmung ausgeschlossen werden. Wie die Tab. 7.2 zeigt, sind verschiedene Mineralien in ausreichenden Konzentrationen in Papaya vorhanden. Damit weist Papaya im Gegensatz zu Industrieabwässern keine einseitige Zusammensetzung auf. Verschiedene dieser Mineralien (Fe, Zn, Cu, Mn, und Se) zählen zu den in einem anaeroben Prozess wichtigsten Spurenelementen, sowohl für den normalen Ablauf von Lebensvorgängen als auch zum Aufbau von Zellsubstanz. Andere für den anaeroben Prozess günstige Mineralien bzw. Schwermetalle (I, As, F, W, Mo, Co, Ni, Cr, Pb, Cd und Hg) sind nach USDA (2011) in Papaya nicht vorhanden. Andererseits zeigt Tab. 2.9 nach Lindenblatt et al. (2007) verschiedene Konzentrationen von Schwermetallen, die in Ausgangssubstraten vorliegen können. Wie bekannt ist, können die Spurenelemente je nach ihren Konzentrationen anstatt günstig auch schädlich für den anaeroben Prozess wirken. Tab im Anhang B fasst die für die eingesetzten Substratmengen aller Raumbelastungen entsprechenden theoretisch nach USDA (2011) und Lindenblatt et al. (2007) berechneten Konzentrationen an Spurenelementen und Schwermetallen zusammen und vergleicht sie mit den jeweiligen günstigen und schädlichen Konzentrationen. Bei den Vergärungsversuchen von Papayaabfällen lagen die berechneten Spurenelementkonzentrationen von Mn, Zn und Cu im Bereich der jeweiligen für den anaeroben Prozess günstigen Konzentrationen bzw. unter den jeweiligen hemmenden Schwellenwerten, während die Konzentrationen anderer Spurenelemente (Se und Fe - in Tab in grauen Kästchen -) den entprechenden günstigen Bereich unterschritten. Angesichts der Angaben von Mudrack und Kunst (1991) kann angenomen werden, dass die Abwesenheit von Ni, Co, Mo und W im Papayasubstrat sich negativ auf das Wachstum von Methanbakterien und die Anwesenheit von Mn, Zn, und Cu hingegen sich günstig für einzelne Gattungen der acetogenen Bakterien auswirkten. Allerdings, wie im Folgenden näher behandelt wird, verdeutlichen die ots-abbauraten und Biogasmengen bei den Mischproben mit Rumensaft, dass eine mikrobiologische Aktivität vorlag. Basierend auf den theoretischen Schwermetallkonzentrationen im

133 % (ml) Ergebnisse und Diskussion 133 Papayasubstrat muss keine schädliche Wirkung bei der Vergärung befürchtet werden (siehe Tab im Anhang B) Abbauraten der ots sowie Biogasmengen und -ausbeuten Hinsichtlich des ots-abbaus stellen Tab. 8.1 und Abb. 8.1 die Mittelwerte der Versuchsergebnisse der Raumbelastung von 6 g ots/l dar. Die Fehlerbalken wurden durch die Standardabweichung um den Mittelwert bestimmt. Man kann erkennen, dass die Bestandteile der organischen Trockensubstanz (Fette, Proteine und Kohlenhydrate) unterschiedliches Abbauverhalten je nach verwendeten Bioadditiven aufwiesen. Bei dieser Raumbelastung wurde die Ausgangskonzentration der ots beim Anfahren des Prozesses nur in den Proben mit R durch den ots-gehalt des Rumensaftes leicht erhöht. Eine Maßnahme zum Ausgleich des ots-gehalts hätte zu einer Ungleichheit der zuvergärenden Grundsubstratmenge in den Proben geführt a) ots-abbau b) Biogas KTL P B R PB PR BR PBR 0 KTL P B R PB PR BR PBR Abb. 8.1: Abbau der ots und erzeute Biogasmenge bei den Batch-Vergärungsversuchen von Papayaabfällen mit 6 g ots/l bei thermophilen Temperaturen Während der ots-abbau der Mischproben mit Einzelverwendung der Bioadditive (P, B, R) im Vergleich zu dem der Kontrollversuche (KTL) geringer ausfiel, war bei den Proben mit kombinierter Verwendung der Bioadditive (PB, PR, BR und PBR) sowohl ein stärkerer als auch ein geringerer ots-abbau zu beobachten. Allerdings sind die Unterschiede zwischen den ots-abbauraten der Proben KTL, P, B und R sowie zwischen den Proben PR, BR und PBR nicht signifikant (α = 0,05 %) (siehe Tab. 8.1). Mit Ausnahme von PBR dagegen sind die Unterschiede bei den Abbauraten beider o. g. Probengruppen untereinander sowie im Vergleich mit der von PB signifikant unterschiedlich (siehe Tab. 8.1 bzw. Abb. 8.1 a). D. h. solange P und B

134 Ergebnisse und Diskussion 134 oder beide nicht mit Rumensaft kombiniert sind, haben sie keinen positiven oder keinen sichtbaren Einfluss auf die Biogasproduktion von Papayaabfällen, weil die erzeugten und durch acetogene und methanogene Bakterien unverbrauchten Zwischenprodukte (z. B. Zucker, Aminosäuren und organische Säuren) sich ansammeln (212) und sie durch die Bestimmung des am Ende des Prozesses resultierenden ots-gehalts mit erfasst werden. Erst wenn die Zwischenprodukte von methanogenen Mikroorganismen, wie die in Rumensaft vorliegenden, verbraucht werden, wird der von P und B beinflusste ots-abbau auf die Biogasproduktion ersichtlich. Die ots-abbauraten lagen zwischen 4 und 28 Mass.-%. Obwohl der ots-abbau in den Proben KTL, P und B bei über 15 Mass.-% lag, war die Biogasproduktion niedrigerer als diejenige der anderen Proben mit ots-abbau < 15 Mass.-% (siehe Abb. 8.1 a und b und Tab. 8.1). Das bestätigt, dass die jeweiligen organischen Substanzen nur bis zu bestimmten Zwischenprodukten umgewandelt wurden, ohne weitere Umwandlung in Biogas. Rumenmikroorganismen hingegen verbessern die Umsetzung der Zwischenprodukte bis hin zu Biogas, was durch die erhöhten Biogasmengen (siehe Abb. 8.1 b) in den Proben mit Rumensaft verdeutlicht wird (R, PR, BR, PBR). Außerdem zeigt die Differenz der produzierten Biogasmengen der Proben PR, BR, PBR und der Probe R, dass die Verwendung von Papain und Bacillus sp. einen positiven Einfluss auf die Leistung der Rumenmikroorganismen bei der Vergärung von Papayaabfällen bei der Raumberlastung von 6 g ots/l hat. D. h. P und B ergänzen sich mit R im anaeroben Prozess. Tab. 8.2 zeigt sowohl die Ausgangskonzentrationen der Materialien mit ihren verwendeten Mengen als auch bei jeder Raumbelastung, die eingesetzten Bioadditive, die eingesetzten Substrat- und Bioadditivmassen, die jeweiligen massebezogenen Verhältnisse Bioadditiv zu dem sich ergebenden ots-gehalt des Substrats, das ots-bezogene Inokulum/Substrat-Verhältnis und die entsprechenden erzeugten Biogasmengen und ausbeuten. Bei den Bioadditiven Papain und Bacillus sp. wurde bei der Berechnung der Bioadditiv/Substrat-Verhältnisse die Masse in g der Bioadditive durch die Masse in g des bei jeder Raumbelastung ergebenden ots- Gehalts des Substrats dividiert, während beim Rumensaft der ots-gehalt der eingesetzten Menge dieses Bioadditives durch den des Substrates dividiert wurde.

135 Ergebnisse und Diskussion 135 Wie Tab. 8.2 auch zeigt, wurde bei den verschiedenen Raumbelastungen die akkumulierte Biogasmenge der Kontrolle (KTL) von der akkumulierten Bruttobiogasmenge anderer Mischproben abgezogen, um den biogasbezogenen Effekt jeder Bioadditivzugabe anhand der resultierenden Nettobiogasmenge zu verdeutlichen. Die Biogasausbeuten wurden sowohl bezogen auf das zugeführte Substrat als auch auf die jeweilige Bioadditivzugabe ermittelt. Zur Bestimmung der substratabhängigen Biogasausbeuten wurden die akkumulierten Bruttobiogasmengen durch die Massen der zugegebenen ots-gehalte des Substrats dividiert. Zusätzlich wurden bei der Raumbelastung von 6 g ots/l die durch den ots-abbau erzeugten Biogasausbeuten mittels der Division der Bruttobiogasmengen durch die jeweiligen Massen der im Prozess abgebauten ots- Gehalte berechnet. Da sowohl Rumensaft als auch das Additiv Bacillus sp. Mikroorganismen in den anaeroben Prozess einbrachten, bildeten sie bei den Mischproben, bei denen beide angewandt wurden, das Inokulum des anaeroben Prozesses. Die gesamte Masse des Inokulums wurde dann durch die Summe der eingebrachten Masse an Bacillus sp. und des organischen Gehalts des Rumensafts berechnet. Bei jeder untersuchten Raumbelastung wurde dann mit der jeweiligen Masse an Substrat ein otsbezogenes Inokulum/Substrat-Verhältnis ermittelt. So ergaben sich die otsbezogenen Inokulum/Substrat-Verhältnisse von rund 0,40, 0,20 und 0,10 (siehe Tab. 8.2). Diese Verhältnisse entsprechen in etwa denen von Silva Lopes et al. (2004) und denen bei den Versuchen von Liu et al. (2009) bei thermophilen Temperaturen. Volumenbezogen machten sie ca. 13 % des Fermenterfüllvolumens aus, was in dem von Owen et al. (1975) und Hashimoto (1981) empfohlenen Bereich von 2 bis 67 Vol.-% liegt.

136 Ergebnisse und Diskussion 136 Tab. 8.2: Verwendete Materialmengen, Verhältnisse Bioadditive zu ots des Substrats, Biogasmengen und -ausbeuten bei der Vergärung von Papayaabfällen Material Konzentration Einheit verwendete Menge (ml) 1) Raumbelastung g ots/l 3,00 6,00 9,00 Behandlung (Akronym) Papain 200,00 mg/l Bacillus sp. 10,00 mg/l 6,67 Rumensaft 17,65 g ots/l 6,67 Papaya 80,80 g ots/kg Siehe Spalte Substrat Biogasmenge Substrat (S) Papain (P) Bacillus sp. (B) Rumensaft (R) Inokulum ml /Substrat g g ots S g g P/g ots S g g B/g ots S g ots g ots R/g ots S Brutto 2) Netto 3) ml/g ots S zu ml/g ots S ab Kontrolle (KTL) 3,71 0,30 n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. 0,32 1,07 Papain (P) 3,71 0,30 0,0013 0,0045 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,66 0,34 2,21 257,73 /g P zu Bacillus sp. (B) 3,71 0,30 n. a. n. a. 0,0001 0,0002 n. a. n. a. 0,79 0,47 2, ,79 /g B zu Rumensaft (R) 3,71 0,30 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,1177 0,3928 0,3928 6,36 6,04 21,20 51,27 /g ots R zu PB 3,71 0,30 0,0013 0,0045 0,0001 0,0002 n. a. n. a. 0,62 0,30 2,08 217,22 /(g P + g B) zu PR 3,71 0,30 0,0013 0,0045 n. a. n. a. 0,1177 0,3928 0,3928 6,91 6,59 23,07 55,38 /(g P + g ots R) zu BR 3,71 0,30 n. a. n. a. 0,0001 0,0002 0,1177 0,3928 0,3930 5,78 5,46 19,29 46,37 /(g B + g ots R) zu PBR 3,71 0,30 0,0013 0,0045 0,0001 0,0002 0,1177 0,3928 0,3930 6,38 6,06 21,27 50,83 /(g P + g B + g ots R) zu Kontrolle (KTL) 7,43 0,60 n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. 0,71 1,18 6,19 Papain (P) 7,43 0,60 0,0013 0,0022 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,17-0,54 0,28 1,57-403,70 /g P zu Bacillus sp. (B) 7,43 0,60 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 0,40-0,31 0,66 4, ,40 /g B zu Rumensaft (R) 7,43 0,60 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,1177 0,1961 0,1961 5,33 4,62 8,87 54,61 39,23 /g ots R zu PB 7,43 0,60 0,0013 0,0022 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 1,14 0,43 1,90 31,44 306,28 /(g P + g B) zu PR 7,43 0,60 0,0013 0,0022 n. a. n. a. 0,1177 0,1961 0,1961 8,01 7,30 13,34 45,62 61,31 /(g P + g ots R) zu BR 7,43 0,60 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 0,1177 0,1961 0,1962 9,38 8,67 15,63 46,66 73,63 /(g B + g ots R) zu PBR 7,43 0,60 0,0013 0,0022 0,0001 0,0001 0,1177 0,1961 0,1962 8,64 7,93 14,39 50,48 66,57 /(g P + g B + g ots R) zu Kontrolle (KTL) 11,14 0,90 n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. 0,15 0,17 Papain (P) 11,14 0,90 0,0013 0,0015 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,13-0,02 0,14-18,25 /g P zu Bacillus sp. (B) 11,14 0,90 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 0,36 0,21 0, ,47 /g B zu Rumensaft (R) 11,14 0,90 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,1177 0,1308 0,1308 1,80 1,65 2,00 13,99 /g ots R zu PB 11,14 0,90 0,0013 0,0015 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 0,73 0,58 0,81 412,71 /(g P + g B) zu PR 11,14 0,90 0,0013 0,0015 n. a. n. a. 0,1177 0,1308 0,1308 2,11 1,96 2,35 16,48 /(g P + g ots R) zu BR 11,14 0,90 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 0,1177 0,1308 0,1309 3,47 3,32 3,85 28,15 /(g B + g ots R) zu PBR 11,14 0,90 0,0013 0,0015 0,0001 0,0001 0,1177 0,1308 0,1309 1,16 1,01 1,29 8,49 /(g P + g B + g ots R) zu 1) in 100 ml Füllvolumen der Flaschen, 2) Gesamtvolumen jeder Probe, 3) Differenz vom Gesamtvolumen jeder Probe und Gesamtvolumen der KTL, n. a.: nicht anwendbar S zu : zugegebener Substrat, S ab : abgebauter Substrat, Bioadditiv zu : zugegebenes Bioadditiv 6,67 Biogasausbeuten ml/g Bioadditiv zu

137 ml Biogas/g ots ml Biogas/g Bioadditive Ergebnisse und Diskussion 137 Wie Abb. 8.2 a darstellt, erhöhten sich die bei thermophilen Temperaturen gewonnenen ots-bezogenen Biogasausbeuten mit zunehmendem Inokulum/Substrat-Verhältnis (bei abnehmender Raumbelastung). Abgesehen von den Biogasausbeuten der Mischproben B und P bei den Raumbelastungen 6 und 9 g ots/l, erreichten die Biogasausbeuten der anderen Versuche höhere Werte als KTL. Sowohl das Maximum als auch die Zuwachsraten der Biogasausbeuten bei allen Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR und PBR) waren deutlich höher als die bei den anderen Mischproben. 25 a) ots-bezogene Biogasausbeuten 80 b) Bioadditivbezogene Biogasausbeuten Kontrolle (KTL) Papain (P) Bacillus sp. (B) Rumensaft (R) PB 30 5 PR BR PBR 20 Rumensaft (R) PR BR 10 PBR 0 0,10 0,20 0,40 (9,00) (6,00) (3,00) 0 0,10 0,20 0,40 (9,00) (6,00) (3,00) Inokulum/Substrat-Verhältnis (Raumbelastung g ots/l) Inokulum/Substrat-Verhältnis (Raumbelastung g ots/l) Abb. 8.2: Biogasausbeuten bei der Vergärung von Papayaabfällen: a) ots-bezogene Biogasausbeuten, b) Bioadditivbezogene Biogasausbeuten Tab. 8.3 zeigt die bei jeder verwendeten Raumbelastung und jeder Behandlung gewonnenen ots-bezogenen Biogasausbeuten mit ihren prozentualen Differenzen in Bezug auf die anderen Behandlungen. Damit kann bei jeder Raumbelastung und für jede verwendete Behandlung ein möglicher Vorteil (positive Werte in Schwarz) oder Nachteil (negative Werte in Rot) gegenüber den anderen Behandlungen erkannt werden. Die Tabelle zeigt darüber hinaus, dass die Behandlungen (mit Ausnahme von P und B) bei den Raumbelastungen 3 und 6 g ots/l die Biogasausbeute im Vergleich zu KTL um das bis zu 10-fache erhöhen. Wie Tab. 8.3 auch darstellt, war der Anstieg der Biogasausbeuten höher als die von Hölker (2007) berichteten

138 Ergebnisse und Diskussion Vol.-% bei Versuchen mit Enzymmischungen aus Pilzen. So erhöhte z. B. der Einsatz von Papain mit Rumensaft (PR) bei der Raumbelastung von 3 g ots/l (Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,40) die Biogasausbeute um 1008,54 Vol.-% im Vergleich zu PB und um 8,78 und 19,57 Vol.-% im Vergleich zu R bzw. BR, während die Verwendung von Bacillus sp. mit Rumensaft (BR) bei gleicher Raumbelastung einen Minderertrag von - 16,37 und - 9,31 Vol.-% gegenüber Papain mit Rumensaft (PR) bzw. PBR aufwies (siehe Tab. 8.3). Tab. 8.3: Vergleich der prozentualen Differenzen zwischen den ots-bezogenen Biogasausbeuten bei der Vergärung von Papayaabfällen 1) Raumbelastung g ots/l 3,00 6,00 9,00 Behandlung (Akronym) Biogasausbeute ml/g ots S zu KTL P B R PB PR BR PBR Kontrolle (KTL) 1, ,83-59,46-94,97-48,78-95,38-94,48-94,99 Papain (P) 2,21 107, ,83-89,56 6,34-90,41-88,53-89,60 Bacillus sp. (B) 2,63 146,67 18, ,60 26,34-88,60-86,37-87,64 Rumensaft (R) 21, ,52 858,26 706,56-919,02-8,07 9,92-0,31 PB 2,08 95,24-5,96-20,85-90, ,98-89,21-90,22 PR 23, ,29 942,43 777,41 8, ,54-19,57 8,45 BR 19, ,00 771,79 633,78-9,02 827,07-16, ,31 PBR 21, ,71 861,24 709,07 0,31 922,20-7,79 10,26 - Kontrolle (KTL) 1,18-316,07 79,23-86,69-37,70-91,15-92,44-91,80 Papain (P) 0,28-75, ,92-96,80-85,03-97,87-98,18-98,03 Bacillus sp. (B) 0,66-44,21 132, ,58-65,24-95,06-95,78-95,42 Rumensaft (R) 8,87 651, , ,92-368,18-33,49-43,22-38,35 PB 1,90 60,52 567,86 187,69-78, ,79-87,87-86,83 PR 13, , , ,00 50,34 603, ,64-7,31 BR 15, , , ,31 76,13 724,60 17,15-8,59 PBR 14, , , ,62 62,19 659,36 7,88-7,91 - Kontrolle (KTL) 0,17-19,05-57,98-91,55-79,17-92,81-95,61-86,93 Papain (P) 0,14-16, ,71-92,90-82,50-93,96-96,32-89,02 Bacillus sp. (B) 0,40 138,00 183, ,88-50,42-82,88-89,56-68,89 Rumensaft (R) 2, , ,33 397,06-146,46-14,89-48,11 54,64 PB 0,81 380,00 471,43 101,68-59, ,47-78,95-37,25 PR 2, , ,76 484,03 17,50 189, ,04 81,70 BR 3, , ,29 857,98 92,73 375,00 64,03-198,04 PBR 1,29 665,00 810,71 221,43-35,33 59,38-44,96-66,45-1) in 100 ml Füllvolumen der Flaschen Prozentualen Differenzen zwischen den Biogasausbeuten Wie bei Liu et al. (2009) konnte bei den durchgeführten Versuchen beobachtet werden, dass, mit Ausnahme von KTL, die höchsten ots-bezogenen Biogasausbeuten beim höchsten verwendeten Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,40 erzielt wurden. Dies konnte auch bei den Mischproben R, PR, BR und PBR beobachtet werden (siehe Abb. 8.2 a). Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen bzw. bestätigt werden, dass nur in Kombination der Bioadditive mit Rumensaft diese ihren positiven Einfluss erzielen können. Die maximale Biogasausbeute betrug 23,07 ml/g otszu bei PR mit dem höchsten eingesetzten Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,40 und bei der niedrigsten Raumbelastung von 3 g ots/l (siehe Abb. 8.2 a). Es besteht ein quasi-linearer Zusammenhang zwischen den Raumbelastungen bzw. den Inokulum/Substrat- Verhältnissen und den Biogasausbeuten.

139 Ergebnisse und Diskussion 139 Die mit steigendem Inokulum/Substrat-Verhältnis zunehmende Biogasausbeute entspricht den Verhältnissen, die bereits von Hashimoto (1989), Silva Lopes et al. (2004), Gunaseelan (1995) sowie von Zhou et al. (2011) bei mesophilen Temperaruren beobachtet wurden. Ebenso stimmt das mit der von Hashimoto (1989) beobachteten Tatsache überein, dass Inokulum zu Substrat-Verhältnisse < 0,25 die Biogasausbeute reduzieren, was hier bei den Verhältnissen von ca. 0,20 und 0,10 der Fall war. Die Reduktion der Biogasausbeute kann mit einer Verminderung des ots-abbaus einhergehen, wie Zhou et al. (2011) bei Inokulum/Substrat-Verhältnissen < 1 und ots-abbauraten < 28 Mass.-% beobachteten. Bei der hier eingesetzten Raumbelastung von 6 g ots/l mit einem Inokulum/Substrat-Verhältnis < 0,25 wurden ots-abbauraten < 28 Mass.-% festgestellt (siehe Tab. 8.1). Ebenso können niedrige Biogasausbeuten aus einer geringen methanogenen Aktivität resultieren, was unterschiedliche Gründe haben kann. Wie oben beschrieben, wurden bei einer Raumbelastung von 6 g ots /l mit den Proben KTL, P und B trotzt höherer ots- Abbauraten geringere Biogasmengen und -ausbeuten erzielt. Daraus kann geschlossen werden, dass entstehende Zwischenprodukte in den Mischproben nicht weiter umgewandelt werden konnten. Aufgrund der höheren Raumbelastung und damit eines Überangebotes an Substrat (bei gleichzeitig niedrigeren Inokulum/Substrat-Verhältnissen) führte das zu einer Anhäufung von Zwischenprodukten und somit einer Hemmung des Prozesses, da paralell ein Mangel an weiterabbauenden Mikroorganismen bestand, die diese Zwischenprodukte in Biogas hätten umwandeln können. Den im Rahmen dieser Versuche gewonnenen niedrigen Biogasmengen aller Raumbelastungen kann allerdings ebenso eine niedrige methanogene Aktivität aufgrund einer geringen Anzahl an Methanbakterien (durch niedrige Inokulum/Substrat-Verhältnisse) zu Grunde liegen. Dies kann auf die Siebung des Rumensafts sowie eine nicht optimale Adaptation der Rumensaftbakterien an die thermophilen Temperaturen zurückgeführt werden. Allerdings zeigen die gewonnenen Biogasmengen der Versuche, bei denen nach der Vergärung bei 55 ⁰C Rumenmikroorganismen wie z. B. Bacillus sp. identifiziert wurden, dass verschiedene Mikroorganismen des Rumensaftes an thermophile Temperaturen adaptiert werden können (siehe Anhang B Tab. 12.5). Dies zu ermitteln, war eine der Fragestellungen

140 Ergebnisse und Diskussion 140 der vorliegenden Arbeit, was gelungen ist und daher als möglich angenommen werden kann. Andererseits werden in der Anaerobtechnik die Gasausbeuten hauptsächlich bezogen auf die zugeführte ots ermittelt, ohne zu betrachten, dass beim anaeroben Prozess häufig organische Rückstände > 10 Mass.-% entstehen, welche nicht in Gas umgewandelt werden. Wäre die Gasausbeute in Bezug auf die im anaeroben Prozess abgebaute ots berechnet, wäre die Gasproduktion auf eine genauere Basis gelegt. Daher wurden hier (siehe Tab. 8.2) zusätzlich die Biogasausbeuten bei der Raumbelastung von 6 g ots/l ebenso auf die abgebaute ots berechnet. Die bioadditiv-bezogene Biogasausbeute wurde bei jeder Raumbelastung und jeder Bioadditivzugabe durch Division der jeweiligen akkumulierten Nettobiogasmenge durch die verwendete Masse an Bioadditiven berechnet. Wie Tab. 8.2 zeigt, ist auffällig, dass das Verhalten der Gärversuche ohne Rumensaft (P, B und PB) bei allen Raumbelastungen und allen Inokulum/Substrat-Verhältnissen sowohl bei Papayaabfällen als auch bei den anderen Substraten (siehe Kap und 1.1) keine identifizierbare Verhaltensregel (Pattern) aufweist. Daher werden in Abb. 8.2 b nur die bioadditiv-bezogenen Biogasausbeuten der Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR und PBR) dargestellt. Abgesehen von der Versuchsreihe R stiegen die bioadditiv-bezogenen Biogasausbeuten mit zunehmendem Inokulum/Substrat- Verhältnis bis auf ein Maximum, um bei einer weiteren Steigerung des Verhältnisses abzusinken. Dieses Verhalten deutet darauf hin, dass sich die enzymatischen Aktivitätsraten von Papain und Bacillus sp. bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,2 und einer Raumbelastung von 6 g ots/l bei PR, PBR und BR mit den Aktivitäten der Methanogen annähernd ausgleichen, wobei maximale Biogasausbeuten von ca. 61, 67 und 74 ml/g Bioadditiv erreicht wurden (siehe Abb. 8.2 b). Danach waren beide Arten von Aktivitäten aufgrund niedrigerer methanogener Aktivität (mit einer Anhäufung von Zwischenprodukten und Säuren) ungleich, was einen Rückgang der Biogasausbeute dieser Mischproben (PR, PBR und BR) verursachte. Bei der Versuchsreihe R kann jedoch kein Rückgang der Biogasausbeute bei zunehmendem Inokulum/Substrat-Verhältnis beobachtet werden, sondern lediglich eine Verringerung der Zuwachsrate der bioadditivbezogene Biogasausbeute, wegen nicht proportionaler Biogasproduktion. Wie Abb.

141 Ergebnisse und Diskussion a zeigt, ist bei R die zweite Zuwachsrate der ots-bezogenen Biogasausbeute höher als die erste. Bei den Gasanalysen ergaben sich leider nicht konsistente und daher nicht zuverlässige Werte aufgrund der in Kap genannten technischen Probleme im dafür vorgesehenen zweiten Chromatograph (Undichtigkeiten in der Säule und im Säulenzubehör) sowie aufgrund des manuellen Spritzens der Gasproben (mit evtl. einhergehender Luftkontamination). Daher kann hier die Gaszusammensetzung nicht dargestellt werden. Allerdings kann die ermittelte Gaszusammensetzung der Vergärungsversuche von Papayasubstrat im Mittelmaßstab, welche im Umweltlabor des Lehrstuhls für Energie- und Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie der TU München durchgeführt wurden, der Orientierung dienen. Wie Tab des Anhangs A zeigt, ist der durchnittliche Gehalt an CH4 und CO2 45,25 bzw. 37,35 Vol.- % und an H2 und H2S 537 bzw. 473 ppm. Abb. 8.3 stellt die Gesamtmengen an Biogas aus den Vergärungsversuchen mit Papayaabfällen bei den verschiedenen Raumbelastungen dar. Die Gesamtmengen zeigen den Mittelwert der Triplikate. Die Fehlerbalken wurden durch die Standardabweichung um den Mittelwert bestimmt. Ein großer Unterschied lässt sich entsprechend zwischen den Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR und PBR) und denen ohne Rumensaft (KTL, P, B, und PB) erkennen. Die produzierten Biogasmengen waren höher bei den Mischproben mit Rumensaft als bei den anderen ohne Rumensaft. Die Versuche mit B und P bei verschiedenen Raumbelastungen führten jeweils zu einer geringeren Biogasproduktion. Ebenso führte die Kombination beider Bioadditive (PB) zu einer geringeren Biogasmenge. Bezogen auf die Raumbelastung ist aus Abb. 8.3 auch ersichtlich, dass die produzierten Biogasmengen der Vergärungsversuche mit 3 g ots/l und den Einzelbioadditiven R, B und P höher waren als die mit 6 bzw. 9 g ots/l. Dabei führte eine Raumbelastung von 9 g ots/l zur geringsten Biogasproduktion. Es ist ebenso zu beobachten, dass bei den kombinierten Bioadditiven (PB, PR, BR und PBR) die produzierten Biogasmengen bei einer Raumbelastung von 6 g ots/l höher waren als bei 3 bzw. 9 g ots/l. Dabei führten (außer bei PB) diejenigen Versuche mit 9 g ots/l zur geringsten Biogasproduktion. Aus diesen zwei

142 Gesamtmenge an Biogas (ml) Ergebnisse und Diskussion 142 Beobachtungen kann gefolgert werden, dass die optimale Raumbelastung 6 g ots/l ist und Raumbelastungen über 6 g ots/l den Abbauprozess überlasten, was eine geringere Biogasproduktion zur Folge hat Blindprobe (KTL) Papain (P) Bacillus sp. (B) Rumensaft (R) PB PR BR PBR Abb. 8.3: Gesamtmenge an Biogas beim anaeroben Abbauprozess von Papayaabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss Zusammenfassend scheint die Verwendung von Papain und Bacillus sp. mit Papayaabfällen keinen Einfluss auf die in diesen Abfällen natürlich vorkommenden Mikroorganismen und somit auf den Prozess zu haben (vergl. KTL P, B und PB). Ein offenbar positiver Einfluss wurde hingegen bei den Versuchen mit Rumensaft auf die Mikroorganismen des Rumensaftes beobachtet (vergl. R mit PR, BR, und PBR bei 6 g ots/l). Dieser Effekt war nicht deutlich bei einer höheren ots-konzentration im Substrat (vergl. PR, BR und PBR bei 9 ots/l). Das stimmt mit den Beobachtungen von Toporek (1984) überein, dass die Reaktionsgeschwindigkeit bei konstanter Enzymmenge direkt proportional zur Substratkonzentration steigt, bis sie sich bei einer Maximalgeschwindigkeit stabilisiert. Bei diesem Wert verläuft die Kombination zwischen den Enzym- und Substratmolekülen in kürzest möglicher Zeit (siehe Kapitel 2.3.1). Bei Bacillus sp. scheint dieser Effekt in der Hydrolyse durch die von den Mikroorganismen ausgesonderten Enzyme stattzufinden. Alle diese Unterschiede wurden nach der Signifikanzuntersuchung anschließend statistisch analysiert (siehe unten). 3 g ots/l 6 g ots/l 9 g ots/l

143 Akkumulierte Biogasproduktion (ml) Ergebnisse und Diskussion 143 In Abb. 8.4 wird die jeweilige akkumulierte Biogasproduktion aus den Vergärungsversuchen bei allen verwendeten Raumbelastungen mit einzelnen oder kombinierten Bioadditiven über der Zeit dargestellt. Es ist ersichtlich, dass stets die akkumulierte Biogasproduktion mit Papayaabfällen bei thermophilen Temperaturen ihren maximalen Wert am vierten Tag erreichte. Das stimmt mit der Aussage von Kleemann und Meliß (1993) überein, dass thermophile Bakterien eine Faulzeit von nur 3 bis 10 Tagen benötigen. Auf den Bildern wird ausserdem deutlich, dass die akkumulierte Biogasproduktion bei den Vergärungen mit R bei allen verwendeten Raumbelastungen höher war als bei denen ohne Rumensaft und dass die Verwendung dieses Bioadditivs bei 6 g ots/l und teilweise bei 9 g ots/l die Vergärungskurven in zwei Gruppen aufteilte (die oberen mit und die unteren ohne R). Die Methanbakterien sowie die weiteren anaeroben Bakterien wurden dem anaeroben Prozess hauptsächlich über den Rumensaft zugeführt. Wie oben erwähnt, stammte der Rumensaft aus dem Pansenmilieu einer Kuh, in dem mesophile Temperaturen vorherrschen. Dennoch können hier auch die Biogasproduktion und die Faulzeit als maßgebliche Zeichen zur Toleranz und Anpassung der Bakterien an die thermophilen Temperaturen genommen werden g ots/l 12 6 g ots/l 12 9 g ots/l BR PBR PR 8 PR 6 R BR 6 R 6 4 PBR 4 4 BR PR 2 2 PB 2 R PBR KTL B P 0 PB Zeit (Tage) R KTL P B PB PR BR PBR Abb. 8.4: Akkumulierte Biogasproduktion beim anaeroben Abbauprozess von Papayaabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss

144 Ergebnisse und Diskussion Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Papayaabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss Die Normalverteilung und die Gleichheit der Varianzen wurden als weitere Voraussetzungen für den Vergleich der Biogasmittelwerte verwendet und, wie oben erwähnt, anhand der Residuen der ANOVA mit der o. g. logarithmischen Transformation und der Box-Cox Optimierung der Zielvariable graphisch überprüft (siehe Abb. 8.5). % a) Residuen (ml) Residuen (ml) b) Prognostisierte Werte (ml) asimetría curtosis Abb. 8.5: Residuenbasierte Überprüfung der Voraussetzungen für den Vergleich der Biogasmittelwerte bei der Vergärung von Papayaabfällen: a) normale Wahrscheinlichkeitsverteilung, b) Gleichheit der Varianzen Zur Bestätigung der Normalverteilung zeigt Abb. 8.5 a, dass die Residuen sich zu einer unter Verwendung der kleinsten (Fehler)Quadrate gerechneten oder bestimmten Kurve annähern, während zur Bestätigung der Gleichheit der Varianzen (siehe Abb. 8.5 b) zeigt, dass die Residuen als Differenzen zwischen den durch das Modell A angepassten Werten (prognostizierte Werte) homogen zwischen ± 0,04 verteilt sind. Wurden alle Voraussetzungen der Varianzanalyse erfüllt, wurde die Analyse mit α = 0,05 durchgeführt. Tab. 8.4 stellt die Ergebnisse der zweifaktoriellen ANOVA dar. Dabei wurden, wie oben beschrieben, sowohl der feste Einzeleffekt jedes Faktors (A und B) sowie der kombinierte Effekt (A*B) beider Faktoren getestet. Da die Wahrscheinlichkeit (auch Signifikanz oder p-value genannt) bei den drei Effekten kleiner als 0,05 ist, haben diese Einzel- und Kombifaktoren einen signifikanten Effekt auf die abhängige Variable auf dem 95 %-Konfidenzniveau. Mit anderen Worten ist die Wahrscheinlichkeit gleicher Mittelwerte der produzierten Biogasmengen aus der Vergärung der Papayaabfälle aller acht betrachteten Mischproben (mit und ohne Bioadditive) so gering, dass bei diesem Substrat die Nullhypothesen (H0-a, H0-b und H0-c), denen zufolge kein Unterschied zwischen den

145 Ergebnisse und Diskussion 145 Mittelwerten besteht (siehe Kapitel 5.1), zurückgewiesen werden kann. Dies bedeutet jedoch nicht, dass sich alle Mittelwerte voneinander unterscheiden. Es kann durchaus sein, dass mehrere Mittelwerte übereinstimmen und nur einer oder wenige der Gruppenmittelwerte von dem einheitlichen Mittelwert abweichen. Tab. 8.4: Zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit festen Effekten und Interaktion bei der Vergärung von Papayaabfällen Variationsquelle Quadratsumme df Mittel der vom Typ III (Freiheitsgrade) Quadrate F Signifikanz A: Bioadditiv 2, , , ,00000 B: Raumbelastung 0, , , ,00000 Interaktion A*B 0, , , ,00000 Residuen (Fehler) 0, ,00059 Gesamt (korrigiert) 4, Abhängige Variable: Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = 1,77054) Um zu bestimmen, welche Mittelwerte sich von den anderen signifikant unterscheiden, wurden anschließend mehrfachvergleichende Tests für jeden Faktor und auf verschiedenen Konfidenzniveaus durchgeführt. Tab. 8.5 zeigt die Ergebnisse dieser Tests mit dem Faktor Bioadditiv nach dem LSD (Least Significant Diffence) Kontrasttest ab dem 95 %-Konfidenzniveau. Die Mischproben bzw. Gruppen, die sich als homogen erwiesen haben, sind in dieser Tabelle jeweils mit einem bestimmten Zeichen markiert. So sind hier zwei unterschiedliche homogene Gruppen mit entweder einem X oder einem gekennzeichnet. Tab. 8.5: Mehrfachvergleiche bei der Vergärung von Papayaabfällen mit dem Faktor Bioadditiv nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest Bioadditiv LS Mittelwert LS Sigma (σ) Homogene Gruppen* %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 Blindprobe (KTL) 2, ,00877 X X X X X X Papain (P) 2, ,00812 X X X X X X Bacillus (B) 2, ,00812 X X X X X X Rumensaft (R) 2, ,00812 PB 2, ,00877 X X PR 2, ,00877 BR 2, ,00877 PBR 2, ,00938 * Mehrfachvergleiche Für Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = 1,77054). LS: Least Significant"

146 Ergebnisse und Diskussion 146 Man kann beobachten, dass je höher das Konfidenzniveau ist, desto größer die homogenen Gruppen sind. Bei einer 95 %-Konfidenz sind z. B. KTL, P und B homogen, während bei einer 99 %-Konfidenz zusätzlich noch PB dieser Gruppe angehört. PR, BR und PBR bildeten eine weitere homogene Gruppe, während R sich als die einzige Mischprobegruppe zeigte, die auf allen Konfidenzniveaus nicht homogen zu anderen war. Die Details des LSD-Tests sind der Tab. 8.6 zu entnehmen. Dabei werden die Ergebnisse der auf mögliche Mittelwertunterschiede der o. g. Konfidenzniveaus durchgeführten paarweisen Untersuchungen dargestellt. Die Mittelwertunterschiede zwischen den Paaren innerhalb jeder in Tab. 8.5 dargestellten homogenen Gruppe wurden hier als nicht signifikant bestätigt und mit einem gekennzeichnet. So wurde z. B. die Differenz zwischen dem Mittelwert von KTL und denen von P und B auf allen Konfidenzniveaus als nicht signifikant bestätigt, da diese auf allen Konfidenzniveaus zu derselben homogenen Gruppe gehörten. Bei einer 95 %- Konfidenz (α = 0,05 %) gibt es ein 5 %-iges Risiko zu behaupten, dass sich die Mittelwerte voneinander unterscheiden, während der wirkliche Unterschied gleich Null ist. Tab. 8.6: Paarweise Vergleiche bei der Vergärung von Papayaabfällen mit dem Faktor Bioadditiv nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 Vergleich* Differenz +/- Limite Blindprobe (KTL) - Papain (P) 0, , , , , , ,05138 Blindprobe (KTL) - Bacillus (B) -0, , , , , , ,05138 Blindprobe (KTL) - Rumensaft (R) -0, , , , , , ,05138 Blindprobe (KTL) - PB -0, , , , , , ,05332 Blindprobe (KTL) - PR -0, , , , , , ,05332 Blindprobe (KTL) - BR -0, , , , , , ,05332 Blindprobe (KTL) - PBR -0, , , , , , ,05519 Papain (P) - Bacillus (B) -0, , , , , , ,04937 Papain (P) - Rumensaft (R) -0, , , , , , ,04937 Papain (P) - PB -0, , , , , , ,05138 Papain (P) - PR -0, , , , , , ,05138 Papain (P) - BR -0, , , , , , ,05138 Papain (P) - PBR -0, , , , , , ,05332 Bacillus (B) - Rumensaft (R) -0, , , , , , ,04937 Bacillus (B) - PB -0, , , , , , ,05138 Bacillus (B) - PR -0, , , , , , ,05138 Bacillus (B) - BR -0, , , , , , ,05138 Bacillus (B) - PBR -0, , , , , , ,05332 Rumensaft (R) - PB 0, , , , , , ,05138 Rumensaft (R) - PR -0, , , , , , ,05138 Rumensaft (R) - BR -0, , , , , , ,05138 Rumensaft (R) - PBR -0, , , , , , ,05332 PB - PR -0, , , , , , ,05332 PB - BR -0, , , , , , ,05332 PB - PBR -0, , , , , , ,05519 PR - BR -0, , , , , , ,05332 PR - PBR 0, , , , , , ,05519 BR - PBR 0, , , , , , ,05519 * Für Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = 1,77054) +/- Limite +/- Limite +/- Limite +/- Limite +/- Limite

147 Ergebnisse und Diskussion 147 Ähnlich wie beim Faktor Bioadditiv wurde der LSD-Test auch mit dem zweiten Faktor Raumbelastung durchgeführt. Tab. 8.7 zeigt die Ergebnisse dieses Tests auf den gleichen Konfidenzniveaus. Tab. 8.7: Mehrfachvergleiche bei der Vergärung von Papayaabfällen mit dem Faktor Raumbelastung nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest Bioadditiv LS Mittelwert LS Sigma (σ) 3 g ots/l 2, , g ots/l 2, , g ots/l 2, ,00527 Homogene Gruppen* %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 keine * Mehrfachvergleiche Für Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = 1,77054). LS: Least Significant" Die gelisteten Raumbelastungen vertreten jeweils den Mittelwert jeder Gruppe gleicher Raumbelastung. Es wurde hier bei allen Konfidenzniveaus keine homogene Gruppe identifiziert, d. h. die Differenzen zwischen den Mittelwerten der einzelnen Gruppen können signifikant sein. Das wurde durch den nächsten paarweisen Vergleichstest untersucht. Die Details des LSD-Tests auf gleichen Konfidenzniveaus mit dem Faktor Raumbelastung sind in der Tab. 8.8 dargestellt. Dabei werden die Ergebnisse gezeigt, die aus Untersuchungen hervorgehen, die sich potentiell paarweise in ihren Mittelwerten unterscheiden. Tab. 8.8: Paarweise Vergleiche bei der Vergärung von Papayaabfällen mit dem Faktor Raumbelastung nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest Vergleich* Differenz %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 +/- Limite 3 g ots/l - 6 g ots/l -0, , , , , , , g ots/l - 9 g ots/l 0, , , , , , , g ots/l - 9 g ots/l 0, , , , , , ,03116 * Für Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = 1,77054) +/- Limite +/- Limite +/- Limite +/- Limite +/- Limite Keine Unterschiede wurden hier als nicht signifikant bestätigt, d. h. alle Differenzen zwischen den Mittelwerten sind signifikant auf den o. g. Konfidenzniveaus. Also produzierten die drei verwendeten Raumbelastungen signifikant unterschiedliche Gesamtmengen an Biogas, so dass keine Evidenz vorliegt, um die Nullhypothese (H0-b) anzunehmen.

148 Ergebnisse und Diskussion 148 Die oben dargestellten Vergleichsergebnisse wurden sowohl mit dem SNK-Test als auch mit dem Ducan Kontrasttest bestätigt (siehe Anhang B). Unter Einbeziehung der Ergebnisse der Tab. 8.5 (Mehrfachvergleiche mit dem Faktor Bioadditiv), der Tab. 8.6 (paarweise Vergleiche) und der Tab. 8.7 (Mehrfachvergleiche mit dem Faktor Raumbelastung) sowie denen der Gesamtbiogasmengen aus Abb. 8.3, kann abgeleitet werden, dass die homogenen Gruppen der Bioadditive drei verschiedene Biogasmengen bilden. Die homogene Gruppe KTL, P, B und PB produzierte die geringste Biogasmenge, während R die mittlere und die homogene Gruppe PR, BR und PBR die größte Menge an Biogas produzierte. Die Mittelwertunterschiede innerhalb der Gruppen wurden als nicht signifikant und diejenigen zwischen den Gruppen als signifikant bestätigt. Anhand der Biogasmengen kann gefolgert werden, dass die homogene Gruppe mit der höchsten Biogasmenge die vielversprechendste Gruppe für eine großtechnische Umsetzung ist. Außerdem lässt sich erkennen bzw. bestätigen, dass Papain und Bacillus sp. die Produktion von Biogas bei der Vergärung von Papayaabfällen erst erhöhen, wenn jeder oder beide in Kombination mit Rumensaft eingesetzt werden (PR, BR und PBR). Werden zusätzlich die Raumbelastungen mit einbezogen, zwischen denen Unterschiede signifikant sind (keine homogene Gruppe), werden die Mischproben mit PR, BR und PBR und 6 g ots/l einen deutlich höheren Biogasertrag bewirken (siehe Abb. 8.3) Ergebnisse der mikrobiologischen Analysen Die im Anhang B dargestellte Tab zeigt eine Übersicht der Gattungen der Mikroorganismen, die vor und nach Versuchen bei der Raumbelastung von 6 g ots/l und allen verwendeten Substraten bestimmt wurden. Dabei werden zusätzlich die nach der Vergärung identifizierten Gattungen des reinen Rumensafts gezeigt. Aufgrund des großen Umfangs von Proben, der Vielfalt der zu findenden Mikroorganismen und der damit verbundenen umfangreichen und aufwändigen Arbeit wurden die biologischen Bestimmungen lediglich bis auf die Ebene der Gattungen der fermentierenden und nicht fermentierenden Mikroorganismen durchgeführt. Es ist praktisch unmöglich, die Substrate auf alle möglichen Spezies hin zu analysieren. Daher wurden quantitative und spezifische biochemische Analysen bis zur Speziesidentifizierung nicht durchgeführt. In den Papayaabfällen

149 Ergebnisse und Diskussion 149 wurden vor der Vergärung mehr als sieben verschiedene Gattungen an Mikroorganismen identifiziert. Besondere Bakteirengattungen waren dabei grampositive Kokken und NFGNB (nicht fermentierende gram-negative Bakterien). Die gram-positiven Kokken umfassen Gattungen aus zwei Familien, während die NFGNB Gattungen aus mindestens 15 verschiedenen Familien bestehen. Die Eigenschaften aller identifizierten Mikroorganismen sind der Tab des Anhangs B zu entnehmen. Die überwiegenden Gattungen in den Rohsubstraten der Mischproben waren Enterobacter, Bacillus und Pseudomonaden. Enterobacter kommen in fast allen Lebensräumen einschließlich des menschlichen Darmes und des Rinderpansens vor, viele davon sind Zersetzer und wachsen auf toter organischer Substanz. Wie in Kap. 2.4 beschrieben, sind die Bacillus sp. in der Natur allgegenwärtig und liegen nach Tab des Anhangs B ebenso im Rumensaft als Teil der Pansenflora vor. Bei den hier mit der Gattung Bacillus durchgeführten Versuchen wurden drei Spezies davon zu den jeweiligen Mischproben zugegeben. Pseudomonaden sind ebenfalls ubiquitär, weil sie gegenüber einer Vielzahl von physikalischen Bedingungen tolerant sind und einen sich an Umweltanforderungen anpassenden Organismus haben. Diese Punkte sind Gründe für das häufigere Vorkommen dieser drei Mikroorganismenarten. Einige Stämme dieser Bakterien besonders der Pseudomonaden können sowohl bei Menschen als auch bei Pflanzen und Tieren Erkrankungen verursachen. Obwohl einige der vor den Versuchen mit Papayaabfällen identifizierten Gattungen relativ temperaturbeständig sind, wie z. B. Enterobacter, Pseudomonaden und einige gram-positive Kokken (Streptokokken), wurden alle gefundenen Gattungen mit Ausnahme von Bacillus sp. durch die thermophile anaerobe Vergärung dieses Substrats eliminiert (siehe Tab des Anhangs B). Gemäß der vorliegenden Normen in der EU (Directive 86/278/ECC with Working Document on Sludge 3 rd Draft, ENV.E.3/LM, 2000), in Mexiko (NOM-004- SEMARNAT-2002) und in den USA (EPA 40 CFR 503) wird Faulschlamm in zwei bis drei Gruppen unterteilt. Die Kategorisierung hängt in der EU von der Art der Schlammbehandlung mit Hygieneerwartungen bezogen auf zwei Indikatoren (E. Coli und Salmonella sp.) ab. In Mexiko und den USA ist nach den neuen Kriterien die Kategorisierung lediglich von der Konzentration biologischer Indikatoren abhängig. Diese Indikatoren, die die sanitäre Qualität des Schlammes bestimmen, sind in

150 Ergebnisse und Diskussion 150 Mexiko Fäkalcoliforme, Salmonella sp. und Helmintheneier und in den USA Fäkalkoliforme und Salmonella sp. Obwohl in dieser Studie keine Analyse zur Quantifizierung der Mikroorganismen durchgeführt wurde, konnte beobachtet werden, dass E. Coli, die in den Mischproben anderer Substrate (Zitrusmischung und Hühnermist) vor der Vergärung identifiziert wurde, durch den themophilen anaeroben Prozess eliminiert wurde. Salmonella sp. wurde nicht in den Mischproben der Papayaabfälle sowie in keiner der anderen Substrate gefunden. Fäkalcoliforme sind eine Untergruppe der coliformen Bakterien, die die Gattungen Escherichia, Klebsiella, Enterobacter und Citrobacter umfassen (213). Unter den Fäkalcoliformen befindet sich E. Coli (214), die die größte Spezies der Fäkalcoliformen ist (215). Wie Tab in Anhang B zeigt, sind sie häufig im unteren Darm von warmblütigen Organismen zu finden. Das ist die wesentliche Eigenschaft der Fäkalcoliforme, damit sie sich von den anderen Gruppen unterscheiden (215). Daher kommen E. Coli in den Fäkalien menschlicher und tierischer Herkunft oft in großer Zahl, bis zu 10 9 /g, vor (214) und bilden so einen spezifischen Indikator für andere Pathogene, die ebenso in Fäkalien existieren können (213). Ihre Anwesenheit ist somit eine effektive Bestätigung fäkaler Kontamination (216). Obwohl Fäkalcoliformen in dieser Arbeit nicht bestimmt wurden, kann aufgrund der o. g. Gründe festgelegt werden, dass, wenn die termophile Vergärung die E. Coli als spezifischer Indikator dieser Mikroorganismen eliminieren kann, kann von einer vollständigen Elimination anderer Fäkalcoliforme ausgegangen werden. Gemäß der UK-Enviroment Agency (EA), (2002) sind die Überlebenseigenschaften und die Anfälligkeit für Desinfektion von E. Coli ähnlich denen vieler anderer bakterieller Pathogene, besonders Salmonellen und Shigellen, die sich in temperiertem Oberflächenwasser oder in behandeltem Wasser nicht vermehren können. Sind Salmonellen und Shigellen im Substrat vorhanden, kann daher auch bei diesen Organismen von einer vollständigen Beseitigung ausgegangen werden. Helmintheneier werden als sehr widerstandsfähige Organismen angesehen, weil sie mit Chlor, UV-Licht oder Ozon nicht (kostengüngstig) inaktiviert werden können. Sie können in Nutzpflanzen für 1-2 Monate, im Boden, in frischem Wasser und Abwasser für mehrere Monate und in Fäkalien, Düngern aus Ausscheidungen und Schlämmen für mehrere Jahre überleben (217), (218), (219). Diese Resistenz ergibt sich aus der

151 Ergebnisse und Diskussion 151 Zusammensetzung der Eierschale. Diese besteht aus einer variablen Anzahl von Lagen (3-4 je nach Spezies), die jede einen mechanischen Widerstand und Schutz vor toxischen Verbindungen wie starken Säuren, Basen, Oxidations-, Reduktionsund Waschmitteln sowie proteolytischen Substanzen darstellt. Um Helmintheneier zu inaktivieren, wird empfohlen, entweder die Temperatur zu erhöhen (über 40 C) oder die Feuchtigkeit (unter 5 %, TS > 95 %) zu reduzieren oder beides für einen längeren Zeitraum aufrecht zu erhalten (220). Aufgrund der hohen Temperatur des thermophilen anaeroben Prozesses (55 C) kann gefolgert werden, dass die evtl. vorhandenen Helmitheneier im zu vergärenden Substrat inaktiviert werden. Daher wurde in dieser Studie keine Quantifizierung von Helmintheneiern durchgeführt. Von diesen Punkten kann ausgegangen werden, dass die anaerobe Vergärung von Papayaabfällen in diesem Zusammenhang vielversprechend ist, da die Hauptindikatororganismen bzw. Krankheitserreger im Rohsubstrat nicht gefunden oder nach der thermophilen anaeroben Vergärung eliminiert wurden und das Gärgut dadurch die höchste Kategorisierung aller o. g. Normen und Richtlinien erfüllte. Das Gärgut ist aus seuchenhygienischer Sicht sicher und kann zur Bodenverbesserung und in der Landwirtschaft ohne Risiko eingesetzt werden. Diese Ergebnisse bestätigen die in Kap. 2.7 dargestellten Ergebnisse von Popova und Bolotina (1962) über die Hygienequalität des Gärgutes als wesentlicher Vorteil des thermophilen Verfahrens und die Berichte von Buhr und Andrews (1977) über die erhöhte Abtötungsrate von pathogenen Organismen als bedeutender Vorteil dieses Prozesses im Hinblick auf die Entsorgung des Gärgutes Ergebnisse der Versuche mit Bananenabfällen als Substrat Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter Eine Übersicht des Gehalts an organischen Stoffen wie Proteinen, Fetten und Kohlenhydraten der verwendeten Bananen nach USDA (2011) ist in Tab. 7.2 dargestellt. Der im Vergleich zur Theorie niedrige TS-Gehalt von 20,94 Mass.-% (siehe Tab. 7.1) kann auf den höheren Wassergehalt der verwendeten tropischen Bananen zurückgeführt werden. Der in Kap für den anaeroben Prozess beschriebene TS-Gehalt von bis zu 10 Mass.-% kann durch Zugabe von Wasser (21) eingestellt werden. Wie Tab. 7.5 zeigt, wurde bei den Versuchen eine maximale Menge an frischen Bananen (bei 9 g ots/l) von 4,76 g mit 20,94 % TS-Gehalt eingesetzt. Durch die mit destilliertem Wasser eingestellte Raumbelastung ist dann

152 Ergebnisse und Diskussion 152 ein TS-Gehalt von ((0,00476 kg x 20,94 % / ρ = 1,0712 kg/l) / 0,1 l Füllvolumen) x 100 = 0,93 % entstanden. Daher überschritten weder dieser noch die anderen zwei resultierenden TS-Gehalte der kleineren Raumbelastungen (3 und 6 g ots /l) den Grenzwert von 10 Mass.-%. Für ein kohlenhydrathaltiges Substrat wie Bananen sollte das Nährstoffverhältnis CSB:N:P, wie in Kap beschrieben wurde, im Bereich von 300:5:1 liegen (15). Nach Beendigung des Versuchs wurden daher die jeweiligen Paramenter CSB, N, P und die im Substrat verbleibende ots-menge als diejenigen Parameter ermittelt, die die intern wichtigsten Bedingungen bestimmten und in deren Abhängigkeit die Biogasmenge auch produziert wurde. Aufgrund des großen Umfangs der Proben aller untersuchten Raumbelastungen, wurden hier ebenso nur die Mischproben der mittleren verwendeten Raumbelastung (6 g ots/l) nach der Vergärung zur Auswertung ausgewählt. Damit kann eine allgemeine Übersicht sowohl der Verhältnisse beim Anfahren der Versuche mit diesen Mischproben als auch beim Anfahren und nach der Vergärung der weiteren Raumbelastungen (3 und 9 g ots/l) erstellt werden. In der Tab. 8.9 sind sowohl die chemisch-physikalischen, organischen und anorganischen Summenparameter, das interne Nährstoffverhältnis, die verbleibende organische Substanz sowie ihr Abbau als auch die erzeugte Biogasmenge jeder Mischprobe der ausgewählte Raumbelastung aufgeführt. Tab. 8.9: Chemisch-physikalische Parameter, Nährstoffverhältnis und ots-abbau nach der Vergärung von Bananenabfällen mit 6 g ots/l bei thermophilen Temperaturen mit und ohne Bioadditiven (Mittelwerte) Behandlung (Akronym) CSB N P (mg/l) KTL 9.683,33 74,60 4, ,71 18,24 1,00 4,81 19,77 a P 9.266,67 101,40 3, ,53 29,74 1,00 5,37 10,53 b B 9.294,44 70,87 3, ,64 21,84 1,00 5,16 14,04 b R ,11 135,80 11, ,85 11,80 1,00 4,47 37,78 c PB 9.933,33 89,53 2, ,91 31,57 1,00 5,17 13,80 b PR ,56 132,80 11, ,89 11,12 1,00 4,87 32,19 c BR ,89 130,80 12, ,16 10,80 1,00 4,58 36,14 c PBR ,33 151,60 12, ,91 12,44 1,00 5,15 28,32 c a-c : Mittelwerte mit ungleichen hochgestellten Buchtaben sind nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest signifikant unterschiedlich mit 95 %-Konfidenz (α = 0,05 %) Verhältnis CSB : N : P ots (g/l) ots Abbau (%) Die Mischproben wiesen einen CSB von ca bis etwa mg/l, einen Gesamtstickstoff von ca. 70 bis 150 mg/l und einen Phosphorgehalt < 12,5 mg/l auf.

153 Ergebnisse und Diskussion 153 Das gewünschte Nährstoffverhältnis war in allen Mischproben der Bananenabfälle gegeben. Daraus kann angenommen werden, dass das jeweilige mittlere Nährstoffverhältnis beim Anfahren dieses Versuches sowie beim Anfahren und nach der Vergärung der weiteren Versuche mit Bananenabfällen mit den anderen Raumbelastungen (3 und 9 g ots/l) ebenso gegeben, d. h. ausgeglichen, war und daher kein Mangel an diesen Nährstoffen bei der anaeroben Vergärung auftrat. Der im Vergleich mit Kohlenhydraten kleine Gehalt an Proteinen der Banane bedingt sich durch einen Gehalt an Gesamtstickstoff von ca. 1,9 g/kg im frischen (siehe Tab. 7.1) und < 155 mg/l im vergorenen Substrat. Wäre der gesamte Stickstoffgehalt durch Ammonifikation (Umwandlung in Ammoniak und Ammonium) rein theoretisch in nur NH4 + -N umgewandelt worden, betrüge der sich ergebende Ammoniumstickstoff jeweils 74,60 mg/l bzw. 151,60 mg/l bei der KTL und der Mischprobe mit dem höchsten Stickstoffgehalt (PBR). Wie im Kap beschrieben wurde, liegt nach Kroiss (1986) sowie Koster und Lettinga (1983) die NH4 + -N-Hemmschwelle bei ca. 500 mg/l. Je nach ph-wert und Temperatur gemäß anderer Autoren (210), (43), (211) liegt die Mindestkonzentration zur Hemmung der Methanbakterien noch höher. D. h. es bestand bei der Vergärung von Bananenabfällen keine Gefahr der Ammoniumhemmung. Entsprechend könnte sogar die in einem Liter frischer Banane vorliegende Stickstoffkonzentration von 2,04 g/l (= 1,9 g/kg x ρ = 1,0712 kg/l) komplett in Ammonium umgewandelt werden, ohne dass dies zu einer Hemmung führte. Aufgrund des ebenso niedrigen Gehalts an Proteinen konnte bei der Vergärung von Bananen eine Schwefelhemmung ausgeschlossen werden. Wie die Tab. 7.2 zeigt, sind verschiedene Mineralien in ausreichenden Konzentrationen in Bananen vorhanden. Damit weist die Banane im Gegensatz zu Industrieabwässern keine einseitige Zusammensetzung auf. Verschiedene von den in Bananen enthaltenen Mineralien (Fe, Zn, Cu, Mn, Se, und F) zählen zu den in einem anaeroben Prozess wichtigsten Spurenelementen, sowohl für den normalen Ablauf von Lebensvorgängen als auch zum Aufbau von Zellsubstanz. Andere für den anaeroben Prozess günstige Mineralien bzw. Schwermetalle (I, As, W, Mo, Co, Ni, Cr, Pb, Cd und Hg) sind nach USDA (2011) in Bananen nicht vorhanden. Tab im Anhang B fasst die für die eingesetzten Bananenmengen aller Raumbelastungen entsprechenden theoretisch nach USDA (2011) und Lindenblatt et

154 Ergebnisse und Diskussion 154 al. (2007) berechneten Konzentrationen an Spurenelementen und Schwermetallen zusammen und vergleicht sie mit den jeweiligen für den anaeroben Prozess günstigen und schädlichen Konzentrationen. Bei Mn, Zn und Cu liegen die jeweiligen berechneten Konzentrationen im Bereich der entsprechenden günstigen Konzentration bzw. unter dem jeweiligen hemmenden Schwellenwert, während die berechneten Konzentrationen anderer Spurenelemente (Se und Fe - in Tab in grauen Kästchen -) den entprechenden günstigen Bereich unterschritten. Angesichts der Angaben von Mudrack und Kunst (1991) kann angenomen werden, dass die Abwesenheit von Ni, Co, Mo und W im Bananensubstrat sich negativ auf das Wachstum von Methanbakterien und die Anwesenheit von Mn, Zn, und Cu hingegen sich günstig für einzelne Gattungen der acetogenen Bakterien auswirkten. Allerdings, wie beim Papayasubstrat, verdeutlichen die ots-abbauraten und Biogasmengen bei den Mischproben mit Rumensaft, dass eine mikrobiologische Aktivität vorlag. Basierend auf den theoretischen Schwermetallkonzentrationen in Bananen muss keine schädliche Wirkung bei der Vergärung befürchtet werden (siehe Tab im Anhang B) Abbauraten der ots sowie Biogasmengen und -ausbeuten Tab. 8.9 und Abb. 8.6 stellen die Mittelwerte der Versuchsergebnisse des ots- Abbaus der Raumbelastung von 6 g ots/l dar. Bei dieser Raumbelastung wurde bei den Bananenvergärungen die Ausgangskonzentration der ots beim Anfahren des Prozesses nur in den Proben mit R durch den ots-gehalt des Rumensaftes leicht erhöht. Man kann erkennen, dass die Bestandteile der organischen Trockensubstanz (Fette, Proteine und Kohlenhydrate) unterschiedliches Abbauverhalten je nach verwendeten Bioadditiven aufwiesen. Abgesehen von den Mischproben mit Papain und Bacillus sp. (P, B, PB) waren die ots-abbauraten der anderen Mischproben im Vergleich zu der von der Kontrolle (KTL) höher. Als gemeinsames Bioadditiv dieser Mischproben wurde der Rumensaft (R) verwendet. Die Unterschiede zwischen den ots-reduktionen der Mischproben P, B, PB sowie zwischen denen der Mischproben R, PR, BR, PBR sind nicht signifikant (α = 0,05 %) (siehe Tab. 8.9). Dagegen sind die ots-reduktionen zwischen beiden Gruppen sowie diese im Vergleich zu der von KTL signifikant unterschiedlich (siehe hochgestellte Buchstaben in Tab. 8.9 und Fehlerbalken in Abb. 8.6 a). Die Differenz kann auf den Einfluss des Rumensafts zurückgeführt

155 % (ml) Ergebnisse und Diskussion 155 werden. D. h. solange P oder B oder beides nicht mit Rumensaft verwendet wurden, haben sie bei der Vergärung von Bananenabfällen keinen positiven oder keinen sichtbaren Einfluss auf die Biogasmenge, weil die dadurch erzeugten Zwischenprodukte (dabei Zucker, Aminosäuren und organische Säuren), die normalerweise von acetogenen und methanogenen Bakterien, wie in Pansen, abgebaut werden, sich anhäufen (212) und sie am Ende des Prozesses bei der Bestimmung des sich ergebenden ots-gehalts mit erfasst werden. Dagegen wurden sie bei der Verwendung vom Rumensaft (R, PR, BR, PBR) weiterverbraucht. Der Einfluss von P und B auf den ots-abbau wurde somit erkennbar (siehe Abb. 8.6 a) a) ots-abbau b) Biogas KTL P B R PB PR BR PBR 0 KTL P B R PB PR BR PBR Abb. 8.6: Abbau der ots und erzeugte Biogasmenge bei den Batch-Vergärungsversuchen von Bananenabfällen mit 6 g ots/l bei thermophilen Temperaturen Der ots-gehalt wurde maximal in ca. 38 Mass.-% (bei R) und minimal in ca. 11 Mass.-% (bei P) abgebaut. Obwohl die signifikanten ots-reduktionunterschiede zwischen den o. g. Probengruppen sowie im Vergleich zu der von der KTL nicht so groß waren, wiesen die jeweiligen Biogasproduktionen gleicher Probengruppen deutliche Unterschiede auf (siehe Abb. 8.6 a und b). Die Biogasproduktionen der Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR, PBR) waren höher als diejenigen der anderen, wobei R die höchste Produktion aufwies. Damit wird auch hier bestätigt, dass die beim ots-abbau produzierten organischen Substanzen bei den Mischproben ohne Rumensaft nur bis zu bestimmenten Zwischenprodukten umgewandelt wurden, ohne weitere Umwandlung in Biogas. Im Gegensatz dazu hat die Anwesenheit von Rumenmikroorganismen in den Mischproben mit Rumensaft nicht nur beim Abbau des in Bananefrucht enthaltenen Gehaltes an Ballaststoffe geholfen, sondern durch die höheren Biogasmengen (siehe Abb. 8.6 b) verdeutlicht,

156 Ergebnisse und Diskussion 156 dass der Prozess bis zur letzten Phase geführt wurde, in der die Zwischenprodukte bis zu Biogas umgewandelt wurden. Obwohl Rumensaft die Verwendung von P und B verbesserte, kann dennoch aus den Biogasdifferenzen zwischen R und PR, BR, PBR gefolgert werden, dass die Verwendung von Papain und Bacillus sp. mit Bananenabfällen, im Gegensatz zu der mit Papayaabfällen, keinen positiven Einfluss auf die Leistung der Rumenmikroorganismen bewirkte. Weil diese Bioadditive sowohl bei Einzelverwendung (P, B) als auch in Kombination (PB) oder bei Kombinationen mit Rumensaft (PR, BR, PBR) die Biogasmengen und ausbeuten im Vergleich zu denen der Proben KTL bzw. R verringern (siehe Tab und Abb. 8.6 b), kann man daraus ableiten, dass sie einen hemmenden Einfluss auf die Vergärung von Bananenabfällen haben. Tab zeigt sowohl die Ausgangskonzentrationen der verwendeten Materialien bei den Versuchen mit Bananenabfällen mit ihren jeweiligen Mengen und Raumbelastungen, die angewendeten Bioadditive, die eingesetzten Substrat- und Bioadditivmassen, die jeweiligen massebezogenen Verhältnisse Bioadditiv zu dem sich ergebenden ots-gehalt des Substrats, das ots-bezogenen Inokulum/Substrat- Verhältnis sowie die entsprechenden erzeugten Biogasmengen und ausbeuten. Bei der Bestimmung der jeweiligen Bioadditiv/Substrat-Verhältnisse sowie bei der Bildung und Massenberechnung des Inokulums wurde hier genau gleich wie bei den Versuchen mit Papayaabfällen verfahren (siehe Kap ). Für jede untersuchte Raumbelastung wurde ein ots-bezogenes Inokulum/Substrat-Verhältnis ermittelt. So ergaben sich auch die ots-bezogenen Inokulum/Substrat-Verhältnisse von rund 0,40, 0,20 und 0,10 (siehe Tab. 8.10). Diese Verhältnisse ähneln, wie bei den Versuchen mit Papayaabfällen, denen von Silva Lopes et al. (2004) und denen bei den Versuchen von Liu et al. (2009) bei thermophilen Temperaturen. Volumenbezogen liegen sie mit ca. 13 % des Füllvolumens des Fermenters in dem von Owen et al. (1975) und Hashimoto (1981) empfohlenen Bereich von 2 bis 67 Vol.-%. Zur Bewertung der Biogasproduktion wurde jedes der akkumulierten Biogasvolumina (Brutto) nach den gleichen Gesetzen und Bedingungen wie bei den Versuchen mit Papayaabfällen beschrieben, korrigiert und die Nettobiogasmenge in gleicher Weise berechnet (Siehe Kap ). Tab zeigt die Biogasausbeuten bezogen auf das zugeführte Substrat, auf die eingesetzten Bioadditive und den abgebauten ots-gehalt.

157 Ergebnisse und Diskussion 157 Tab. 8.10: Verwendete Materialmengen, Verhältnisse Bioadditive zu ots des Substrats, Biogasmengen und -ausbeuten bei der Vergärung von Bananenabfällen Material Konzentration Einheit verwendete Menge (ml) Papain 200,00 mg/l 6,67 Bacillus sp. 10,00 mg/l 6,67 Rumensaft 17,65 g ots/l 6,67 Bananen 189,00 g ots/kg Siehe Spalte Substrat 1) Raumbelastung g ots/l Behandlung (Akronym) Biogasmenge Substrat (S) Papain (P) Bacillus sp. (B) Rumensaft (R ) Biogasausbeuten Inokulum ml /Substrat g g ots S g g P/g ots S g g B/g ots S g ots g ots R/g ots S Brutto 2) Netto 3) ml/g ots S zu ml/g ots S ab ml/g Bioadditiv zu 3,00 6,00 9,00 KTL 1,59 0,30 n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. 5,17 17,21 Papain (P) 1,59 0,30 0,0013 0,0044 n. a. n. a. n. a. n. a. 1,41-3,76 4, ,32 /g P zu Bacillus sp. (B) 1,59 0,30 n. a. n. a. 0,0001 0,0002 n. a. n. a. 2,45-2,73 8, ,51 /g B zu Rumensaft (R ) 1,59 0,30 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,1177 0,3918 0, ,92 11,74 56,29 99,74 /g ots R zu PB 1,59 0,30 0,0013 0,0044 0,0001 0,0002 n. a. n. a. 1,29-3,89 4, ,86 /(g P + g B) zu PR 1,59 0,30 0,0013 0,0044 n. a. n. a. 0,1177 0,3918 0,3918 7,40 2,22 24,61 18,68 /(g P + g ots R) zu BR 1,59 0,30 n. a. n. a. 0,0001 0,0002 0,1177 0,3918 0,3920 8,60 3,43 28,63 29,13 /(g B + g ots R) zu PBR 1,59 0,30 0,0013 0,0044 0,0001 0,0002 0,1177 0,3918 0,3920 4,67-0,50 15,55-4,19 /(g P + g B + g ots R) zu KTL 3,17 0,60 n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. 7,01 11,71 59,20 Papain (P) 3,17 0,60 0,0013 0,0022 n. a. n. a. n. a. n. a. 2,30-4,71 3,84 38, ,64 /g P zu Bacillus sp. (B) 3,17 0,60 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 4,56-2,45 7,62 54, ,50 /g B zu Rumensaft (R ) 3,17 0,60 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,1177 0,1965 0, ,50 22,49 49,24 108,93 190,99 /g ots R zu PB 3,17 0,60 0,0013 0,0022 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 3,00-4,01 5,01 39, ,92 /(g P + g B) zu PR 3,17 0,60 0,0013 0,0022 n. a. n. a. 0,1177 0,1965 0, ,31 5,30 20,55 53,47 44,51 /(g P + g ots R) zu BR 3,17 0,60 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 0,1177 0,1965 0, ,73 7,71 24,58 56,98 65,47 /(g B + g ots R) zu PBR 3,17 0,60 0,0013 0,0022 0,0001 0,0001 0,1177 0,1965 0,1966 9,70 2,69 16,19 48,19 22,57 /(g P + g B + g ots R) zu KTL 4,76 0,90 n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. n. a. 4,95 5,50 Papain (P) 4,76 0,90 0,0013 0,0015 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,79-4,16 0, ,96 /g P zu Bacillus sp. (B) 4,76 0,90 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 0,72-4,23 0, ,78 /g B zu Rumensaft (R ) 4,76 0,90 n. a. n. a. n. a. n. a. 0,1177 0,1309 0, ,08 20,13 27,88 170,95 /g ots R zu PB 4,76 0,90 0,0013 0,0015 0,0001 0,0001 n. a. n. a. 1,73-3,22 1, ,07 /(g P + g B) zu PR 4,76 0,90 0,0013 0,0015 n. a. n. a. 0,1177 0,1309 0, ,01 16,06 23,36 134,90 /(g P + g ots R) zu BR 4,76 0,90 n. a. n. a. 0,0001 0,0001 0,1177 0,1309 0, ,28 21,33 29,21 181,03 /(g B + g ots R) zu PBR 4,76 0,90 0,0013 0,0015 0,0001 0,0001 0,1177 0,1309 0, ,19 9,24 15,77 77,52 /(g P + g B + g ots R) zu 1) in 100 ml Füllvolumen der Flaschen, 2) Gesamtvolumen jeder Probe, 3) Differenz vom Gesamtvolumen jeder Probe und Gesamtvolumen der KTL, n. a.: nicht anwendbar S zu : zugegebener Substrat, S ab : abgebauter Substrat, Bioadditiv zu : zugegebenes Bioadditiv

158 ml Biogas/g ots ml/g Bioadditive Ergebnisse und Diskussion 158 Abb. 8.7 a stellt die ots-bezogenen Biogasausbeuten der Vergärung von Bananenabfällen dar. Abgesehen von der Biogasausbeute der Mischprobe PBR bei einer Raumbelastung von 9 g ots/l erreichten die anderen Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR) bei allen Raumbelastungen höhere Werte als die KTL-Probe. Außerdem wiesen die Biogasausbeuten bei ansteigendem Inokulum/Substrat- Verhältnis (bei gleichzeitig abnehmender Raumbelastung) kein lineares Verhalten auf. Außer der Biogasausbeute der Mischproben PR und BR nahmen die anderen Biogasausbeuten zu, als das Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,10 auf 0,20 anstieg. Beim höchsten Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,40 zeigten die Biogasausbeuten unterschiedliches Verhalten auf. Während die Biogasausbeuten von PB und PBR abnahmen, stiegen die der anderen Mischproben ohne Linearität weiter an. Bemerkenswert ist die hohe Zunahme der Biogasausbeute der Mischprobe nur mit Rumensaft. Ihre Zuwachsrate war wesentlich größer als die der anderen Mischproben. Sie wies einen parabolischer Trend bei zunehmendem Inokulum/Substrat-Verhältnis auf (bei gleichzeitig abnehmender Raumbelastung). 60 a) ots-bezogene Biogasausbeuten 220 b) Bioadditivbezogene Biogasausbeuten KTL Papain (P) Bacillus sp. (B) Rumensaft (R ) PB PR Rumensaft (R ) PR BR PBR BR PBR ,10 0,20 0,40 (9,00) (6,00) (3,00) -20 0,10 0,20 0,40 (9,00) (6,00) (3,00) Inokulum/Substrat-Verhältnis (Raumbelastung g ots/l) Inokulum/Substrat-Verhältnis (Raumbelastung g ots/l) Abb. 8.7: Biogasausbeuten bei der Vergärung von Bananenabfällen: a) ots-bezogene Biogasausbeuten, b) Bioadditivbezogene Biogasausbeuten Tab stellt die verschiedenen Raumbelastungen und die bei den verschiedenen Behandlungen gewonnenen ots-bezogenen Biogasausbeuten gegenüber. Damit

159 Ergebnisse und Diskussion 159 können für alle eingesetzten Raumbelastungen Vorteile (siehe positive Werte in Schwarz) bzw. Nachteile (siehe negative Werte in Rot) jeder Behandlung gegenüber der Anderen erkannt werden. Aus der Tabelle erschließt sich ebenso, dass im Vergleich mit der KTL-Probe (abgesehen von PBR) bei einer Raumbelastung von 3 g ots/ nur die Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR) einen positiven Einfluss haben. Wie Tab auch zeigt, war der Anstieg der Biogasausbeuten auch hier höher als um die von Hölker (2007) bei Versuchen mit Enzymmischungen von Pilzen berichteten Vol.-%. Die Verwendung von Rumensaft bei einer Raumbelastung von 3 g ots/l (Inokulum/Substrat-Verhältnis von 0,40) erhöhte z. B. die Biogasausbeute um ca Prozent im Vergleich mit der von P und PB und um ca Prozent im Vergleich mit der der anderen Mischproben (B, PR, BR, PBR). Die Einzelverwendung von Bacillus sp. und Papain hingegen führt bei allen Raumbelastungen zu geringeren Biogasausbeuten im Vergleich zu den anderen Mischproben. Tab. 8.11: Vergleich der prozentualen Differenzen zwischen den ots-bezogenen Biogasausbeuten bei der Vergärung von Bananenabfällen 1) Raumbelastung g ots/l 3,00 6,00 9,00 Behandlung (Akronym) Biogasausbeute ml/g ots S zu KTL P B R PB PR BR PBR KTL 17,21-267,17 111,44-69,42 301,89-30,07-39,89 10,68 Papain (P) 4,69-72, ,41-91,67 9,46-80,95-83,63-69,86 Bacillus sp. (B) 8,14-52,71 73, ,54 90,07-66,93-71,57-47,66 Rumensaft (R ) 56,29 227, ,86 591, ,42 128,71 96,61 261,98 PB 4,28-75,12-8,64-47,39-92, ,60-85,04-72,46 PR 24,61 43,00 425,05 202,36-56,28 474, ,04 58,27 BR 28,63 66,35 510,80 251,74-49,14 568,56 16,33-84,11 PBR 15,55-9,65 231,75 91,04-72,37 263,12-36,82-45,69 - KTL 11,71-204,49 53,67-76,23 133,54-43,04-52,38-27,72 Papain (P) 3,84-67, ,53-92,19-23,30-81,29-84,36-76,26 Bacillus sp. (B) 7,62-34,92 98, ,53 51,98-62,94-69,01-52,96 Rumensaft (R ) 49,24 320, ,85 546,40-882,37 139,58 100,33 204,05 PB 5,01-57,18 30,38-34,20-89, ,61-79,61-69,05 PR 20,55 75,57 434,61 169,80-58,26 310, ,38 26,90 BR 24,58 109,98 539,37 222,67-50,08 390,37 19,59-51,77 PBR 16,19 38,35 321,27 112,60-67,11 223,10-21,20-34,11 - KTL 5,50-525,96 583,82-80,26 185,53-76,44-81,16-65,10 Papain (P) 0,88-84,02-9,24-96,85-54,39-96,24-96,99-94,42 Bacillus sp. (B) 0,80-85,38-8, ,11-58,25-96,55-97,24-94,90 Rumensaft (R ) 27,88 406, , , ,14 19,34-4,56 76,77 PB 1,93-64,98 119,23 139,50-93, ,75-93,40-87,78 PR 23,36 324, , ,10-16, , ,03 48,12 BR 29,21 430, , ,99 4, ,26 25,05-85,22 PBR 15,77 186, , ,24-43,43 718,07-32,49-46,01-1) in 100 ml Füllvolumen der Flaschen Prozentualen Differenzen zwischen den Biogasausbeuten Wie Liu et al. (2009) bei ihren Experimenten bei vergleichbaren Temperaturen beobachteten, wurden außer bei den Versuchsreihen BR und PBR höhere Biogasausbeuten beim höchsten verwendeten Inokulum/Substrat-Verhältnis (0,40) erzielt. Aus den Abbildungen kann geschlossen werden, dass sich die Einzelverwendung von R als positiv erwiesen hat.

160 Ergebnisse und Diskussion 160 Die maximale Biogasausbeute betrug 56,29 ml/g otszu und wurde bei R mit dem höchsten eingesetzten Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,40 und bei der niedrigsten Raumbelastung von 3 g ots/l erreicht. Die Reduktion der Biogasausbeuten kann mit einer Verminderung des ots-abbaus einhergehen. Zhou et al. (2011) beobachteten bei Verhältnissen < 1 ots-abbauraten von < 28 Mass.-%. Bei der hier eingesetzten Raumbelastung von 6 g/l, bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis < 0,25, wurden aber ots-abbauraten < 38 Mass.-% festgestellt (siehe Tab. 8.9). Wie oben beschrieben wurde, können die niedrigen Biogasausbeuten in einer geringen methanogenen Aktivität begründet liegen, was unterschiedliche Ursachen haben kann. Den bei den Versuchen gewonnenen niedrigen Biogasmengen der unterschiedlichen Raumbelastungen kann auch eine niedrige methanogene Aktivität wegen einer geringen Anzahl an Methanbakterien (aufgrund eines niedrigen Inokulum/Substrat- Verhältnisses) zu Grunde liegen. Dies kann ebenso hier auf die Siebung des Rumensafts oder auf eine nicht optimale Adaptation der Rumensaftbakterien an die thermophilen Temperaturen zurückgeführt werden. Allerdings zeigen die durch Bacillus sp. gewonnenen Biogasmengen (siehe Tab. 12.5), wie bei Papayaabfällen, dass verschiedene Mikroorganismen des Rumensaftes an die thermophilen Temperaturen angepasst werden konnten, was ebenso ein zu untersuchendes Ziel der Arbeit war. Die bioadditiv-bezogenen Biogasausbeuten wurden für jede Raumbelastung bezogen auf die jeweilige Nettobiogasmenge berechnet. Tab zeigt, dass bei den Gärversuchen ohne Rumensaft (P, B und PB) unabhängig von der Raumbelastung und dem Inokulum/Substrat-Verhältnis bei allen Substraten (siehe Kap und 1.1) keinen identifizierbaren Pattern auftraten. Daher werden in Abb. 8.7 b nur die bioadditivbezogenen Biogasausbeuten der Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR und PBR) betrachtet. Abgesehen von R nahmen die bioadditivbezogenen Biogasausbeuten mit zunehmendem Inokulum/Substrat-Verhältnis ab. Daraus kann gefolgert bzw. bestätigt werden, dass die enzymatische Aktivität von Papain und Bacillus sp. sich bei allen Inokulum/Substrat-Verhältnissen hemmend für die methanogene Aktivität auswirkte, während Rumensaft einen Ausgleich der enzymatischen und methanogenen Aktivitäten bei einer Raumbelastung von

161 Ergebnisse und Diskussion g ots/l bewirkte, wobei das Maximum der bioadditiv-bezogenen Biogasausbeute bei ca. 191 ml/g Bioadditiv lag. Danach war sie aufgrund niedrigerer methanogener Aktivität (bei gleichzeitiger Anhäufung von Zwischenprodukten und Säuren) ungleich, was einen Rückgang der Biogasausbeute verursachte. Die Produktionsraten der ots-bezogenen Biogasausbeuten bei der Mischprobe R und allen Raumbelastungen sind ebenso höher als die der anderen Mischproben (siehe Abb. 8.7 a). Abb. 8.8 stellt die produzierte Gesamtmengen an Biogas aus den Vergärungsversuchen mit Bananenabfällen bei allen Raumbelastungen dar. Die Gesamtmengen zeigen den Mittelwert der Triplikate. Ähnlich wie bei den Papayaabfällen waren die Biogasmengen höher, wenn Rumensaft in den Mischproben verwendet wurde. Entsprechend ist ein großer Unterschied zwischen den Mischproben mit R (Gruppen R, PR, BR und PRB) und denen ohne R (Gruppen KTL, P, B und PB) zu beobachten. Die Einzelverwendung von B und P bei den Vergärungen mit den verschiedenen Raumbelastungen konnte die produzierten Biogasmengen kaum steigern. Ebenso hat die Kombination PB nur wenig Biogas erzeugt. Bezogen auf die Raumbelastung ist aus Abb. 8.8 auch ersichtlich, dass die Biogasmengen der Vergärung mit 6 g ots/l und den Einzelbioadditiven R, B und P und ebenso mit PB höher als die ihrer Vergleichsgruppen mit 3 bzw. 9 g ots/l waren. Dabei erzeugten (außer PB) diejenigen mit 9 g ots/l die geringsten Biogasmengen. Es ist ebenso zu beobachten, dass die Biogasmengen von den Vergärungen mit 9 g ots/l und den kombinierten Bioadditiven (PR, BR und PBR außer PB) höher als von den Vergärungen mit 3 bzw. 6 g ots/l waren. Dabei erzeugten diejenigen mit 6 g ots/l die mittleren und die mit 3 g ots/l die geringsten Biogasmengen. Hier kann ebenso beobachtet werden, dass die Verwendung von Papain und Bacillus sp. bei der Vergärung von Bananenabfällen eine hemmende Wirkung sowohl für die in diesen Abfällen natürlich vorkommenden Mikroorganismen (vergl. KTL mit B und P) als auch die Mikroorganismen des Rumensafts (vergl. R mit PR, BR, und PBR) hat. Dieser Effekt ist umso stärker je niedriger die ots-konzentration des Substrats ist (vergl. PR, BR und PBR). Wie in Kapitel erwähnt wurde, ist nach Toporek (1984) die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion direkt proportional zur Konzentration der Enzyme, d. h. je höher das Enzymmolekül/Substratmolekül- Verhältnis ist, umso höher ist die Wahrscheinlichkeit eines Kontaktes zwischen den

162 Gesamtmenge an Biogas (ml) Ergebnisse und Diskussion 162 beiden Molekülen. Im Rahmen der Versuche mit Bananenabfällen wurde jedoch sowohl für das Enzym Papain als auch für Bacillus sp. das Gegenteil beobachtet. Alle diese Unterschiede wurden ebenso mit Hilfe von Signifikanzuntersuchungen analysiert (siehe unten) Blindprobe (KTL) Papain (P) Bacillus sp. (B) Rumensaft (R) PB PR BR PBR 3 g ots/l 6 g ots/l 9 g ots/l Abb. 8.8: Gesamtmenge an Biogas beim anaeroben Abbauprozess von Bananenabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss In Abb. 8.9 wird jeweilig die über die Zeit akkumulierte Biogasproduktion aus den Gärungsversuchen bei den verwendeten Raumbelastungen mit einzelnen oder kombinierten Bioadditiven dargestellt. Es ist ersichtlich, dass die Biogasproduktion von Bananenabfällen bei thermophilen Temperaturen rapide zunahm und bei allen Mischproben sowie Raumbelastungen ihr Maximium am fünften Tag erreichte. Im Vergleich zu den Versuchen mit Papayaabfällen war dieser Zeitraum um einen Tag länger. Jedoch stimmen diese Ergebnisse mit der Aussage von Kleemann und Meliß (1993) überein, dass thermophile Bakterien lediglich eine Faulzeit von 3 bis 10 Tagen benötigen. Aus den drei Diagrammen in Abb. 8.9 wird deutlich, dass die akkumulierte Biogasproduktion der Vergärung nur mit R, ebenso wie die Biogasproduktionen der mit R kombinierten Additive bei allen verwendeten Raumbelastungen die höchste war. Wie Tab. 7.2 vom Kapitel zeigt, handelt es sich bei Bananen um ein kohlenhydrathaltiges Material, in dem mehr Zucker und Stärke vorhanden sind. Darin

163 Akkumulierte Biogasproduktion (ml) Ergebnisse und Diskussion 163 könnte auch der Grund der höheren Biogasproduktion im Vergleich zu den Versuchen mit Papayaabfällen liegen g ots/l 35 6 g ots/l 35 9 g ots/l R 30 R R BR BR PR PBR KTL PR BR PBR 5 0 PR KTL PBR B PB B PB P KTL PB Zeit (Tage) CTL P B R PB PR BR PBR Abb. 8.9: Akkumulierte Biogasproduktion beim anaeroben Abbauprozess von Bananenabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss Die steigende Biogasproduktion bei kürzerer Faulzeit könnte ebenso als maßgebliches Zeichen zur Toleranz und Anpassung der Bakterien an die thermophilen Temperaturen bei der Vergärung von Bananenabfällen genommen werden Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Bananenabfällen ohne und mit Bioadditiveinfluss Für die Überprüfung der Zielvariablen wurden ebenso die Normalverteilung und die Gleichheit der Varianzen als Voraussetzungen für den Vergleich der Biogasmittelwerte anhand der Residuen der ANOVA mit der o. g. logarithmischen Transformation und der Box-Cox Optimierung eingesetzt, und diese wurden auch erfüllt (siehe Abb. 8.10). Zur Bestätigung der Normalverteilung zeigt Abb a, dass sich die Residuen einer unter der Verwendung der kleinsten (Fehler)Quadrate gerechneten oder bestimmten Kurve annähern. Gleichzeitig zeigt sich als Bestätigung der Gleichheit der Varianzen Abb b, dass die Residuen als Differenzen zwischen den durch das Modell A angepassten Werten (prognostizierte Werte) homogen zwischen 0,20 und 0,20

164 Ergebnisse und Diskussion 164 verteilt sind. Wurden alle Voraussetzungen der Varianzanalyse erfüllt, wurde die Analyse mit α = 0,05 durchgeführt. % a) b) Residuen (ml) Prognostizierte Werte (ml) Residuen (ml) Abb. 8.10: Residuenbasierte Überprüfung der Voraussetzungen für den Vergleich der Biogasmittelwerte bei der Vergärung von Bananenabfällen: a) Normale Wahrscheinlichkeitsverteilung, b) Gleichheit der Varianzen Tab stellt die Ergebnisse der zweifaktoriellen ANOVA dar. Dabei wurden, wie oben beschrieben, sowohl der feste Einzeleffekt jedes Faktors (A und B) sowie der kombinierte Effekt (A*B) der beiden Faktoren getestet. Da die Signifikanz bei den drei Effekten kleiner als 0,05 ist, haben diese Einzel- und Kombifaktoren einen signifikanten Effekt für die abhängige Variable auf dem 95 %-Konfidenzniveau. Mit anderen Worten ist die Wahrscheinlichkeit gleicher Mittelwerte der Biogasmengen aus der Vergärung mit Bananenabfällen in allen acht betrachteten Mischproben (mit und ohne Bioadditive) so gering, dass bei diesem Substrat die Nullhypothesen (H0-a, H0-b und H0-c), denen zufolge kein Unterschied zwischen den Mittelwerten besteht (siehe Kapitel 5.1), zurückgewiesen werden kann. Dies bedeutet jedoch nicht, dass sich alle Mittelwerte voneinander unterscheiden. Es kann durchaus sein, dass mehrere Mittelwerte übereinstimmen und nur einer oder wenige der Gruppenmittelwerte von dem einheitlichen Mittelwert abweichen. Tab. 8.12: Zweifaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit festen Effekten und Interaktion bei der Vergärung von Bananenabfällen Quadratsumme df mittlere F Signifikanz Variationsquelle vom Typ III (Freiheitsgrade) Quadratsumme A: Bioadditiv 9, , , ,00000 B: Raumbelastung 0, , , ,00000 Interaktion A*B 1, , , ,00000 Residuen (Fehler) 0, ,00527 Gesamt (korrigiert) 11, Abhängige Variable: Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = - 0,43443)

165 Ergebnisse und Diskussion 165 Um zu bestimmen, welche Mittelwerte sich von den anderen signifikant unterscheiden, wurden dann mehrfachvergleichende Tests für jeden Faktor auf verschiedenen Konfidenzniveaus durchgeführt. Tab zeigt die Ergebnisse dieser Tests mit dem Faktor Bioadditiv nach dem LSD Kontrasttest ab dem 95 %-Konfidenzniveau. Die Mischproben bzw. Gruppen, die sich als homogen erwiesen haben, sind in der Tabelle jeweils mit einem bestimmten Zeichen markiert. So sind auch hier zwei unterschiedliche homogene Gruppen mit jeweils einem X und einem gekennzeichnet. Tab. 8.13: Mehrfachvergleiche bei der Vergärung von Bananenabfällen mit dem Faktor Bioadditiv nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest Bioadditiv LS Mittelwert LS Sigma (σ) Blindprobe (KTL) 2, ,02614 Homogene Gruppen* %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 Papain (P) 2, ,02420 X X X X X X Bacillus (B) 2, ,02420 X X X X X X Rumensaft (R) 3, ,02420 PB 2, ,02420 X X X X X X PR 3, ,02420 BR 3, ,02614 PBR 2, ,02420 * Mehrfachvergleiche Für Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = -0,43443). LS: Least Significant" Man kann beobachten, dass je höher das Konfidenzniveau ist (dabei niedriger α), desto mehr homogene Gruppen entstehen. Zwischen den 95 % und 98 %- Konfidenzniveaus sind z. B. P, B, PB homogen und oberhalb des 99 %- Konfidenzniveau wurden PR und BR als neue homogene Gruppe identifiziert. Alle Mitglieder dieser Gruppen wurden mit Papain und Bacillus sp. angeimpft, die, wie oben erwähnt, eine Hemmwirkung zu haben scheinen. KTL, R und PBR haben sich auf allen Konfidenzniveaus als die von den anderen Gruppen unabhängige Mischprobengruppen gezeigt. Die Details des LSD-Tests sind der Tab zu entnehmen. Dabei werden die Ergebnisse gezeigt, die aus Untersuchungen bei verschiedenen Konfidenzniveaus hervorgehen und die sich potentiell paarweise in ihren Mittelwerten unterscheiden. Die Mittelwertunterschiede zwischen den Paaren innerhalb jeder in Tab dargestellten homogenen Gruppe wurden hier als nicht signifikant bestätigt und mit einem gekennzeichnet.

166 Ergebnisse und Diskussion 166 So wird z. B. die Differenz zwischen dem Mittelwert von P und dem jeweiligen von PB als nicht signifikant bestätigt, da diese bei allen Konfidenzniveaus zu derselben homogenen Gruppe gehören. Bei 95 %-Konfidenz (α = 0,05 %) gibt es ein 5 %-iges Risiko zu behaupten, dass die Paare der Mittelwerte sich voneinander unterscheiden, wenn der wirkliche Unterschied gleich Null ist. Tab. 8.14: Paarweise Vergleiche bei der Vergärung von Bananenabfällen mit dem Faktor Bioadditiv nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest Vergleich* Differenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 +/- Limite +/- Limite +/- Limite Blindprobe (KTL) - Papain (P) 0, , , , , , ,15173 Blindprobe (KTL) - Bacillus (B) 0, , , , , , ,15173 Blindprobe (KTL) - Rumensaft (R) -0, , , , , , ,15173 Blindprobe (KTL) - PB 0, , , , , , ,15173 Blindprobe (KTL) - PR -0, , , , , , ,15173 Blindprobe (KTL) - BR -0, , , , , , ,15746 Blindprobe (KTL) - PBR -0, , , , , , ,15173 Papain (P) - Bacillus (B) -0, , , , , , ,14578 Papain (P) - Rumensaft (R) -1, , , , , , ,14578 Papain (P) - PB -0, , , , , , ,14578 Papain (P) - PR -0, , , , , , ,14578 Papain (P) - BR -0, , , , , , ,15173 Papain (P) - PBR -0, , , , , , ,14578 Bacillus (B) - Rumensaft (R) -0, , , , , , ,14578 Bacillus (B) - PB 0, , , , , , ,14578 Bacillus (B) - PR -0, , , , , , ,14578 Bacillus (B) - BR -0, , , , , , ,15173 Bacillus (B) - PBR -0, , , , , , ,14578 Rumensaft (R) - PB 1, , , , , , ,14578 Rumensaft (R) - PR 0, , , , , , ,14578 Rumensaft (R) - BR 0, , , , , , ,15173 Rumensaft (R) - PBR 0, , , , , , ,14578 PB - PR -0, , , , , , ,14578 PB - BR -0, , , , , , ,15173 PB - PBR -0, , , , , , ,14578 PR - BR -0, , , , , , ,15173 PR - PBR 0, , , , , , ,14578 BR - PBR 0, , , , , , ,15173 * Für Gesamtbiogasmenge (Transformationen: Log (Gesamtbiogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = -0,43443) %-Konfidenz +/- Limite +/- Limite +/- Limite Ähnlich wie beim Faktor Bioadditiv wurde der LSD-Test mit dem zweiten Faktor Raumbelastung durchgeführt. Tab zeigt die Ergebnisse dieses Tests auf den gleichen Konfidenzniveaus mit der Raumbelastung als Faktor. Die gelisteten Raumbelastungen vertreten jeweils den Mittelwert jeder Gruppe gleicher Raumbelastungen. Es wurden hier bei allen Konfidenzniveaus nur eine homogene Gruppe mit zwei Mitgliedern (6 und 9 gots/l) identifiziert, d. h. die Differenzen in dieser Gruppe können nicht signifikant und diejenigen mit der anderer Gruppe (3 ots/l) signifikant sein. Das wurde durch den nächsten paarweisen Vergleichstest untersucht.

167 Ergebnisse und Diskussion 167 Die Details des LSD-Tests bei gleichen Konfidenznieveaus mit dem Faktor Raumbelastung sind in der Tab dargestellt. Dabei werden die Ergebnisse gezeigt, die aus Untersuchungen bei verschiedenen Konfidenzniveaus hervorgehen und die sich potentiell paarweise in ihren Mittelwerten unterscheiden. Tab. 8.15: Mehrfachvergleiche: LSD-Kontrasttest nach dem Faktor Raumbelastung bei der Vergärung von Bananenabfällen Bioadditiv LS Mittelwert LS Sigma (σ) Homogene Gruppen* %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 3 g ots/l 2, , g ots/l 2, ,01482 X X X X X X 9 g ots/l 2, ,01572 X X X X X X * Mehrfachvergleiche Für Biogasmenge (Transformationen: Log (Biogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = -0,43443). LS: Least Significant" Die Unterschiede zwischen der homogenen Gruppe wurden hier als nicht signifikant auf allen Konfidenzniveaus bestätigt, während sich die Unterschiede zwischen den homogenen und den nicht homogenen Gruppen als signifikant erwiesen. Mit anderen Worten produzierten die drei verwendeten Raumbelastungen signifikant unterschiedliche Biogasgesamtmengen, so dass die Nullhypothese (H0-b) zurückgewiesen werden kann. Tab. 8.16: Paarweise Vergleiche bei der Vergärung von Bananenabfällen mit dem Faktor Raumbelastung nach dem LSD (Least Significant Difference) Kontrasttest Vergleich* Differenz %-Konfidenz 95,00 96,00 97,00 98,00 99,00 99,99 +/- Limite +/- Limite +/- Limite +/- Limite 3 g ots/l - 6 g ots/l -0, , , , , , , g ots/l - 9 g ots/l -0, , , , , , , g ots/l - 9 g ots/l 0, , , , , , ,09202 * Für Gesamtbiogasmenge (Transformationen: Log (Gesamtbiogasmenge + 10) und Optimierung mit Box-Cox mit Potenz λ = -0,43443) +/- Limite +/- Limite Die oben dargestellten Vergleichsergebnisse wurden sowohl nach dem SNK-Test als auch dem Ducan Kontrasttest bestätigt (siehe Anhang B). Unter Einbeziehung der Ergebnisse der Tab (Mehrfachvergleiche mit dem Faktor Bioadditiv), der Tab (paarweise Vergleiche) und der Tab (Mehrfachvergleiche mit dem Faktor Raumbelastung) mit denen der Gesamtbiogasmengen aus Abb. 8.8, ergibt sich, dass die Biogasmengen innerhalb der zwei homogenen Gruppen (P, B, PB bzw. PR und BR) keine signifikanten

168 Ergebnisse und Diskussion 168 Unterschiede aufweisen. Hingegen weisen die Biogasmegen der nicht homogenen Mischungen (KTL, R und PBR) sowie diese im Vergleich zu jeder Mischung der zwei o. g. homogenen Gruppen signifikante Unterschiede auf, wobei hinsichtlich des Biogasvolumens R die Vielversprechendste ist. Wird zusätzlich die Raumbelastung betrachtet, liegen die Biogasmengen bei R mit 6 oder 9 g ots/l am höchsten (siehe Abb. 8.8), und zwischen diesen beiden gibt es keinen signifikanten Unterschied. Aus den Biogasmengen kann man auch folgern und bestätigen, dass Papain und Bacillus sp. bei der Vergärung von Bananenabfällen einen hemmenden Einfluss haben, da beide die produzierten Biogasmengen verringerten (siehe Abb. 8.8), wenn sie einzeln oder beide in Kombination mit Rumensaft eingesetzt wurden (PR, BR und PBR). Obwohl die Bananenabfälle einen höheren Proteingehalt als Papayaabfälle haben (siehe Tab. 7.2), war der negative Effekt von Papain umso stärker je niedriger die Konzentration der Bananenabfälle war Ergebnisse der mikrobiologischen Analysen Eine Übersicht der Gattungen der Mikroorganismen, die vor und nach den Vergärungen der Bananenabfälle bei einer Raumbelastung von 6 g ots/l und allen Behandlungen bestimmt wurden, ist in Tab des Anhangs B dargestellt. Der Grund der bis auf die Ebene der Gattungen durchgeführten Analyse wurden bei Papayaabfällen in Kap dargestellt. Wie Tab des Anhangs B zeigt, wurden bei Bananenabfällen mehr als sechs verschiedene Gattungen vor der Vergärung identifiziert. Eine besondere Bakteriengruppe waren dabei die NFGNB (nicht fermentierende Gram-negative Bakterien), die Gattungen aus mindestens 15 verschiedenen Familien umfassen. Ausführliche Eigenschaften aller identifizierten Mikroorganismen sind der Tab des Anhangs B zu entnehmen. Die überwiegenden Gattungen in den Rohsubstraten der Mischproben waren Pseudomonaden, Klebsiella und Enterobacter. Pseudomonaden und Klebsiella sind in der Natur allgegenwärtig, während Enterobacter in vielen Lebensräumen einschließlich des menschlichen Darmes und des Rinderpansens vorkommen. Das Besondere an diesen Mikroorganismen ist bei Pseudomonaden Toleranz und Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl von physikalischen Bedingungen, bei Klebsiella ihr Wachstum in Obst und Gemüse und bei Enterobacter ihre Zersetzungsfähigkeit und das Wachstum auf toter organischer

169 Ergebnisse und Diskussion 169 Substanz. Daraus kann gefolgert werden, dass eine erhöhte Anzahl dieser drei Mikroorganismenarten in den Bananenabfällen vorliegt. Außerdem kann die Allgegenwärtigkeit der Bacillus sp. ein Grund für ihre Identifizierung vor der Vergärung in der Mischprobe KTL der Bananenabfällen sein, obwohl keine Zugabe dieser Mikroorganismen stattfand. Wie Tab des Anhangs B zeigt, wurden die hier identifizierten temperaturbeständigen Mikroorganismen (Enterobacter und Pseudomonaden) mit Ausnahme von Enterobacter bei PBR durch die thermophile anaerobe Vergärung von Bananenabfällen eliminiert. Die bei PBR nach der Vergärung identifizierten Enterobacter sp. waren sehr resistente Spezies, allerdings lag auch die Aktivität des anaeroben Prozesses bei PBR sehr niedrig (siehe Abb. 8.7 a und b), was ein möglicher Grund für die unvollständige Abtötung der Enterobacter sein kann. Wie in Kap bei Papayaabfällen beschrieben wurde, stellen die vorliegenden Normen in der EU, Mexiko und USA eine Kategorisierung bezüglich der Qualität des Faulschlammes im Hinblick auf seine Verwertung bzw. Entsorgung dar, wobei die biologischen Kontaminationsindikatoren E. Coli, Salmonella sp. Fäkalcoliforme und Hemintheneier einbezogen werden. Wie Tab des Anhangs B zeigt, wurden E. Coli und Salmonella sp. vor und nach den Vergärungen der Bananenabfälle nicht gefunden. In den Bananenabfällen wurde E. Coli im Gegensatz zu anderen Substraten (Zitrusmischung und Hühnermist) vor den Versuchen nicht gefunden. Sie wurden aber durch die themophile Vergärung dieser Substrate eliminiert. E. Coli ist die zahlenmäßig größte Spezies der Fäkalcoliformen und wird daher als spezifischer Indikator anderer Pathogene und fäkaler Kontamination verwendet (213), (216). Obwohl die Bananenabfälle nicht auf Fäkalcoliforme hin untersucht wurden, könnte aus der Elimination von E. Coli gefolgert werden, dass wenn andere Fäkalcoliforme in den Bananenabfällen vorhanden gewesen wären, sie ebenso abgetötet worden wären. Das gleiche kann man bei Salmonelle und Shigellen folgern, da sie ähnliche Überlebenseigenschaften und Anfälligkeiten für Desinfektion wie E. Coli haben, wie EA (2002) berichtete. Helmintheneier werden, wie oben beschrieben, nach Jimenez-Cisneros (2008) bei Temperaturen über 40 C inaktiviert. Aufgrund der hohen Temperatur des thermophilen anaeroben Vergärungsprozesses (55 C) von Bananenabfällen kann

170 Ergebnisse und Diskussion 170 daraus geschlossen werden, dass die evtl. vorhandenen Helmitheneier durch die thermophile Fermentation inaktiviert wurden. Daher war hier auch keine Quantifizierung der Helmintheneier erforderlich. Die Ergebnisse mit Bananenabfällen sind daher vielversprechend, da die Hauptindikatororganismen bzw. Krankheitserreger im Rohsubstrat nicht gefunden oder nach dem thermophilen Prozess eliminiert wurden und das Gärgut dadurch die höchste Kategorisierung aller o. g. Normen und Richtlinien erfüllt. So erwies sich auch die Wirksamkeit des thermophilen anaeroben Prozesses mit Bananenabfällen als Substrat in der Eliminierung von Pathogenen und Krankheitserrergern. Das Gärgut ist daher ebenfalls seuchenhygienisch sicher und kann als Bodenverbesserer bzw. in der Landwirtschaft ohne Risiko eingesetzt werden. Wie bei Papayaabfällen bestätigen diese Ergebnisse ebenso die im Kap. 2.7 dargestellten Berichte von Popova und Bolotina (1962) und von Buhr und Andrews (1977). 8.2 Ergebnisse der Versuche im Großmaßstab In Kap wurde die Ausführung dieser Versuche behandelt. Nach der jeweiligen Anfahrphase und dem Erreichen eines steady-state, d. h. eines stabilen Zustandes, der hier durch eine kontinuierliche Biogasproduktion und relativ konstante Werte der Prozess- und Bewertungsparameter gekennzeichnet war, wurde eine 7-wöchige Untersuchungsphase durchgeführt. Allerdings wurde bis zur zwölften Woche bei allen untersuchten Abfallsubstraten zur Kenntnis des weiteren Verhaltens der Biogasproduktion die Beschickung mit der letzten den Reaktoren gegebenen Substratmenge (damit der letzten einhergehenden Raumbelastung) weiter durchgeführt, außerdem wurden einige Feldparameter (Biogasmenge und Temperatur) weiter gemessen. Mit Ausnahme vom ph-wert, dem Redoxpotential (ORP) und der Biogasmenge, die direkt bei den Reaktoren erhoben wurden (siehe ), wurden die im Folgenden dargestellten Ergebnisse am beprobten Material gewonnen, das aus den Fermentern entnommen wurde. Die Ergebnisse spiegeln daher im Wesentlichen die Gärbedingungen in den Reaktoren wieder, in deren Abhängigkeit die jeweilige Biogasmenge produziert wurde.

171 Ergebnisse und Diskussion Ergebnisse der Versuche mit Papayaabfällen als Substrat Wie in Kap beschrieben, wurde im Kleinmaßstab bei Batch- Vergärungversuchen mit Papayaabfällen die maximale Biogasmenge am vierten Tag erreicht. Allerdings lief die Biogasproduktion der Vergärung nur mit Rumensaft bis zum neunten Tag (siehe Abb. 8.4), was mit der von Kleemann und Meliß (1993) getroffenen Aussage übereinstimmt, dass die thermophilen Bakterien eine Faulzeit von 3 bis 10 Tage benötigen. Da es sich im Großmaßstab um halbkontinuierliche Versuche (mit halbkontinuierlicher Beschickung) handelte, wurde hier aus praktischen Gründen eine Beschickung im Bereich von 3-9 Tagen, d. h. einmal pro Woche, ausgewählt, woraus indirekt eine Verweilzeit des Papayasubstrats in den Reaktoren von 7 Tagen entstand. Bei der jeweiligen Anfahrphase wurden den Reaktoren aufgrund einer geringen Biogasproduktion zweimal mit Rumensaft mit jeweils 3,04 und 7,99 g ots/l als Inokulum beschickt. Die allgemeine Zusammensetzung der verwendeten Papayas wurde in Kap diskutiert. Die TS- und ots-gehalte dieser Papayas waren 6,58 bzw. 5,70 Mass.-%. Tab zeigt eine Übersicht der sich aus der Beschickung ergebenden Parameter. Da bei den jeweiligen Versuchen im Kleinmaßstab, wobei die kleinste Raumbelastung 3 g ots/l war, die Biogasausbeuten, die auf die ots des zugegebenen Substrats bezogen sind, einen abnehmenden Trend bei zunehmender Raumbelastung aufwiesen (siehe Tab. 8.2), wurde hier mit einer kleineren Raumbelastung begonnen. Daher wurden während des Versuchszeitraums zwei unterschiedlichen Raumbelastungen, und zwar von rund 0,5 g ots/l Woche (0,06 g ots/l d) bzw. 1,6 g ots/l Woche (0,22 g ots/l d) untersucht. Diese Raumbelastungen entsprachen den wöchentlichen Substratmengen von 149 g (8,5 g ots) bzw. 526,7 g (30,02 g ots). Die niedrige Substratmenge wurde bis zur fünften Woche eingesetzt, um Überlastungen zu vermeiden sowie eine allmähliche Adaptation der Rumenmikroorganismen an die ungewöhnlichen Millieubedingungen zu ermöglichen. Sobald ein niedriger bzw. abnehmender ots-gehalt (durch hohe ots-abbauraten) in den Reaktoren beobachtet wurde, was auf eine höhere Aktivität bzw. Adaptation der Mikroorganismen hindeutet, wurde dann ab der sechsten Woche die Raumbelastung mit 1,6 g ots/l Woche (0,22 g ots/l d) auf das ca. 3,2-fache bzw. auf die Substratmenge von 526,7 g (30,02 g ots) erhöht.

172 Ergebnisse und Diskussion 172 Während der Vergärungszeit schwankten der wöchentlich durchnittliche ots-gehalt des Gärmaterials zwischen 1,22 und 5,02 Mass.-% und der durchnittliche TS-Gehalt zwischen 3,12 und 7,11 Mass.-%, was unter dem TS-Grenzwert von 10 Mass.-% (24), (21) liegt. Die Differenzen zwischen den mittleren wöchentlichen ots-gehalten sind auf die unterschiedlichen ots-abbaugrade zurückzuführen. In Abhängigkeit davon bewegte sich zudem das ots-bezogene Inokulum/Substrat-Verhältnis zwischen ca. 4 und 14 und nahm bei steigendem ots-gehalt ab. Tab. 8.17: Beschickungsabhängige Parameter bei der anaeroben Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft Woche Beschickung Raumbelastung ots- Substrat Gehalt (g ots/woche) (g/woche) (g ots/l Woche) (g ots/l d) (%) Verhältnis (I/S) 1 149,00 8,49 0,43 0,06 5,02 4, ,00 8,49 0,43 0,06 2,58 8, ,00 8,49 0,44 0,06 3,85 5, ,00 8,49 0,44 0,06 3,47 5, ,00 8,49 0,45 0,06 1,22 14, ,70 30,02 1,56 0,22 3,32 4, ,70 30,02 1,56 0,22 3,16 4, Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter In Tab sind die Durchschnittswerte von den chemisch-physikalisch organischen und anorganischen Summenparametern, von CSB:N:P-Mindestverhältinis, sowie von den ph- und ORP-Werten und von ots-abbaugrad dargestellt. Aus Kapazitätsgründen konnten nicht bei allen Versuchen alle Parameter kontinuierlich analysiert werden. Das in einem kohlenhydrathaltigen Substrat gewünschte Nährstoffverhältnis von 300:5:1 (15) war am Ende jeder Versuchswoche in den Reaktoren mit Papayaabfällen gegeben. Daher kann angenommen werden, dass auch zu Beginn jeder Woche kein Mangel an diesen Nährstoffen bei der anaeroben Vergärung bestand. Der niedrige Gehalt an Proteinen in Papaya wird durch den geringen Gesamtstickstoffgehalt von ca. 1,5 g/kg in frischer Papaya (siehe Tab. 7.1) bedingt. Der pure Rumensaft hingegen wies einen niedrigen Gesamtstickstoffgehalt von ca. 1,2 g/kg auf (siehe Tab. 7.1), was mit einem noch geringeren Proteinhalt von ca. 0,38 Mass.-% (siehe Tab. 7.3) im verwendeten Rumensaft einherging. Ein Teil des Gesamtstickstoffgehaltes lag als Ammoniak-Stickstoff vor. Im Wochenmittel lag der Gehalt an Ammoniak-Stickstoff zwischen ca. 541 und ca. 910 mg/l. Wie in Tab. 7.1

173 Ergebnisse und Diskussion 173 dargestellt, betrug die ursprüngliche NH3-N-Konzentration des puren Rumensaftes 590 mg/l, was über der von Liu und Sung (2002) für den anaeroben Prozess als optimal ermittelten Amoniak-Konzentration von 200 mgl/l liegt. Aufgrund eines stabilen anaeroben Prozesses im Rinderpansen kann als Grenzwert der Ammoniakkonzentration ein Wert von 590 ml/l angenommen werden. Die über diesem Wert ermittelten Amoniak-Stickstoff Konzentrationen können, wie Van Velsen (1981) bei seinen Versuchen beobachtete, auf die verwendeten thermophilen Temperaturen zurückgeführt werden. Tab. 8.18: Mittelwerte chemisch-physikalischer Parameter und des Nährstoffverhältnisses bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft Woche CSB N P Verhältnis (mg/l) CSB : N : P NH 3 -N (mg/l) , ,33 110,23 524,77 15,78 1,00 825,56 6,01-182, , ,67 124,21 719,30 21,69 1,00 905,84 5,85-178,33 49, , ,00 540,88 6,59-143,33-48, , ,00 83,06 800,70 24,78 1,00 828,58 7,46-176,33 10, , ,00 776,79 7,14-195,00 65,95 6 7,38-208,33-166,16 7 6,84 ph ORP ots Abbau (%) Nach Angelidaki und Ahring (1994) führen Amoniakkonzentrationen über 700 mg/l zu einer niedrigen Prozessleistung. Das führt zugleich zu einer Anhäufung von nicht abgebauten Zwischenprodukten (u. a. flüchtige Fettsäuren). Die bei einer Überlastung oder sonstigen Störung des Prozesses auftretende Zunahme an flüchtigen Fettsäuren bewirkt nach Wellinger et al. (1991) bei hohen Konzentrationen einen fallenden ph-wert. Dies führt zu einer Kettenreaktion, da wie Rödiger et al. (1990) berichteten, der von den Methanogenen durchgeführte Acetatabbau bei ph- Werten < 6,5 deutlich gehemmt wird, was die Anhäufung von Zwischenprodukten mit Acetat weiter fördert. Liegt der ph-wert unter 6,2 ist das Milieu nach Stadlbauer (1982) für Methanbakterien toxisch. Das führt zu einer weiteren Anhäufung von Zwischenprodukten, besonders von Essigsäure und Acetat. Wie in Kap beschrieben, liegen Grenzwerte für die Konzentrationen einzelner flüchtiger Fettsäure vor. Die Bildung von Methan geht bei einem Überangebot von Säuren (vor allem an Essigsäure, Propionat bzw. Propionsäure und Iso-Buttersäure) zurück. Dies führt zu einer weiteren Steigerung der Konzentrationen an Säuren. Die hohen

174 mg/l Ergebnisse und Diskussion 174 Säurekonzentrationen (auch bei nur Essigsäure) wirken hemmend auf den Stoffwechsel der Essigsäure abbauenden Methanbakterien. Bei den Versuchen mit Papayaabfälen wurde eine niedrige Prozessleistung bis zur dritten Woche anhand niedriger ph-werte, höherer ORP-Werte (siehe Tab. 8.18), sowie hoher Konzentrationen an Essigsäure und niedriger Biogasmenge (siehe Abb und Abb. 8.12) erkannt. Die Acetat abbauenden Methanbakterien sollten besonders in den ersten zwei Wochen gehemmt worden sein, weil der ph-wert unter 6,2 lag und die Essigsäurekonzentration über dem nach Aschmann et al. (2007) günstigen Bereich von mg/l lag. Abgesehen von Essigsäure und Iso- Buttersäure lagen die organischen Säuren während der Versuchszeit bei den zwei verwendeten Raumbelastungen in günstigen Konzentrationen, wobei die hohe Raumbelastung der letzten zwei Wochen niedrigere Konzentrationen aufwies. Die Konzentration an Essigsäure schwankte von der zweiten bis zur vierten Woche im Bereich von mg/l. Der Gehalt an Iso-Buttersäure lag bis zur dritten Woche höher als der von Schlowin et al. (2009) genannte Schwellenwert der Hemmung von 50 mg/l. Buttersäure war nur in der zweiten Woche vorhanden, während Essigsäure, Iso-Buttersäure und Iso-Valeriansäure ab der fünften bzw. vierten und sechsten Woche nicht mehr detektiert wurden Zeit (Wochen) Beschickung: Woche = 1 Mal (0,44 g ots/l Woche) Woche = 1 Mal (1,56 g ots/l Woche) Essigsäure Propionsäure Iso-Buttersäure Buttersäure Iso-Valeriansäure Valeriansäure M-Valeriansäure Hexansäure Önanthsäure Abb. 8.11: Konzentrationen an organischen Fettsäuren bei der Vergärung von Papayaabfallen mit Rumensaft Die Anhäufung der Säuren (vor allem Essigsäure) war bis zur dritten Woche mit ph- Werten < 6,6 verbunden und ließ sich sogar in der dritten und der sechsten Woche

175 Ergebnisse und Diskussion 175 durch negative ots-abbaurate erkennen (siehe Tab. 8.18). D. h. die organische Trockensubstanz wurde ebenso angehäuft. Wie in Kap beschrieben, können anaerobe Bakterien an höhere Stickstoffkonzentrationen adaptiert werden, und ebenso ist nach Koster und Lettinga (1988) oder Dauber (1993) die Toxizität des Gesamtammoniaks reversibel. Nach Velsen (1981) kann eine adaptierte Bakterienflora noch bei Ammoniakkonzentrationen von 5000 mg/l arbeiten. Genau diese Adaption der Biomasse konnte bei der ersten beschickten Substratmenge von 149 g ab der vierten Woche beobachtet werden. Es ließen sich sowohl steigende ph-werte in dem von verschiedenen Autoren (16), (15), (21), (23) (siehe Kap ) genannten günstigen Bereich von 6,5 bis 7,5 sowie abnehmende ORP-Werte, höhere Biogasmengen und positive ots-abbauraten nachweisen. Auf dieser Basis wurde dann in der sechsten Woche die Raumbelastung 1,6 g ots/l Woche erhöht, was zu einer kurzen Überlastung der bereits an die erste Raumbelastung angepassten Mikroorganismen und damit zu einer neuen Anhäufung von nicht abgebauten organischen Zwischenprodukten und ebenso erneut zu einer Anhäufung der organischen Substanz führte. Da sich im Laufe der nächsten Woche der ots-gehalt wieder abgebaut wurde, kann die Anpassungsfähigkeit der Mikroorganismen bestätigt werden. Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft bei thermophilen Temperaturen das Risiko einer Ammoniakhemmung auch bei niedrigen Raumbelastungen vorhanden ist. Nach einiger Zeit jedoch findet eine Adaption der Bakterien statt, so dass die Belastung sogar erhöht werden kann ohne weitere Störung der Prozessstabilität, sondern mit einer zunehmenden Verbesserung des Prozesses. Außerdem schwankte die Differenz zwischen dem Gesamtstickstoff und dem Ammoniak-Stickstoff zwischen ca. 0,9 und 1,8 g N/l. Wäre die gesamte Stickstoffdifferenz rein theoretisch in NH4 + -N umgewandelt worden, würde der sich ergebende Ammoniumstickstoff in gleichem Bereich liegen. In der Literatur (siehe Kap ) ist die Hemmschwelle der NH4 + -N-Konzentration von ph-wert und Temperatur abhängig. Nach Kroiss (1986) und Koster und Lettinga (1983) liegt sie bei einem ph-wert von 7,0 und einer Temperatur von 38 ⁰C bei einer NH4 + -N- Konzentration von ca. 4 g/l. Nach Schlowin (2009) wirken Ammoniumkonzentrationen zwischen 2,7 und 10,0 g/l hemmend. Anhand dieser Daten können die Ergebnisse des Versuches im Kleinmaßstab bestätigt werden, dass unter diesen

176 Ergebnisse und Diskussion 176 Milieubedingungen bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft keine Gefahr der Ammoniumhemmung vorliegt. Ebenso kann aufgrund der niedrigen Proteingehalte der Papaya und des Rumensaftes bestätigt werden, dass bei der Vergärung beider Materialien eine Schwefelhemmung ausgeschlossen werden kann. Bezogen auf Spurenelemente und Schwermetalle haben sich die Papayaabfälle und der Rumensaft bei der gemeinsamen Vergärung gegenseitig ergänzt bzw. verdünnt. Wie in Kap behandelt wurde, weist Papaya verschiedene für den anaeroben Prozess günstigen Mineralien (Fe, Zn, Cu, Mn und Se) auf. Einge davon liegen im Bereich der günstigen Spurenelementekonzentrationen (Fe, Mn) vor. An anderen mangelt es (Se), oder sie gehören zu denen (Zn, Cu), für die keine Angaben über die Konzentrationen vorliegen. Andere für den anaeroben Prozess günstige Mineralien bzw. Schwermetalle (I, As, W, Mo, Co, Ni, Cr, Pb, Cd und Hg) sind nach USDA (2011) in Papaya nicht vorhanden. Bei Abfällen aus Rinderpansen (Rindergülle, -mist und -panseninhalt) hingegen liegen nach Tab. 2.9 die für den anaeroben Prozess relevanten Spurenelemente bzw. Schwermetalle (Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb und Zn) in mehr oder weniger günstigen Konzentrationen vor. Bei den Versuchen mit Rumensaft, wurden dem Prozess durch die Beschickung mit Papayaabällen zusätzliche Mengen an Spurenelementen zugegeben. Obwohl einige Spurenelemente bzw. Schwermetalle in beiden Rohstoffen vorhanden sind (siehe Tab. 2.9 und Tab. 7.2), können die aus ihrer Mischung resultierenden Schwermetallkonzentrationen aufgrund ihrer niedrigen Ausgangskonzentration die nach Tab schädlichen Konzentrationen nicht überschreiten. Nach Vergleich von Tab. 2.9 und Tab könnten nur Kupfer und Zink bei Rindergülle und unbehandeltem Panseninhalt die entsprechenden Grenzwerte überschreiten. Wie in Kap erwähnt, spielen dafür die den Rindern gegebenen Nahrungsmittel, Medikamente und Antibiotika eine wichtige Rolle. Wird jedoch Rumensaft wie hier, aus gesiebtem Panseninhalt gewonnen, wobei die TS auf ca. 28 % reduziert wird, ist dann bei Kupfer und Zink eine Überschreitung der Grenzwerte kaum möglich. Dies bestätigen die entsprechenden Versuchsergebnisse des Kleinmaßstabes, dass bei der Vergärung von Papayaabfällen zusammen mit Rumensaft keine Gefahr durch enthaltene Schwermetalle besteht.

177 Biogas (ml/d) Ergebnisse und Diskussion Biogasmengen und ausbeuten Abb zeigt die mittleren täglichen Biogasmengen der Gärversuche von Papayaabfällen mit Rumensaft. Die durchschnittliche Biogasproduktion der ersten fünf Wochen mit einer Raumbelastung von ca. 0,4 g ots/(l Woche) lag bei ca. 5,2 l/d; damit wurde eine berechnete tägliche spezifische Produktion von 0,3 l/(l Reaktor) erzielt. Während der folgenden zwei Wochen wurde bei einer Raumbelastung von ca. 1,6 g ots/(l Woche) eine durchschnittliche Biogasproduktion von ca. 7,0 l/d mit einer berechneten spezifischen Produktion von 0,4 l l/(l Reaktor) erzielt. Bei der o. g. 3,5-fachen Erhöhung von TS und ots des zugegebenen Substrates wies die tägliche Biogasmenge eine Zunahme von 34,6 % auf, während die spezifische Biogasproduktion um 33,33% zunahm Abb. 8.12: Tägliche Biogasproduktion bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft Hinsichtlich der Biogasausbeute wurden zusätzlich zu der gewöhnlich auf den ots- Gehalt des beschickten Substrats bezogenen Biogasausbeute weitere auf andere Prozessparameter (ots-abbaumenge, zugegebener ots-gehalt des Rumensaftes und gesamter ots-gehalt im Reaktor) bezogene Biogasausbeuten ermittelt. Dies sollte nur dazu dienen, die entsprechende Leistung der aus diesen Parametern resultierenden Einflüsse zu erkennen. In Tab des Anhangs C sind in relativen Werten sowohl die Biogasmengen als auch die o. g. Biogasausbeuten dargestellt. Wie in Kap erwähnt, könnte in der Biogastechnik die auf ots-abbaumengen bezogene Biogasausbeute für die genaue Leistungsbestimmung des eingesetzten Substrats verwendet werden Zeit (Wochen) Beschickung: Woche = 1 Mal (0,44 g ots/l Woche) Woche = 1 Mal (1,56 g ots/l Woche) Abb zeigt sowohl die wöchentliche mittlere Biogasmenge als auch die Biogasausbeuten bezogen auf den ots-gehalt des zugeführten Substrats, auf den

178 Ergebnisse und Diskussion 178 ots-gehalt des Rumensafts und auf den gesamten ots-gehalt im Reaktor. Mit zunehmender Belastung der Reaktoren erhöhte sich die Biogasmenge, wobei die niedrige eingesetzte Raumbelastung von ca. 0,5 g ots/(l Woche) eine niedrigere Biogasmenge erzeugte als die höhere Raumbelastung von ca. 1,6 g ots/(l Woche). Die maximale Biogasmenge der ersten fünf Wochen betrug 42,8 l während sie in den nächsten zwei Wochen bei 49,2 l lag. Bei ansteigender Reaktorenbelastung wiesen die auf den ots-gehalt des Substrats bezogenen Biogasausbeuten unterschiedliches Verhalten auf. Die maximale Biogasausbeute betrug in der fünften Woche bei einer Raumbelastung von ca. 0,5 g ots/(l Woche) bei einem maximalen ots-abbau von ca. 66 Mass.-% (siehe Tab. 8.18) etwa 760 ml/g ots. Diese Biogasausbeuten der zwei untersuchten Raumbelastungen waren höher als die gewonnenen Biogasausbeuten bei den Versuchen im Kleinmaßstab mit Papayaabfällen, die höchstens 21,2 ml/g ots mit einer ots-reduktion von ca. 28 Mass.-% erreichten. Caballero-Arzápalo et al. (2010) berichteten eine ots-reduktion von ca. 20 Mass.-% bei der Kontrollprobe bei den Versuchen im Kleinmaßstab mit Papayaabfällen. Der Unterschied kann auf den Einfluss des hier eingesetzten höheren Inokulum/Substrat-Verhältnisses von über 4 zurückgeführt werden, wobei ein Inokulum/Substrat-Verhältnis von 14 der maximalen Biogasausbeute entsprach. Obwohl Owen et al. (1979) ein Inokulum/Substrat- Verhältnis von 1 als Standard empfahlen, stimmte der hier eingesetzte Bereich mit dem Ergebnis von Chymoweeth et al. (1993) überein, dass eine Erhöhung des Inokulum/Substrat-Verhältnisses für einige Arten von Substraten nötig ist. Auch Zhou et al. (2011) zeigten dies bei Vergärungsversuchen von Bohnenabfällen mit anaeroben Faulschlamm bei Inokulum/Substrat-Verhältnissen im Bereich von 0,33 bis 10. Die sich ergebenden höheren Inokulum/Substrat-Verhältnisse können auf zwei Ursachen zurückgeführt werden. Erstens kann das ungewöhnliche Substrat nur gering durch die Rumensaftmikroorganismen abgebaut werden, zweitens ist die Überlebensfähigkeit bzw. die Aktivität der Mikroorganismen des verwendeten Rumensafts bei thermophilen Temperaturen niedrig, so dass in beiden Fällen eine höhere Inokulumsmenge nötig wird. Volumenbezogen machte das Inokulum anfangs ca. 70 Vol.-% des Fermenterfüllvolumens aus, was bei etwa der oberen Grenze des nach der Literatur (170), (171) gewöhnlich eingesetzten Bereiches von 2-67 Vol.-% lag.

179 Biogasmenge (ml/woche) Biogasausbeuten (ml/g ots) Ergebnisse und Diskussion 179 mittlere Biogasmenge Biogasausbeute bez. auf den ots- Gehalt des zugeführten Substrats Biogasausbeute bez. auf den ots- Gehalt des Rumensafts Biogasausbeute bez. auf den gesamten ots-gehalt im Reaktor Zeit (Wochen) Beschickung: Woche = 1 Mal (0,44 g ots/l Woche) Woche = 1 Mal (1,56 g ots/l Woche) Abb. 8.13: Biogasmenge und -ausbeuten bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft Die maximale Biogasausbeute von 760 ml/g ots ist deutlich höher als die maximale Biogasausbeute (bei der kleinsten Raumbelastung) des entsprechenden Versuches mit Rumensaft im Kleinmaßstab (siehe Tab. 8.2) und ähnlich wie die gewonnene von Guangqing et al. (2009) von 778 ml/g ots bei thermophilen anaeroben Gärversuchen von Speiseabfällen mit thermophilem anaerobem Faulschlamm als Inokulum. Sie liegt jedoch höher als die Biogasausbeute aus ihren Versuchen bei gleichen Temperaturen von Grünabfällen mit einer 1:1 Mischung aus Speise- und Grünabfällen, welche bei 631 bzw. 716 ml/g ots lagen. Die auf den ots-gehalt des Substrates bezogenen Biogasausbeuten bei thermophilen Temperaturen sind ca Vol.-% höher als die Biogasausbeuten des von Raposo et al. (2006) durchgeführten Versuches mit Mais und Faulschlamm als Inokulum. Sie sind ebenso höher als die Biogasausbeuten in anderen Versuchen von Guangqing et al. (2011) mit Speiseabfällen, Grünabfällen und einer 1:1 Mischung aus Speise- und Grünebfällen mit Faulschlamm, welche im Bereich von ml/g ots lagen. Hinsichtlich des Abbaus der organischen Substanz und abgesehen von den Zeiträumen ohne weitergehenden Abbau mit Anhäufungen von Zwischenprodukten, schwankte der ots-abbau zwischen 6,8 und 66 Mass.-%, wie in Tab dargestellt ist. Der ots-abbau beim entsprechenden Versuch mit Rumensaft im Kleinmaßstab lag im o. g. Bereich (siehe Tab. 8.1). Guangqing et al. (2009) beobachtete bei thermophilen Temperaturen mit Faulschlamm als Inokulum

180 Ergebnisse und Diskussion 180 zunehmende ots-reduktionsraten bei zunehmenden ots-bezogenen Inokulum/Substrat-Verhältnissen. Bei Inokulum/Substrat-Verhältnissen von 0,2 bis 0,63 wurden ots-reduktionen im Bereich von 54,3-93,6 Mass.-% bei einer Vergärung von Speiseabfällen, von 55,5-92,2 Mass.-% bei einer Vergärung von Grünabfällen und von 60,2-90,8 Mass.-% bei einer Vergärung der 1:1 Mischung von Speiseabfällen und Grünabfällen beobachtet. Die hier maximal erreichte ots- Reduktion liegt in den o. g. Bereichen. Zusätzlich zu den höheren Biogasausbeuten bei thermophilen Temperaturen sind diese ots-reduktionsraten ebenso höher als die bei mesophilen Temperaturen aus Vergärungsversuchen anderer Autoren (172), (221), (175), welche normalerweise im Bereich von Mass.-% liegen. Wie in Abb ebenso dargestellt, stiegen die auf den ots-gehalt des zugeführten Rumensafts bezogenen Biogasausbeuten und die auf den gesamten ots-gehalt im Reaktor bezogenen Biogasausbeuten ähnlich leicht an, bei steigender Belastung der Reaktoren. Außer der auf den gesamten ots-gehalt im Reaktor bezogenen Biogasausbeute von ca 185 ml/g ots der fünften Woche lagen die Werte zwischen 33 und 80 ml g/ots, während die auf den ots-gehalt des zugeführten Rumensaftes bezogenen Biogasausbeuten zwischen 39 und 65 ml g/ots lagen und damit mit den Werten der Versuche im Kleinmaßstab bei niedrigeren Raumbelastungen übereinstimmen. Daraus kann ebenso gefolgert werden, dass die Leistung der Rumensaftmikroorganismen etwa gleich ist, wenn die Raumbelastung nicht über 6 g ots/l liegt Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Papayaabfällen mit Rumensaft Wie in Kap beschrieben, wurden nichtparametrische Methoden bei den Versuchen mit Papayaabfällen im Großmaßstab eingesetzt. Diese wurden zur Bestimmung der evtl. signifikanten Differenzen zwischen den produzierten wöchentlichen Biogasmengen aufgrund der unterschiedlichen verwendeten Raumbelastungen als auch zur Überprüfung der jeweiligen Hypothesen (siehe Kap. 5.2) verwendet. Da hier zwei unterschiedliche Raumbelastungen (0,44 bzw. 1,56 g ots/l Woche) eingesetzt wurden, wurde bei der Nullhypothese angenommen, dass die produzierten Biogasmengen beider Raumbelastungen identischen abhängigen Verteilungen entstammen. Mit dem Vorzeichentest wurde

181 Ergebnisse und Diskussion 181 ein paarweiser Vergleich zweier abhängiger Verteilungen durchgeführt. Die statistischen Ergebnisse, die in Tab dargestellt sind, wurden durch den Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test bestätigt bwz. ergänzt, da wie in beschrieben, er im Vergleich zum Vorzeichentest zusätzlich die Größe der Unterschiede und nicht nur das Vorzeichen der Differenzen berücksichtigt. Wie Tab zeigt, ist die Wahrscheinlichkeit (0,375) (exakte Signifikanz 2-Seitig) größer als 0,05. Daher haben die zwei Raumbelastungen keinen signifikanten Unterschied auf die abhängige Variable (Biogasmenge) auf dem 95 %- Konfidenzniveau verursacht. D. h. die Wahrscheinlichkeit gleicher Mittelwerte der produzierten Biogasmengen aus der Vergärung der Papayaabfällen mit Rumensaft bei beiden Raumbelastungen ist so groß, dass bei diesem Substrat die Nullhypothese (H0-e), der zufolge kein Unterschied zwischen den Mittelwerten besteht (siehe Kapitel 5.2), nicht zurückgewiesen werden kann. Tab. 8.19: Vorzeichentest bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft: Teststatistiken Paarweise Vergleiche RB 1 - RB 2 Exakte Signifikanz (2-Seitig) 0,375 a Exakte Signifikanz (1-Seitig) 0,188 Punkt-Wahrscheinlichkeit 0,156 a. Binomialverteilung verw endet RB: Raumbelastung In Tab sind die statistischen Ergebnisse des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests aufgeführt. Dabei wird durch die asymptotische Signifikanz zweiseitiger Verteilungen (P = 0,138 > 0,05) bestätigt, dass zwischen den Biogasmengengruppen beider Raumbelastungen kein signifikanter Unterschied existiert. Tab. 8.20: Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft: Teststatistiken Z -1,483 a Asymptotische Signifikanz (2-Seitig) 0,138 Exakte Signifikanz (2-Seitig) 0,188 Exakte Signifikanz (1-Seitig) 0,094 Punkt-Wahrscheinlichkeit 0,031 a. Basierend auf positiven Rängen RB: Raumbelastung Im Anhang C sind zusätztlich die Frequenzen (Tab ) bzw. die Ränge (Tab ) dieser zwei Methoden dargestellt. Paarweise Vergleiche RB 1 - RB 2

182 Ergebnisse und Diskussion Ergebnisse der Versuche mit Bananenabfällen als Substrat Bei den Batch-Gärungsversuchen im Kleinmaßstab mit Bananenabfällen wurde die maximale akkumulierte Biogasmenge meist am fünften Tag erreicht (siehe und Abb. 8.9 ). Die jeweilige Biogasproduktion der Vergärung nur mit Rumensaft lief bis zum neunten Tag und bestätigt somit die von Kleemann und Meliß (1993) getroffenen Aussagen (siehe Kap ). Wie bei der Vergärung von Papayaabfällen, wurde bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft im Großmaßstab eine Beschickung im Bereich von 3-9 Tagen, d. h. im Schnitt ein Mal pro Woche, ausgewählt, woraus eine Verweilzeit des Bananensubstrats in den Reaktoren von 7 Tagen entstand. Bei der jeweiligen Anfahrphase wurden die Reaktoren auch hier aufgrund einer geringen Biogasproduktion zweimal mit Rumensaft als Inokulum beschickt. Die allgemeine Zusammensetzung der verwendeten Bananen wird in Kap dargestellt. Die TS- und ots-gehalte der in diesem Versuch verwendeten Bananen betrugen 8,51 bzw. 7,49 Mass.-%. Tab zeigt eine Übersicht der sich aus der Beschickung ergebenden Parameter. Da bei den jeweiligen Versuchen im Kleinmaßstaß, wobei die kleinste Raumbelastung 3 g ots/l war, die Biogasausbeuten, die auf die ots des zugegebenen Substrats bezogen sind, einen abnehmenden Trend bei zunehmender Raumbelastung aufwiesen (siehe Tab. 8.10), wurde hier, wie bei Papayaabfällen, mit einer kleineren Raumbelastung begonnen. Die Reaktoren wurden in der ersten Woche einmal pro Woche beschickt. Aufgrund einer unstabilen und täglich sinkenden Biogasproduktion in der ersten Woche wurde die Beschickung in der zweiten Woche auf zweimal und ab der dritten bis zur sechsten Woche auf dreimal erhöht. In der siebten Woche wurde aufgrund der hohen Beschickungsmenge und, um eine Überlastung zu verhindern, die Beschickungsfrequenz der Reaktoren auf einmal pro Woche reduziert. Bei diesen Versuchen wurden daher zwei unterschiedliche Substratmengen benötigt, und zwar von 100 g (7,49 g ots) und ab der sechsten Woche von 131,2 g (9,83 g ots). Diese Substratmengen in Zusammenhang mit der Beschickungsfrequenz erfolgten in fünf unterschiedlichen zu untersuchenden Raumbelastungen (0,38, 0,77, 1,18, 1,59 und 0,54 g ots/l Woche). Während der Vergärungszeit schwankte der wöchentliche durchnittliche ots-gehalt des Gärmaterials zwischen 3,70 und 5,57 Mass.-%. Der durchnittliche TS-Gehalt lag zwischen 5,07 und 7,53 Mass.-%. Damit wurde der TS-Grenzwert von 10 Mass.-%

183 Ergebnisse und Diskussion 183 (24), (21) nicht überschritten. Die Unterschiede zwischen den wöchentlichen mittleren ots-gehalten sind auf die unterschiedlichen ots-abbaugrade zurückzuführen. In Abhängigkeit davon bewegte sich ausserdem das ots-bezogene Inokulum/Substrat-Verhältnis zwischen 2,54 und 4,02 und nahm bei steigendem ots-gehalt ab (bei sinkendem ots-abbau). Tab. 8.21: Beschickungsabhängige Parameter bei der anaeroben Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft Woche In Tab sind die Durchschnittswerte von den chemisch-physikalisch organischen und anorganischen Summenparametern, von CSB:N:P-Mindestverhältnis, sowie von den ph- und ORP-Werten und von ots-abbaugrad dargestellt. Wie bei den Versuchen mit Papayaabfällen, konnten aus Kapazitätsgründen nicht kontinuierlich alle Parameter analysiert werden. Das in einem kohlenhydrathaltigen Substrat gewünschte Nährstoffverhältnis von 300:5:1 (15) war am Ende jeder Versuchswoche gegeben. Daher kann angenommen werden, dass auch zu Beginn keiner der beobachteten Wochen ein Mangel an diesen Nährstoffen bei der anaeroben Vergärung bestand. Der niedrige Proteingehalt in Bananen wird durch einen ebenso geringen Gesamtstickstoffgehalt von ca. 1,9 g/kg in frischer Bananen (siehe Tab. 7.1) bedingt. Der pure Rumensaft wies ebenso einen niedrigen Gesamtstickstoffgehalt von ca. 1,2 g/kg auf (siehe Tab. 7.1), was mit einem geringen Proteinhalt von ca. 0,38 Mass.- % (siehe Tab. 7.3) im gesiebt verwendeten Rumensaft einherging. Dabei lag ein Teil des Gesamtstickstoffgehaltes als Ammoniak-Stickstoff vor. Der wöchentliche Ammoniak-Stickstoff bewegte sich zwischen ca. 403 und ca mg/l. Diese Ammoniak-Stickstoff Konzentrationen sind höher als die bei purem Rumensaft Beschickung Raumbelastung ots- Verhältnis Substrat Gehalt (g ots/woche) (I/S) (g/woche) (g ots/l Woche) (g ots/l d) (%) 1 100,00 7,49 0,38 0,05 5,44 3, ,00 14,98 0,77 0,11 4,75 3, ,00 22,47 1,17 0,17 4,32 4, ,00 22,47 1,18 0,17 4,34 3, ,00 22,47 1,20 0,17 5,57 2, ,60 29,48 1,59 0,23 3,70 3, ,20 9,83 0,54 0,08 5,23 2, Anorganische und organische Prozess- und Bewertungsparameter

184 Ergebnisse und Diskussion 184 gemessene Konzentration von 590 mg/l (siehe Tab. 7.1), weshalb angenommen werden kann, dass dieser Wert dem eines stabilen anaeroben Pansenmilieus entspricht. Die hohen Ammoniak-Stickstoff Konzentrationen können nach Van Velsen (1981) auf die thermophilen Temperaturen zurückgeführt werden. Konzentrationen über 700 mg/l führen nach Angelidaki und Ahring (1994) zu einer niedrigen Prozessleistung, was eine Anhäufung von nicht abgebauten Zwischenprodukten (u. a. flüchtige Fettsäuren) bedingt. Zugleich verursachen nach Wellinger et al. (1991) die hohen Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren, die bei einer Überlastung oder sonstigen Störung des Prozesses auftreten, einen fallenden ph-wert. Bei ph-werten < 6,5 wird der durch Methanogene durchgeführte Acetatabbau deutlich gehemmt (33). Tab. 8.22: Mittelwerte chemisch-physikalischer Parameter und des Nährstoffverhältnisses bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft Woche CSB N (mg/l) P Verhältnis CSB : N : NH 3 -N (mg/l) , ,00 134,90 781,67 17,36 1, ,34 6,02-116, , ,00 39, ,97 42,66 1,00 725,00 5,84-155,00 13, , ,00 402,78 6,58-155,00 11, , ,00 99,92 909,91 23,54 1, ,93 6,76-151,00 1, , ,00 609,92 6,47-143,33-26,16 6 6,95-111,67 35, ,90 P ph ORP ots Abbau (%) Bei den Gärungsversuchen von Bananenabfällen traten in den ersten zwei Wochen ph-werte < 6,5 auf (siehe Tab. 8.22). Die bereits genannte Instabilität in der täglichen Biogasproduktion der ersten zwei Gärungswochen kann auf die hohe Konzentration von Ammoniak-Stickstoff sowie auf eine Anhäufung von Zwischenprodukten (vor allem von Essigsäure und Iso-Buttersäure) zurückgeführt werden (siehe Abb. 8.14). Theoretisch führte dies entsprechend zu einem niedrigen Methangehalt, da nicht nur der Acetatabbau durch die ph-werte < 6.5 gehemmt wurde, sondern die niedrigen ph-werte < 6,2 (222) sich negativ auf die Methanbakterien ausgewirkt hatten. Wie Abb zeigt, führte das in den nächsten Wochen zu einer weiteren Anhäufung von Zwischenprodukten, besonders von Essigsäure. Abgesehen von Essigsäure und Iso-Buttersäure lagen die Konzentrationen an organischen Säuren während der Versuchszeit bei allen verwendeten

185 mg/l Ergebnisse und Diskussion 185 Raumbelastungen im o. g. günstigen Bereich. Bis auf Propionsäure hatten alle Konzentrationen in den letzten zwei Wochen einen abnehmenden Trend. Die Essigsäurekonzentration lag über dem nach Aschmann et al. (2007) günstigen Bereich von mg/l. Sie schwankte von der zweiten bis zur vierten Woche im Bereich von mg/l. Der Gehalt an Iso-Buttersäure lag bis zur dritten Woche höher als der von Schlowin et al. (2009) berichteten Schwellenwert der Hemmung von 50 mg/l. Allerdings zeigte die Iso-Buttersäure eine abnehmende Konzentration mit zunehmender Belastung, so dass sie ab der vierten Woche nicht mehr detektiert wurde. Die Konzentration von Buttersäure war nur in der zweiten Woche vorhanden, während die der Iso-Valeriansäure ab der sechsten Woche nicht mehr detektiert wurde Zeit (Wochen) Beschickung: 1. Woche = 1 Mal (0,38 g ots/l Woche) 2. Woche = 2 Mal (0,77 g ots/l Woche) Woche = 3 Mal (1,18 g ots/l Woche) 6. Woche = 3 Mal (1,59 g ots/l Woche) 7. Woche = 1 Mal (0,54 gots/l Woche) Essigsäure Propionsäure Iso-Buttersäure Buttersäure Iso-Valeriansäure Valeriansäure M-Valeriansäure Hexansäure Önanthsäure Abb. 8.14: Konzentrationen an organischen Fettsäuren bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft Die Anhäufung der Säuren (vor allem Essigsäure) war nicht nur mit ph-werten < 6,6 verbunden sondern ließ sich sogar in der fünften und der siebten Woche durch eine negative ots-abbaurate erkennen (siehe Tab. 8.18). Die Auswirkung einer potentiellen Instabilität kann man noch durch ORP-Werte im Bereich von -112 bis -155 erkennen. Die Anhäufung der organischen Zwischenprodukte kann durch sinkende ots-abbauraten bestätigt werden. Zeichen einer Adaptation der anaeroben Bakterien an höheren Gesamtammoniakkonzentrationen (54) bzw. einer Reversibilität der Toxizität, wie Koster und Lettinga (1988) oder Dauber (1993) berichteten, ließ sich in der sechsten

186 Ergebnisse und Diskussion 186 Woche durch einen ph-wert von ca. 7 und höhere ots-abbaurate sowie durch ein relatives Gleichgewicht von Säureangebot und -abbau erkennen. Aus diesen Punkten ist ersichtlich, dass bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft bei thermophilen Temperaturen das Risiko einer Ammoniakhemmung auch bei niedrigen Raumbelastungen vorhanden ist. Bei einer entsprechend langen Gärdauer konnten sich die anaeroben Bakterien jedoch an die höheren Ammoniakkonzentrationen adaptieren. Die Differenz zwischen Gesamtstickstoff und Ammoniakstickstoff schwankte zwischen ca. 1 und 1,5 g N/l. Wäre die gesamte Stickstoffdifferenz rein theoretisch in Ammoniumstickstoff umgewandelt worden, würde sich der ergebende Ammoniumstickstoff in gleichem Bereich bewegen. In der Literatur (siehe Kap ) wird die Hemmschwelle der Ammoniumstickstoffkonzentration abhängig von ph-wert und Temperatur mit 4 g/l (39) bzw. 2,7 bis 10 g/l (223) angegeben. Diese Grenzwerte sowie die entsprechenden Versuchsergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab bestätigen, dass bei den vorherrschenden Milieubedingungen bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft keine Gefahr der Ammoniumhemmung vorliegt. Ebenso kann hier aufgrund der niedrigen Proteingehalte der Bananen und des Rumensaftes bestätigt werden, dass bei der Vergärung beider Rohstoffe eine Schwefelhemmung ausgeschlossen werden kann. Bezogen auf Spurenelemente und Schwermetalle haben sich Bananenabfälle und Rumensaft in der Vergärungsmischung gegenseitig ergänzt bzw. verdünnt. Bananen weisen verschiedene Mineralien (Fe, Zn, Cu, Mn, Se und F) auf, die für den anaeroben Prozess als notwendige Spurenelemente betrachtet werden (siehe Tab. 7.2). Einige davon (Fe und Mn) liegen in Bananen im Bereich der jeweiligen günstigen Konzentrationen (224), (32) vor. An anderen mangelt es (Se), während für weitere (Zn, Cu und F) keine Konzentrationsangaben in der Literatur vorliegen. Weitere für den anaeroben Prozess wichtige Spurenelemente (I, As, W, Mo, Co, Ni, Cr und Pb) sowie schädliche Schwermetalle (Cd und Hg) sind in Bananen nach USDA (2011) nicht enthalten. Wie in erwähnt, sind in den Abfällen des Rinderpansens (Rindergülle, -mist und -panseninhalt) ebenso relevante Spurenelemente bzw. Schwermetalle (Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb und Zn) in günstigen Konzentrationen vorhanden.

187 Ergebnisse und Diskussion 187 Bei den Gärungsversuchen von Bananenabfällen mit Rumensaft wurden dem anaeroben Prozess durch die Beschickung mit Bananenabfällen kontinuierliche Mengen an Spurenelementen zugegeben. Obwohl einige Spurenelemente bzw. Schwermetalle sowohl in den Pansenabfällen als auch in Bananen vorhanden sind (siehe Tab. 2.9 und Tab. 7.2), können die aus ihrer Mischung resultierenden Schwermetallkonzentrationen aufgrund ihrer ursprünglich gemäßigten Konzentrationen die nach Tab schädlichen Konzentrationen nicht überschreiten. Pansenabfälle können hohe Konzentrationen an Kupfer und Zink enthalten (siehe Tab. 2.9). Allerdings wurden bei dem gesiebt verwendeten Rumensaft durch die Siebung ca. 28 Mass.-% der TS reduziert. Daher ist, wie bei dem Vergärungsversuch von Papayaabfällen, die Überschreitung der schädlichen Konzentrationen bei Kupfer und Zink (vergl. Tab. 2.9 und Tab. 2.10) kaum möglich. Entsprechend können dadurch die Versuchsergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab bestätigt werden, nämlich dass bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft keine schädliche Wirkung der enthaltenen Schwermetalle zu befürchten ist Biogasmengen und ausbeuten Abb zeigt die mittleren täglichen Biogasmengen dieser Versuchsreihe. Obwohl die Raumbelastung durch die Beschickungsfrequenz in den ersten fünf Wochen zugenommen hat, zeigte die durchschnittliche Biogasproduktion besonders in der ersten Woche ein instabiles Verhalten. Die tägliche Biogasproduktion (siehe Abb. 8.15) und die damit berechnete spezifische Biogasproduktion nahmen dabei von ca. 8 l/d bzw. 0,4 l/(l Reaktor) (Raumbelastung von ca. 0,4 g ots/(l Woche)) auf 2,2 l/d bzw. 0,12 l/(l Reaktor) (Raumbelastung von ca. 1,2 g ots/(l Woche)) ab. Dieses Verhalten kann auf die bereits genannte Anhäufung von Zwischenprodukten zurückgeführt werden. Die weiteren Biogasmessungen zeigten (Abb. 8.15), dass ab der fünften Woche eine stabilere Biogasproduktion von ca. 2 l/d bzw. 0,11 l/(l Reaktor) stattfand.

188 Biogas (ml/d) Ergebnisse und Diskussion Zeit (Wochen) Beschickung: 1. Woche = 1 Mal (0,38 g ots/l Woche) 2. Woche = 2 Mal (0,77 g ots/l Woche) Woche = 3 Mal (1,18 g ots/l Woche) 6. Woche = 3 Mal (1,59 g ots/l Woche) Woche = 1 Mal (0,54 gots/l Woche) Abb. 8.15: Tägliche Biogasproduktion bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft Wie bei den Versuchen von Papayaabfällen, wurden unterschiedliche, auf andere Prozessparameter (ots-abbaumenge, zugegebener ots-gehalt des Rumensaftes und gesamter ots-gehalt im Reaktor) bezogene Biogasausbeuten ermittelt. Abb zeigt sowohl die mittlere wöchentliche Biogasmenge als auch die Biogasausbeuten, bezogen auf den ots-gehalt des zugeführten Substrats, auf den ots-gehalt des Rumensaftes und auf den gesamten ots-gehalt im Reaktor. In Tab des Anhangs C sind in relativen Werten sowohl die Biogasmengen als auch die o. g. Biogasausbeuten dargestellt. Die gebildete wöchentliche Biogasmenge bzw. die auf den zugeführte ots-gehalt bezogene Biogasausbeute verringerte sich mit zunehmender Raumbelastung der Reaktoren in den ersten sechs Wochen von ca. 37 l bzw. ca.160 ml/g ots auf ca. 12 l bzw. ca. 54 ml/g ots. Die höchste Biogasmenge und die höchste Biogasausbeute entstanden während einer instabilen Vergärungsphase. Wie oben beschrieben, wird die Methanbildung dadurch gestört und damit der Methangehalt des Biogases gering. Deshalb werden diese Biogasmenge und ausbeute nicht als die optimalen Werte angesehen. Obwohl ab der siebten Woche die Raumbelastung reduziert wurde, blieben die Biogasmengen und -ausbeuten auf ihrem Niveau. Daraus kann gefolgert werden, dass unter diesen Gärungsbedingungen (Temperatur und Inokulum/Substrat-Verhältnis ) die Biogasproduktion der Bananenabfälle nicht höher als 54 ml/g ots liegen kann. Dabei ergab sich ein maximaler ots-abbau von ca. 36 Mass.-% (siehe Tab. 8.22).

189 Biogasmenge (ml/woche) Biogasausbeuten (ml/g ots) Ergebnisse und Diskussion mittlere Biogasmenge Biogasausbeute bez. auf den ots-gehalt des zugeführten Substrats Biogasausbeute bez. auf den ots-gehalt des Rumensafts Biogasausbeute bez. auf den gesamten ots- Gehalt im Reaktor Zeit (Wochen) Beschickung: 1. Woche = 1 Mal (0,38 g ots/l Woche) 2. Woche = 2 Mal (0,77 g ots/l Woche) Woche = 3 Mal (1,18 g ots/l Woche) 6. Woche = 3 Mal (1,59 g ots/l Woche) 7. Woche = 1 Mal (0,54 g ots/l Woche) 0 Abb. 8.16: Biogasmenge und -ausbeuten bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft Die auf den zugeführten ots-gehalt bezogene Biogasausbeute von ca. 54 ml/g ots liegt im Bereich von 28 und 56 ml/g ots, in welchem auch die Biogasausbeuten der Gärungsversuche von Bananenabfällen mit Rumensaft im Kleinmaßstab lagen (siehe Tab. 8.10). Die hier erreichte maximale ots-abbaurate von ca. 36 Mass.-% entspricht in etwa der des o. g. Gärungsversuches im Kleinmaßstab (ca. 38 Mass.- %) (siehe Tab. 8.9). Wie Tab zeigt, lagen die Inokulum/Substrat-Verhältnisse im Bereich von 2,50 bis 4,02. In der stabileren Phase der letzten Wochen lag es bei ca. 3,0. Die Erhöhung des Verhältnisses ist nach Chymoweeth et al. (1993) für einige Arten von Substraten nötig. Wäre in dieser Phase ein höheres Inokulum/Substrat- Verhältnis eingesetzt worden, wären dementsprechend die Biogasmengen und ausbeuten (evtl. auch der Methangehalt) höher ausgefallen. Die auf den zugeführten ots-gehalt bezogene Biogasausbeute von ca. 54 ml/g ots ist höher als die 9,22 ml/g TS von Deivanai et al. (1995) (der ots-gehalt bei Obstund Gemüseabfällen liegt bei Mass.-% der TS (163)) bei mesophilen anaeroben Gärungsversuchen von Bananenabfällen mit anaerobem Faulschlamm als Inokulum. Der maximale ots-abbau von ca. 36 Mass.-% hingegen entspricht dem von 39,6 Mass.-%. der o. g. Autoren. Die auf den zugeführten ots-gehalt bezogene maximale Biogasausbeute ist niedriger als die 778 ml/g ots von Guangqing et al. (2009) bei thermophilen anaeroben Gärungsversuchen von Speiseabfällen mit Faulschlamm als Inokulum. Auch liegt sie niedriger als die Biogasausbeute bei den Versuchen der o. g. Autoren

190 Ergebnisse und Diskussion 190 bei gleichen Temperaturen mit einer 1:1-Mischung von Speise- und Grünabfällen als Substrat, welche bei 631 bzw. 716 ml/g ots lagen. Sie liegt ebenso unter der von ca. 90 ml/g ots von Raposo et al. (2006) bei Gärungsversuchen mit Mais und Faulschlamm als Inokulum bei mesophilen Temperaturen und einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von 3. Abgesehen von den Zeiträumen ohne deutlicher ots-abbau mit Anhäufungen von Zwichenprodukten, schwankte der ots-abbau zwischen 1,7 und 36 Mass.-%, wie Tab darstellt. Der maximale ots-abbau von ca. 36 Mass.-% erfolgte bei einer Biogasausbeute von 53,67 ml/g ots. Guangqing et al. (2009) beobachteten ebenfalls, dass bei thermophilen Temperaturen mit Faulschlamm als Inokulum bei einem steigenden Inokulum/Substrat-Verhältnis auch der ots-abbau ansteigt. Wie Abb ebenso darstellt, sinken die anderen Biogasausbeuten (die auf den ots-gehalt des zugeführten Rumensaftes bzw. die auf den gesamten ots-gehalt im Reaktor bezogene Biogasausbeuten) ebenso wie die bereits beschriebene Biogasmenge und -ausbeute, bei steigender Raumbelastung der Reaktoren. Sie schwankten zwischen ml g/ots und sind niedriger als die auf den ots-gehalt des Rumensaftes bezogenen Biogasausbeuten der Gärungsversuche von Bananenabfällen mit Rumensaft im Kleinmaßstab bei allen verwendeten Raumbelastungen Ergebnisse der statistischen Analysen der Biogasproduktion der Vergärungsversuche von Bananenabfällen mit Rumensaft Bei den Versuchen mit Bananenabfällen wurden ebenfalls nichtparametrische Methoden eingesetzt, wie sie in Kap beschrieben wurde. Die Bestimmung der evtl. signifikanten Differenzen zwischen den Gruppen der produzierten Biogasmengen aufgrund der fünf unterschiedlichen verwendeten Raumbelastungen (0,38, 0,77, 1,18, 1,59 und 0,54 g ots/(l Woche)) sowie die Überprüfung der jeweiligen Hypothesen (siehe Kap. 5.2) wurde durch den Vorzeichentest und den Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test durchgeführt. Es wurde bei der Nullhypothese angenommen, dass die Biogasmengengruppe aller verwendeten Raumbelastungen fünf identischen abhängigen Verteilungen entstammen. Die mit dem Vorzeichentest ermittelten statistischen Ergebnisse des

191 Ergebnisse und Diskussion 191 paarweisen Vergleiches dieser Verteilungen sind in Tab dargestellt. Die Wahrscheinlichkeit (exakte Signifikanz 2-Seitig) ist bei allen Vergleichen größer als 0,05. Daher haben die fünf Raumbelastungen keinen signifikanten Unterschied auf die abhängige Variable (Biogasmenge) auf dem 95 %-Konfidenzniveau verursacht. Mit anderen Worten ist die Wahrscheinlichkeit gleicher Mittelwerte der produzierten Biogasmengen aus der Vergärung der Bananenabfällen mit Rumensaft bei beiden Raumbelastungen so groß, dass bei diesem Substrat die Nullhypothese (H0-e), der zufolge kein Unterschied zwischen den Mittelwerten besteht (siehe Kapitel 5.2), nicht zurückgewiesen werden kann. Tab. 8.23: Vorzeichentest bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft: Teststatistiken Paarweise Vergleiche RB 1 - RB 2 RB 1 - RB 3 RB 1 - RB 4 RB 1 - RB 5 RB 2 - RB 3 RB 2 - RB 4 RB 2 - RB 5 RB 3 - RB 4 RB 3 - RB 5 RB 4 - RB 5 Exakte Signifikanz (2-Seitig) 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a 1,000 a Exakte Signifikanz (1-Seitig) 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 Punkt-Wahrscheinlichkeit 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,500 0,375 0,500 Die Teststatistiken des Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Tests sind in Tab dargestellt. Da diese Methode empfindlicher gegenüber der Größe der Stichprobe (Anzahl der Messwochen je Raumbelastung) als der Vorzeichentest ist, konnten dabei nur die Raumbelastungen drei und fünf (1,18 bzw. 0,54 g ots/(l Woche)) bestätigt werden. Die asymptotische Signifikanz zweiseitiger Verteilung (P = 1,000 > 0,05) bestätigt, dass zwischen den Biogasmengengruppen dieser zwei Raumbelastungen kein signifikanter Unterschied besteht. Tab. 8.24: Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft Bananen: Teststatistiken Z Asymptotische Signifikanz (2-Seitig) Exakte Signifikanz (2-Seitig) Exakte Signifikanz (1-Seitig) Punkt-Wahrscheinlichkeit a. Basierend auf positiven Rängen RB: Raumbelastung Paarweise Vergleiche RB 3 - RB 5-0,000 a 1,000 1,000 0,625 0,250 Im Anhang C sind zusätzlich die Frequenzen (Tab ) bzw. die Ränge (Tab ) dieser zwei Methoden dargestellt.

192 Schlussfolgerungen und Empfehlungen Schlussfolgerungen und Empfehlungen 9.1 Schlussfolgerungen und Empfehlungen in Bezug auf die Prozess-, Bewertungs- und Hygieneparameter Im Folgenden werden Schlussfolgerungen zu den anaeroben Gärversuchen von Papaya- bzw. Bananenabfällen bei thermophilen Temperaturen im Klein- Großmaßstab gezogen: und Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Versuchen im Kleinmaßstab Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Prozess- und Bewertungsparameter 1. Die Mindestverhältnisse der wesentlichen organischen (Kohlenhydrate, Fette und Proteine) und anorganischen (Stickstoff und Phosphor) Nährstoffe, die die anaerob belebte Biomasse braucht, die auch und als Ausgangsstoffe für die Biogasproduktion anzusehen sind, waren in den Papaya- bzw. Bananenabfällen gegeben. Weitere nach Dauber (1993) für die Mikroorganismen erforderlichen anorganischen Substanzen wie Ca, Na und K sind ebenso in beiden Früchten in ausreichenden Konzentrationen vorhanden. Hingegen sind nicht alle für den anaeroben Prozess günstigen Spurenelemente in Papayas und Bananen ausreichend vorhanden. Fe, Zn, Cu, Mn und Se liegen in beiden Früchten vor. Banane enthält zusätzlich noch F, während andere Spurenelemente (I, As, W, Mo, Co, Ni, Cr, Pb) nach USDA (2011) weder in Papaya noch in Banane vorhanden sind. Bei den verwendeten Fruchtmengen unterschritten theoretisch nur Se und Fe in beiden Fruchtsubstraten die günstigen Konzentrationen. Dennoch wurde ein relativ stabiler anaerober Prozess erreicht. Optimierungsmaßnahmen können denoch z. B. durch Zugabe von ergänzenden Nährstofflösungen zur Verbesserung des Wachstums sowie der Aktivität der Biomasse ergriffen werden. 2. Bei den anaeroben Vergärungen von Papaya- bzw. Bananenabfällen bestand keine Gefahr der Ammoniumhemmung. Ebenso kann eine Schwefelhemmung aufgrund des niedrigen Proteingehalts beider Obstsorten ausgeschlossen werden. Basierend auf den theoretischen Schwermetallkonzentrationen in Papaya und Banane ist zudem eine schädliche Wirkung bei den anaeroben

193 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 193 Vergärungen auszuschließen. Daher können diese Abfallsubstrate zur Verdünnung von mit Ammonium hochbelasteten, proteinreichen sowie zum Teil mit Schwermetallen belasteten Inokula bei der Vergärung dienen Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Hygieneparameter 1. Da die Hauptindikatororganismen bzw. Krankheitserreger (E. Coli, Salmonelle, Shigelle und Helmitheneir) in den Rohsubstraten nicht gefunden bzw. im Prozess abgetötet wurden und das Gärgut dadurch die höchste Kategorisierung der Normen und Richtlinien der EU, Mexiko und USA erfüllte, kann gefolgert werden, dass die thermophile anaerobe Vergärung von Papaya- bzw. Bananenabfällen seuchenhygienisch vielversprechend ist und das Gärgut anschließend unbedenklich als Kompost oder zur Bodenverbesserung verwertet werden kann Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Hypothesen 1. Bei der Vergärung von Papaya- bzw. Bananenabfällen ohne und mit den verwendeten Bioadditiven haben das Bioadditiv, die Raumbelastung oder ihre Interaktion einen signifikanten Einfluss auf die erzeugten Biogasmenge, so dass der Unterschied zwischen den erzeugten Biogasmengen bei mindestens einem Bioadditiv, einer Raumbelastung oder einer Interaktion signifikant ist. 2. Die zunehmende Biogasproduktion und ihre Dauer sind klare Zeichen einer steigenden Toleranz und Anpassung der Rumenmikroorganismen an die thermophilen Temperaturen. Dennoch ist ein Test zur Bestimmung der methanogenen Aktivität des Inkolums beim geplanten Temperaturbereich vor seiner Verwendung im anaeroben Abbauprozess empfehlenswert. Bei thermophilen Temperaturen kann zur Optimierung ebenso die spezifische mikrobiologische Identifizierung der thermophilen Methanogenen und ggf. die Untersuchung ihrer substratbezogenen Leistung hilfreich sein Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Papayaabfällen 1. Solange Papain und Bacillus sp. oder beides bei der Vergärung von Papayaabfällen nicht mit Rumensaft kombiniert wurden, wurde kein signifikanter Einfluss auf die Biogasmenge beobachtet. Allerdings wiesen Papain und Bacillus

194 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 194 sp. nur bei einer ots-konzentration von 6 g ots/l einen positiven signifikanten Einfluss auf die Leistung der Rumenmikroorganismen auf. Bei niedrigeren bzw. höheren ots-konzentrationen sollen daher andere Konzentrationen von Papain bzw. Basillus sp. untersucht werden. 2. Bei der anaeroben Vergärung von Papayaabfällen erzeugten die Mischproben mit Rumensaft (R, PR, BR und PBR) die höchsten Biogasmengen. Dabei wurde bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,20 (Raumbelastung von 6 g ots/l) und der Mischprobe BR die maximale akkumulierte Biogasmenge bei dem maximalen ots-abbau erreicht. Die maximale Biogasausbeute von 23,1 ml/g ots wurde aber bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,40 (Raumbelastung von 3 g ots/l) bei der Mischprobe PR erzielt. Papain erwies damit sich effektiver als Bacillus sp. hinsichtlich der Leistungssteigerung der Rumenmikroorganismen bzw. des Substrats. Da die Biogasausbeute ein entscheidenderer Faktor ist als die produzierte Biogasmenge, kann die Mischprobe PR mit der Raumbelastung von 3 g ots/l als die vielversprechendste Alternative für eine großtechnische Umsetzung betrachtet werden. Da zudem die Biogasproduktion eine steigende Tendenz mit zunehmendem Inokulum/Substrat- Verhältnis aufwies, könnten Verhältnisse über 0,40 zwecks einer höheren Biogasausbeute effektiver sein. Wie oben beschrieben, soll jedoch dabei die Konzentration von Papain bei Raumbelastungen < 6 g ots/l optimiert werden Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Bananenabfällen 1. Papain und Bacillus sp. verringerten im Vergleich zu der Kontrolprobe (KTL) die Biogasmengen und ausbeuten bei den Mischproben sowohl bei einer Einzelverwendung (P, B) als auch bei einer kombinierten Verwendung (PB). Obwohl Rumensaft die Ergebnisse bei der Verwendung von Papain und Bacillus sp. verbesserte, kann dennoch aus den sinkenden Biogasmengen und - ausbeuten zwischen R und PR, BR bzw. PBR gefolgert werden, dass die Verwendung dieser Bioadditive bei der Vergärung von Bananenabfällen, im Gegensatz zu Papayaabfällen, einen negativen Einfluss auf die Leistung der Rumenmikroorganismen hat. Dieser Effekt beider Bioaddtive war umso stärker, je niedriger die ots-konzentration des Bananensubstrats war. Bei höheren ots- Konzentrationen wurde der negative Effekt verdünnt. Auffällig ist dieser

195 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 195 negative Trend besonders bei der Protease Papain trotz des höheren Proteingehalts von Bananen als von Papaya. Daher kann ableitet werden, dass Papain und Bacillus sp. einen hemmenden Einfluss auf die Vergärung von Bananenabfällen haben. 2. Bei der anaeroben Vergärung von Bananenabfällen wiesen die Mischproben mit Rumensaft die höchsten produzierten Biogasmengen auf. Dabei wurde bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,20 (bei einer Raumbelastung von 6 g ots/l) die maximale akkumulierte Biogasmenge bei dem maximalen ots- Abbaugrad erreicht. Die maximale Biogasausbeute von 56,29 ml/g ots wurde aber bei einem Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,40 (bei einer Raumbelastung von 3 g ots/l) erzielt. Obwohl die höchsten Biogasmengen bei den Raumbelastungen von 6 bzw. 9 g ots/l entstanden, ist die Biogasausbeute der entscheidende Faktor für eine großtechnische Umsetzung. Daher ist eine Mischung mit Rumensaft bei einer Raumbelastung von 3 g ots/l als sehr geeignet für eine großtechnische Umsetzung anzusehen Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Versuchen im Großmaßstab Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die Prozess- und Bewertungsparameter 1. Im Bezug auf das Mindestverhältnis von CSB:N:P konnten bei der Vergärung von Papaya- bzw. Bananenabfällen mit Rumensaft die jeweiligen Ergebnisse im Kleinmaßstab bestätigt werden, nämlich dass das notwendige Verhältnis bei allen verwendeten Raumbelastungen gegeben war. Wie bereits erwähnt, können aufgrund des teilweisen Mangels an Spurenelementen ergänzende Nährstofflösungen zur Optimierung des Wachstums und der Aktivität der Biomasse dem Prozess zugegeben werden. 2. Die hohen Ammoniakkonzentrationen, die sich bei der Vergärung der Abfallsubstrate mit Rumensaft ergaben, können nach Van Velsen (1981) auf die thermophilen Temperaturen zurückgeführt werden. 3. Das Risiko einer Ammoniakhemmung war auch bei niedrigen Raumbelastungen bei der Vergärung der Abfallsubstrate mit Rumensaft gegeben. Allerdings wurde beobachtet, dass sich die anaeroben Bakterien an die hohen Ammoniakkonzentrationen während der Zeit anpassten somit kein Risiko einer

196 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 196 Hemmung mehr bestand und die Belastung sogar erhöht werden konnte. Die Anpassung war bei Papayaabfällen einfacher als bei Bananenabfällen. 4. Bei der Vergärung von Papaya- bzw. Bananenabfällen mit Rumensaft konnten die entsprechenden Versuchsergebnisse des Kleinmaßstabes bestätigt werden, dass keine Gefahr einer Ammonium-, Schwefel- und Schwermetallhemmung vorliegt. Ebenso wurde so bestätigt, dass die Abfallsubstrate zur Verdünnung von mit Ammonium hochbelasteten, proteinreichen sowie zum Teil mit Schwermetallen belasteten Inokula bei der Vergärung verwendet werden können. 5. Im Allgemeinen zeigten die Versuche im Großmaßstab, dass bei thermophilen Temperatuen ein stabiler Gärprozess mit Rumensaft als Inokulum trotz einiger Temperaturschwankungen erreicht werden kann. Bei Bananenabfällen bzw. fetthaltigem Abfallsubtrat aus der Geflügelproduktion (Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage) dauert es jedoch etwas länger, bis sich der Prozess stabilisiert. Bei Bananenabfällen können besonders niedrige Raumbelastungen dabei helfen. Die niedrige Biogasmengen und ausbeuten bei fetthaltigem Substrat lassen sich darauf zurückführen, dass Fett biologisch schwerer abbaubar ist und außerdem die verwendeten Rumenmikroorganismen aus einem Millieu mit mesophilen Temperaturen stammten. Die Anwendung von Papain kann jedoch auch unter diesen Bedingungen die Biogasmenge und ausbeute wesentlich erhöhen (siehe Abb a und Abb des Anhangs C) Allgemeine Schlussfolgerungen und Empfehlungen bezogen auf die statistischen Hypothesen 1. Bei der Vergärung von Papaya- und Bananenabfällen mit Rumensaft haben die jeweils untersuchten Raumbelastungen keinen signifikanten Einfluss auf die produzierte Biogasmenge. Daher kann abgeleitet werden, dass evtl. Schwankungen der Beschickung mit Substrat im Bereich der untersuchten Raumbelastungen keine signifikante Änderung des Ertrages nach sich ziehen Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Papayaabfällen und Rumensaft 1. Die maximale Biogasausbeute von ca. 760 ml/g ots und die maximale ots- Abbaurate von ca. 66 Mass.-% bei der Vergärung von Papayaabfällen mit

197 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 197 Rumensaft waren wesentlich höher als die der jeweiligen Werte bei der Vergärung im Kleinmaßstab (ca. 9 ml/g ots bzw. ca. 14 Mass.-%). Der Unterschied kann auf die sich im Großmaßstab ergebenden höheren Inokulum/Substrat-Verhältnisse zurückgeführt werden. Die Versuche im Kleinmaßstab haben gezeigt, dass ein positiv quasi-linearer Zusammenhang zwischen den Inokulum/Substrat-Verhältnissen und den Biogasausbeuten besteht. Bei den Versuchen im Großmaßstab zeigte sich der zunehmende bzw. abnehmende Trend der Biogasausbeute als im Einklang mit der Zu- bzw. Abnahme des Inokulum/Substrat-Verhältnisses und bestätigt damit die Ergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab. Bei noch höheren Inokulum/Substrat Verhältnissen könnten durchaus höhere Biogasausbeuten und ots-abbauraten erzielt werden. 2. Bezogen auf die produzierte Biogasmenge konnte bestätigt werden, dass die anaerobe thermophile Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft bei halbkontinuierlicher Beschickung eine vielversprechende Alternative ist und für eine großtechnische Umsetzung in Betracht gezogen werden kann Spezifische Schlussfolgerungen und Empfehlungen aus den Gärungsversuchen mit Bananenabfällen und Rumensaft 1. Geringe Anfangsbelastungen in einem instabilen Zustand aufgrund hoher Konzentrationen von Zwischenprodukten, vor allem von Essigsäure und Iso- Buttersäure, erzeugten schwankende Biogasmengen und -ausbeuten. Ein stabiler Prozess wurde bei einer Raumbelastung von 1,18 g ots/(l Woche) erreicht, wobei die maximale wöchentliche Biogasausbeute von ca. 54 ml/g ots bei einem maximalen ots-abbau von ca. 36 Mass.-% (Inokulum/Substrat- Verhältnis 3,7) erreicht wurde. Die Werte für die maximale Biogasausbeute und den maximalen ots-abbau entsprachen denen der jeweiligen Versuche nur mit Rumensaft im Kleinmaßstab (49 ml/g ots bzw. 38 Mass.-%), wobei mit zunehmender Raumbelastung die Biogasausbeute eine parabolisch abnehmende Tendenz aufwies (siehe Abb. 8.7 a). Die Anhäufung von Zwischenprodukten bei den Versuchen im Großmaßstab kann ebenso darauf zurückgeführt werden, dass bei thermophilen Temperaturen die Bananenabfälle schneller zersetzt werden, als die Umwandlung der Zwischenprodukte in Biogas geschieht, und somit sich die o. g. Tendenz der Biogasausbeute ergibt. Höhere

198 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 198 Inokulum/Substrat-Verhältnisse mit kleineren Raumbelastungen hingegen können die Biogasausbeute verbessern. 2. Obwohl die anaerobe thermophile Vergärung mit Bananenabfällen und Rumensaft biogasbezogen als eine der vielversprechenden Alternativen und als Basis für eine großtechnische Umsetzung anzusehen ist, soll zwecks höherer Biogasmengen und -ausbeuten noch weiter optimiert werden, ehe die großtechnische Umsetzung in Frage kommt. 9.2 Wirtschaftliche Aspekte in Bezug auf eine großtechnische Umsetzung der Ergebnisse Obwohl in der vorliegenden Arbeit hauptsächlich die Ergebnisse der Vergärung von Papaya- bzw. von Bananenabfällen diskutiert werden, kann im Allgemeinen folgendes abgeleitet werden: 1. Die Versuche im Klein- und Großmaßstab zeigten, dass alle verwendeten Substrate bei thermophilen Temperaturen anaerob abbaubar sind (siehe Anhang C und D). 2. Die dabei erzeugten Gasausbeuten lassen insbesondere bei Papaya- und Zitrusmischabfällen (siehe Tab bzw. Tab des Anhangs D) einen wesentlichen Beitrag zur Energiegewinnung im Bereich der Landwirtschaft erwarten. 3. Unter Einbeziehung aller nach SAGARPA, 2012 und INIFAP, 2014 jährlich in Mexiko anfallenden Papaya-, Banane- und Zitrusmischungsabfällen von jeweils ca. 0,3, 0,7 und 2,2 Mio. Tonnen und im Bundesland Yucatán von ca. jeweils 10500, 300 und Tonnen wäre nach den durchgeführten Untersuchungen eine Biogasproduktion in Mexiko von bis zu ca. jeweils 11,9, 2,9 und 115,6 Mio. m 3 /Jahr und im Bundesland Yucatán von bis zu ca. jeweils 454, 1,3 und 5300 Tausend m 3 /Jahr zu erzielen. Beim Abwasser der kleinen Verpackungsanlage der Geflügelverarbeitungsfirma könnte bei einer fetthaltigen Abwassermenge von ca. 500 m 3 /Jahr eine Biogasproduktion von bis zu ca. 18 Tausend m 3 /Jahr erzielt werden. Diese Produktion kann dennoch mit den o. g. Optimierungsmaßnahmen erhöht werden (siehe Kap , 5). 4. Unter Einbeziehung der erzeugten Biogasmengen und ausbeuten aus den o. g. jährlich anfallenden Abfallmengen und ihrer wirtschaftlichen Bedeutung (siehe Tab des Anhangs A) kann gefolgert werden, dass eine großtechnische

199 Schlussfolgerungen und Empfehlungen 199 Umsetzung wirtschaftlich sinnvoll wäre. So ließe sich z. B. mit den gesamten anfallenden Papayaabfällen im Bundesland Yucatán (10500 Tonnen/Jahr mit einem umgerechnetem Verlustwert in Euro von ca. 2 Mio. der Inlandspreis in Mexiko von frischen Papayas beträgt ca. 200 /Tonne -) eine Biogasanlage mit BHKW und einer elektrischen Leistung 500 kw ertragsfähig betreiben. Eine solche Anlage hat nach der Bioenergie Service Agentur (2014) eine Substratkapazität von ca Tonnen/Jahr und Investitionskosten von ca. 1,58 Mio. Euro. 5. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ein kombiniertes Verfahren, das sowohl den Umweltschutz berücksichtigt als auch einen wirtschaftlichen wie energetischen Nutzen bietet, zu längerfristigem Umdenken führen kann.

200 Zusammenfassung Zusammenfassung Tropische Früchte wie Papayas, Bananen oder Zitrusfrüchte werden in Mexiko oft vor der Ernte während der unterschiedlichen Wachstumsphasen durch Plagen (wie z. B. Heuschreckenplage) bzw. Schädlingen, Kontamination von Schädlingsbekämpfungsmitteln, extreme Hochtemperaturen und Trockenperioden, Pflanzenkrankheiten (wie Antracnosis) oder nach der Ernte durch mangelhafte Produktbehandlung bei den Vermaktungsstufen oder auch durch patogene Mikroorganismen wie Salmonella beschädigt. Demzufolge gehen jährlich große Produktmengen verloren, die derzeit hauptsächlich ohne weitere Nutzung beseitigt werden. Andererseits ist die Menge an Abfall aus den verschiedenen Phasen der Geflügelproduktion über das Jahr hinweg relativ konstant und nimmt durch den steigenden Geflügelkonsum zu. Große Teile davon, die nicht wiederverwertet werden können, werden ohne Behandlung zu Abfallplätzen oder Mülldeponieen gebracht. Alle diese organischen Abfälle verursachen bei großen Mengen unterschiedliche Kontaminationsprobleme und stellen ein Gesundheitsrisiko sowohl für den Menschen als auch für die Umwelt dar. Darüber hinaus bedeutet ihre Nichtverwertung ebenso einen Verlust von wertvollen organischen Materialien, die als erneuerbare Energiequelle verwendet werden können. Damit könnten ihre Kontaminationsprobleme vermieden werden. Außerdem ist die Verfügbarkeit von Faulschlamm als Inokulum an vielen Orten limitiert. Anstelle dessen könnten alternative Inokulumsquellen wie frischer Rumensaft oder Panseninhalt verwendet werden. Ähnliche Probleme treten auch in anderen tropischen Produktionsländern auf. Eine mögliche Lösung wäre entsprechend die anaerobe Vergärung der Abfälle mit einem alternativen Inokulum. Allerdings sind die anaerobe Vergärung von Fruchtabfällen und die Vorteile thermophiler Gärungstemperaturen zur Abtötung von Pathogenen bislang hauptsächlich getrennt untersucht worden. Auch sind die Verwendung von alternativen Inokuli anstelle von Faulschlamm sowie der Einfluss verschiedener Bioadditive auf den Abbauprozess bisher kaum untersucht worden. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung des anaeroben Abbauprozesses der o. g. Abfälle bei thermophilen Temperaturen in zwei verschiedenen Chargengrößen:

201 Zusammenfassung 201 Im Kleinmaßstab wurde die thermophile anaerobe Abbaubarkeit (Vergärung) von Papaya-, Bananen-, Zitrusmischungs- und Geflügelbrutabfällen sowie von Hühnermist, Geflügelschlachtabwasser und Abwasser aus einer Geflügelverpackungsanlage untersucht. Ein wesentliches Augenmerk lag dabei auf dem Einfluss von Papain, drei verschiedenen Bacillus Spezies und Rumensaft als Bioadditive in Einzel- und Kombiniertverwendung auf den Abbauprozess bei drei unterschiedlichen Raumbelastungen und den damit einhergehenden Inokulum/Substrat-Verhältnissen. Im Großmaßstab wurde bei den Versuchen zur thermophilen anaeroben Vergärung von Papaya-, Bananen- und Zitrusmischabfällen sowie Abwasser aus der Geflügelverpackungsanlage der Einfluss des Bioadditivs Rumensaft sowie von unterschiedlichen Raumbelastungen auf den Gärungsprozess untersucht. Für beide Versuchsreihen wurden Stichproben der verschiedenen Obstsorten und der Substrate aus der Geflügelproduktion in einem Großmarkt für Obst und Gemüse bzw. in der Produktionskette einer Geflügelverarbeitungsfirma genommen. Beide Orte der Probenahme befinden sich in Mérida, Mexiko. Die Fruchtproben waren in einem reifen bis überreifen Zustand und wurden mit den Schalen in Stücke von 2 bis 5 mm zerkleinert. Beide Arten von Proben wurden bei 4 o C für wenige Tage bis zu ihren Verwendungen gelagert. Im Kleinmaßstab wurden Batchversuche in Durchstechflaschen von 125 ml bei thermophilen Temperaturen (55 ⁰C) mit kontinuierlicher Durchmischung in Triplikaten durchgeführt. Bei jedem Abfallsubstrat wurden drei verschiedene Raumbelastungen (3, 6 und 9 g ots/l) und die damit einhergehenden Inokulum/Substrat-Verhältnisse (0,4, 0,2, 0,1) untersucht. Bei jeder Raumbelastung wurden die Bioadditive Papain (P), Bacillus sp. (B), Rumensaft (R) und ihre Kombinationen PB, PR, BR und PBR sowie eine Blindprobe zur Kontrolle analysiert. Aus dem Volumen jeder Flasche wurden 80 ml für das zu vergärende Substrat, 20 ml für die einzelnen oder kombinierten Bioadditive bzw. nur für destilliertes Wasser (bei der Blindprobe) und 25 ml als Headspace für das Biogas verwendet. Bei den Gärungsversuchen wurde eine standardisierte Methode mit kleinen Modifizierungen (ohne Nährstofflösung und anderer Zusammensetzung des inerten Gases) eingesetzt. Beim Großmaßstab fand jeweils ein selbst entworfener Reaktor aus Edelstahl mit einem Volumen von 25 Liter Verwendung. Die Gärung wurde als einstufiger

202 Zusammenfassung 202 anaerober Abbauprozess bei thermophilen Temperaturen (55 ºC) mit halbkontinuierlicher Beschickung und kontinuierlicher Durchmischung in Triplikaten durchgeführt. Als Inokulum wurde frisch ausgepresster Rumensaft verwendet. Bei jedem Abfallsubstrat wurden unterschiedliche Raumbelastungen und damit unterschiedliche Inokulum/Substrat-Verhältnisse untersucht. Begonnen wurde mit Raumbelastungen unter 1,5 g ots/(l Woche). Bei beiden Maßstäben wurde ein Monitoring der anorganischen und organischen Prozess- und Bewertungsparameter sowie der Biogasproduktion durchgeführt. Für die Laboranalyse dieser Parameter wurden Standardmethoden verwendet. Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede zwischen den jeweils erzeugten Biogasmengen der Abfallsubstrate wurden bei den Versuchen im Kleinmaßstab statistische Analysen mit Hilfe der Software Statgraphics Plus Version 5.1 durchgeführt. Bei den Versuchen im Großmaßstab wurde zur statistischen Analyse darüber hinaus noch die Software SPSS, Version 17, eingesetzt, um bei jedem Abfallsubstrat signifikante Unterschiede zwischen den Biogasmengen, die bei den verwendeten Raumbelastungen erzeugt wurden, zu bestimmen. Aufgrund der Vielfalt der Ergebnisse und weil Papaya- und Bananenabfälle unter den häufigsten Fruchtabfällen sind, werden in der vorliegenden Arbeit nur diese Abfallsubstrate sowohl im Klein- als auch im Großmaßstab diskutiert und in den nächsten Abschnitten zusammengefasst. Allerdings können dem Anhang die Ergebnisse mit den weiteren Substraten entnommen werden. Bei den Versuchen im Kleimaßstab bei der Vergärung sowohl von Papayaabfällen als auch von Bananenabfällen war das Mindestnährstoffverhältnis für CSB:N:P in Höhe von 300:5:1 gegeben. Es bestand keine Gefahr der Ammonium-, Schwefeloder Schwermetallhemmung. Aufgrund des Einflusses der Variablen Bioadditiv, Raumbelastung oder ihrer Interaktion auf die produzierte Biogasmenge konnten signifikante Unterschiede bei der Biogasproduktion identifiziert werden. Bei der Vergärung von Papayaabfällen zeigten Papain und Bacillus sp. einen positiven Einfluss auf den Prozess nur bei der Raumbelastung von 6 g ots/l. Bei einer Raumbelastung von 6 g ots/l und der Mischung von Papayaabfällen mit Bacillus sp. und Rumensaft (BR) wurde der maximale ots-abbau von ca. 28 Mass.- % am vierten Versuchstag erreicht. Die maximale Biogasausbeute betrug 23,1 ml/g ots und wurde bei der Mischprobe mit Papain und Rumensaft (PR) bei dem

203 Zusammenfassung 203 höchsten eingesetzten Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,40 erreicht. Die anderen Mischproben mit Rumensaft wiesen ebenfalls hohe Biogasmengen auf. Mischungen von Rumensaft mit Papain bzw. Bacillus sp. (PR, BR) und mit beiden Bioadditiven (PBR) können bezogen auf die produzierte Biogasmenge als vielversprechende Alternativen für eine großtechnische Umsetzung betrachtet werden. Bei der Vergärung von Bananenabfällen wiesen Papain und Bacillus sp. einen hemmenden Einfluss auf die Leistung der Rumenmikroorganismen und den Abbauprozess auf. Bei einer Raumbelastung von 6 g ots/l und der Mischprobe mit Rumensaft (R) lag am fünften Tag der maximale ots-abbau bei ca. 38 Mass.-%. Die maximale Biogasausbeute betrug 56,29 ml/g ots und wurde bei dem höchsten eingesetzten Inokulum/Substrat-Verhältnis von ca. 0,40 erreicht. Die Mischprobe nur mit Rumensaft wies o.g. Biogasausbeute auf und kann als eine vielversprechende Alternative für eine großtechnische Umsetzung betrachtet werden. Aufgrund der Gefahren durch Schädlinge und Pathogene bei zerlegten Früchten und der evtl. Übertragung von Krankheiten wurden die Versuche zusätzlich durch eine Untersuchung der Hygienesituation ergänzt. Die thermophilen anaeroben Vergärungen von Papaya- bzw. Bananenabfällen zeigten sich seuchenhygienisch als vielversprechend, weil die Hauptindikatororganismen bzw. Krankheitserreger der Normen und Richtlinien der EU, Mexikos und der USA in den Rohsubstraten gar nicht gefunden bzw. während des Prozesses eliminiert wurden. Somit erfüllte das Gärgut die höchste Kategorisierung dieser Normen und Richtlinien, so dass dieses als Kompost bzw. zur Bodenverbesserung verwertet werden kann. Bei den Versuchen im Großmaßstab bei der Vergärung mit Rumensaft von Papayaabfällen bzw. von Bananenabfällen war ebenso das o. g. Mindestnährstoffverhältnis von CSB:N:P gegeben. Es lagen jedoch hohe Ammoniakkonzentrationen vor, die eine potentielle Ammoniakhemmung bewirken können, solange die Bakterien noch nicht an die entsprechenden Konzentrationen adaptiert worden sind. Bei Ammonium, Schwefel und Schwermetallen wurden die Ergebnisse der Versuche im Kleinmaßstab bestätigt, dass keine Gefahr der Hemmung vorliegt. Zwischen den produzierten Biogasmengen lag bei den untersuchten Raumbelastungen der Abfallsubstrate kein signifikanter Unterschied

204 Zusammenfassung 204 vor. Die Raumbelastung hatte also unter den beschriebenen Versuchsbedingungen keinen signifikanten Einfluss auf die produzierte Biogasmenge. Bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Rumensaft wurde eine maximale Biogasausbeute von ca. 760 ml/g ots bei einem maximalen ots-abbau von ca. 66 Mass.-% erreicht, während bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Rumensaft eine maximale Biogasausbeute von ca. 54 ml/g ots bei einem gleichzeitigen maximalen ots-abbau von ca. 36 Mass.-% erreicht wurde. Es konnte daher bestätigt werden, dass die anaeroben thermophilen Vergärungen mit Rumensaft sowohl von Papayaabfällen als auch von Bananenabfällen bei einer halbkontinuierlichen Beschickung vielversprechende Alternativen sind und sie als Basis für eine großtechnische Umsetzung angewandt werden können.

205 Summary Summary Studies on the Anaerobic Degradation Process of Selected Waste Substrates Using Specific Micro-organisms and Enzymes Tropical fruits such as papayas, bananas or citrus fruits in Mexico are often damaged before harvest during the different growth phases by plagues (such as the locusts plague) or pests, contamination by pesticides, extreme high temperatures and droughts, plant diseases (such antracnosis) or after the harvest during the marketing stages by defective product treatment or by pathogenic microorganisms such as Salmonella. Consequently, large quantities of product get lost per year and currently these are disposed of incorrectly without further use. On the other hand, the amount of waste from the different phases of chicken production over the year is relatively constant and increases every year according to chicken consumption. Large parts of chicken waste that cannot be recycled are disposed of without treatment in waste places or landfills. All of these organic wastes, if in large quantities, create different contamination problems and represent a risk for both humans and the environment. Additionally if these organic wastes are not recycled, they represent a loss of valuable organic materials that could be used as a renewable energy source and thus their contamination problems could be avoided. Furthermore, the availability of inocula from digested sludge is in places with limited anaerobic digestion applications resulted in many difficulties. Instead of that, other alternatives of inoculum sources such as fresh rumen fluid or cattle manure could be used. Similar problems can be found in other tropical producing countries. One possible solution would be to combine the anaerobic digestion of waste with an alternative inoculum. However, the anaerobic digestion of fruit waste and the advantages of the the thermophilic anaerobic digestion in the destruction of pathogens have been researched separately for many years. Additionally, the use of alternative inocula different than digested sludge or the effect on the anaerobic digestion process of different bio-additives, have been up to now poorly studied. The objective of this study was to investigate the anaerobic digestion process of the above mentioned organic wastes by thermophilic temperatures in two scales:

206 Summary 206 A small-scale to study the thermophilic anaerobic bio-degradability (digestion) of wastes from papaya, banana, citric mixed fruits and chicken incubator as well as of chicken manure, wastewater from the chicken slaughterhouse and from chicken packaging. An essential focus was on the influence of papain, three different bacillus species and rumen fluid as bio-additives in single use or in combination with each other, on the degradation process at three different loading rates and three associated ratios of inoculum/substrate. A large-scale to study the thermophilic anaerobic digestion of wastes from papaya, banana and citrus mixed fruits and wastewater from chicken packaging under the influence of different loading rates and of the bio-additive rumen fluid. For both scales, the samples of fruits were collected in a large fruit and vegetable market and those of the different stages of the chicken production, in the production chain of a chicken processing company. Both sampling places are located in Mérida, Mexico. The sampled fruits were in mature to overripe conditions. They were chopped with shells into pieces of 2 to 5 mm. Both types of samples were stored at 4 ⁰C for a few days before being used. In the small-scale, batch experiments in vials of 125 ml at thermophilic temperatures (55 ⁰C) with continuous mixing in triplicates were run. Three different loading rates (3, 6 and 9 g VS/l) and thus three associated ratios of inoculum/substrat (0.4, 0.2, 0.1) were studied in each waste substrate. By each loading rate the bio-additives papain (P), Bacillus species (B), Rumen fluid (R) and their combinations, PB, PR, BR and PBR and a blank as a control were studied. From the volume of each vial, 80 ml were used for substrate, 20 ml for the single or combined bio-additives or only for distilled water (in the blank test) and 25 ml as "headspace" for the biogas. A standardized method was applied with small modifications in these digestions (without nutrient solution and different composition of the inert gas). In the large-scale, a self-designed reactor of 25 liters made of stainless steel was used. A single-stage anaerobic digestion process at thermophilic temperatures (55 C) with a semi-continuous feed and continuous mixing was run in triplicates. As the inoculum, fresh squeeze rumen fluid was utilized. Different loading rates and thus different associated ratios of inoculum/substrate were studied in each waste substrate. It was started with loading rates less than 1.5 g VS/(l week).

207 Summary 207 In both scales a monitoring of inorganic and organic process and control parameters as well as of the biogas production were carried out. Standard methods for the laboratory analysis of these parameters were used. In the experiments in the small-scale, statistical analyzes assisted by the software Statgraphics Plus version 5.1 were carried out to determine if in each waste substrate there were significant differences among the biogas quantities generated by each load, bio-additive and their interactions. In the experiments in the largescale, the statistical analyzes were carried out using additionally the software SPSS version 17, to determine if in each waste substrate there were significant differences among the biogas quantities produced by each load used. Due to the large number of research results and because papaya and banana waste under the major fruit wastes are, in the present work only those of these wastes in both scales are discussed and summarized in the next paragraphs. However, further results related to the others waste substrates can be found in the appendix. In the small-scale, during the corresponding digestions of papaya and banana waste, the minimum of the nutrient ratio COD:N:P was given in the amount of 300:5:1. No risk existed for ammonium, sulfur and heavy metal inhibition. Due to the influence on the biogas produced of the variables bio-additive, organic loading rate or their interaction, significant differences among the biogas quantities were found. In the digestion of papaya waste, papain and bacillus sp. showed a positive influence on the process only at the loading rate of 6 g VS/l. At the loading rate of 6 g VS/l and in the mixture of papaya waste with bacillus sp. and rumen fluid (BR), the VSreduction was about 28 % and was achieved on the fourth day. The maximum biogas yield was 23.1 ml/g VS added and was obtained in the composite sample with papain and rumen fluid (PR) at the highest ratio of inoculum/substrate of The other composite samples with rumen fluid also showed high amounts of biogas. Mixtures of rumen fluid with papain or bacillus sp. (PR, BR) and with both bio-additives (PBR) can be considered in relation to the amount of biogas produced as promising alternatives for large-scale implementation. In the digestion of banana waste, papain and bacillus sp. showed an inhibitory effect on the performance of the rumen fluid micro-organisms and the digestion process. At the loading rate of 6 g VS/l and the mixed sample of banana waste with rumen fluid (R) the maximum VS-reduction was about 38 % and was achieved on the fifth

208 Summary 208 day. The maximum biogas yield was ml/g VS added and was obtained at the highest ratio of inoculum/substrate of The mixed sample with rumen fluid showed the above-mentioned maximum biogas yield and can be considered as one of the promising alternatives for a large-scale implementation. Due to the risk of pests and pathogens in the decomposed fruits and to possible diseases transmission, these experiments were complemented with a study of the hygiene situation. The thermophilic anaerobic digestions of papaya and banana waste were hygienically promising, because the main indicator organisms or pathogens of the standards of the EU, Mexico and USA were not found in the raw substrates or were eliminated by the process. Thus, the digested material fulfilled the highest categorization of these standards, so that it can be reused as compost or soil improver. In the large-scale, during the digestions with rumen fluid of papaya waste and respectively of banana waste, the above-mentioned minimum of the nutrient ratio COD:N:P was also given. However, there were high concentrations of ammonia, which can cause a potential ammonia inhibition, while bacteria are not been adapted to these concentrations. For ammonium, sulfur and heavy metals, the results of the small scale were confirmed. That is, no risk existed for the inhibition in either case. In each studied waste substrate, there were no significant differences among the biogas quantities produced at the used loading rates. That means that the loading rate had no significant effect on the biogas quantity under the described experimental conditions. In the digestion of papaya waste with rumen fluid, the maximum biogas yield was about 760 ml/g VS added, with a maximum VS-reduction of about 66 %. In the digestion of banana waste with rumen fluid, the maximum biogas yield was about 54 ml/g VS added, with a simultaneous maximum VS-reduction of approximately 36 %. Therefore, could be confirmed that the anaerobic thermophilic digestions with rumen fluid of papaya waste and respectivelly of banana waste with a semicontinuous feeding are promising alternatives. Thus, they can be used as a basis for full-scale implementation.

209 Anhänge Anhänge 12.1 Anhang A: Stand der Produktion von Zitrusfrüchten, Banane und Papaya in Mexiko Tab. 12.1: Stand der Produktion von Zitrusfrüchten, Banane und Papaya in Mexiko, Jahr 2012 nach SAGARPA, 2012 und INIFAP, 2014 Frucht Anbaufläche Erntefläche Differenz produzierte Menge Leistung Inlandspreis Produktionswert (Ha) (Ha) (%) (Ton) (Ton/ha) (Euro/Ton) (Euro) Vorernte (Ton) Verluste ca. 30 % Nachernte (Ton) Verlustwert (Euro) Orange , ,14 2, ,65 11,34 90, , , , ,79 Zitrone , ,70 10, ,89 13,78 131, , , , ,61 Zitrone (real) 4,5 4,5 0,00 33,45 7,43 223, ,08 0,00 10, ,02 Grape Fruit (Pomelo) , ,21 6, ,85 24,32 95, , , , ,32 Mandarin , ,41 5, ,07 12,81 72, , , , ,19 Limette 1.563, ,38 4, ,08 10,44 132, ,63 458, , ,85 andere Zitrusfrüchte 222,07 180,52 18,71 847,65 4,70 115, ,45 117,06 254, ,02 Gesamtzitrusfrüchte , ,86 5, ,64 84,81 862, , , , ,81 Banane , ,44 3, ,42 30,35 144, , , , ,87 Papaya , ,85 12, ,40 50,11 205, , , , ,05 Tab. 12.2: Stand der Produktion von Zitrusfrüchten, Banane und Papaya in Yucatán, Mexiko, Jahr 2012 nach SAGARPA, 2012 und INIFAP, 2014 Frucht Anbaufläche Erntefläche Differenz produzierte Menge Leistung Inlandspreis Produktionswert (Ha) (Ha) (%) (Ton) (Ton/ha) (Euro/Ton) (Euro) Vorernte (Ton) Verluste ca. 30 % Nachernte (Ton) Verlustwert (Euro) Orange , ,86 3, ,35 12,71 66, , , , ,06 Zitrone 5.234, ,94 8, ,52 26,55 69, , , , ,54 Grape Fruit (Pomelo) 442,36 428,57 3, ,74 17,09 148, ,64 141, , ,21 Mandarin 659,33 622,33 5, ,05 11,68 114, ,81 259, , ,91 Limette 8,29 6,61 20,27 72,15 10,92 244, ,89 11,01 21, ,02 andere Zitrusfrüchte 171,07 137,52 19,61 568,06 4,13 67, ,75 83,14 170, ,21 Gesamtzitrusfrüchte , ,83 5, ,87 83,08 711, , , , ,95 Banane , ,95 5,03 313, ,88 9,05 313, ,27 Papaya 631,6 460,6 27, ,26 43,53 188, , , , ,07

210 ml Biogas/d mg Fettsäure/l ml Biogas/d mg Fettsäure/l Anhänge Anhang B: Ergebnisse der Versuche im Mittelmaßstab Abb. 12.1: Foto der Reaktoren im Mittelmaßstab im Umweltlabor des Lehrstuhls für Energieund Umwelttechnik der Lebensmittelindustrie der TU München Zeit (Tage) Tägliches Biogas Essigsäure Propionsäure Iso-Buttersäure Buttersäure Iso-Valeriansäure Abb. 12.2: Tägliche Biogasproduktion und Fettsäurekonzentrationen bei der Vergärung von Papayaabfällen mit Faulschlamm Zeit (Tage) Tägliches Biogas Essigsäure Propionsäure Iso-Buttersäure Iso-Valeriansäure Abb. 12.3: Tägliche Biogasproduktion und Fettsäurekonzentrationen bei der Vergärung von Bananenabfällen mit Faulschlamm