Research Collection. Identification and characterization of a nogo-a-specific receptor complex. Doctoral Thesis. ETH Library. Author(s): Kempf, Anissa

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1 Research Collection Doctoral Thesis Identification and characterization of a nogo-a-specific receptor complex Author(s): Kempf, Anissa Publication Date: 2013 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 Diss. ETH No IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF A NOGO-A-SPECIFIC RECEPTOR COMPLEX A dissertation submitted to ETH ZURICH for the degree of Doctor of Sciences presented by ANISSA KEMPF Master of Science ETH Biology Basel-Stadt, BS accepted on the recommendation of Prof. Dr. Martin E. Schwab Prof. Dr. Ueli Suter Prof. Dr. Daniel Gygax 2013

3 Summary Adult central nervous system (CNS) axons show restricted growth and regeneration properties after injury as opposed to axons from the peripheral nervous system (PNS). CNS regeneration is prevented by poor cell-intrinsic activation of growth as well as by cell-extrinsic growth suppressors. One of the best-studied extrinsic growth-inhibitory factors is the membrane protein Nogo-A. Acute blockade of Nogo-A with neutralizing antibodies leads to regenerative growth, increased sprouting and enhanced plasticity, as well as functional recovery after different types of injuries in the adult mammalian CNS. In addition, an induction of structural and synaptic plasticity is observed upon genetic deletion or acute neutralization of Nogo-A in the intact CNS, conferring onto Nogo-A an important physiological role as a negative regulator of neuronal plasticity and a stabilizer of the adult CNS anatomy. Nogo-A possesses two distinct inhibitory extracellular domains: Nogo-A-Δ20 and Nogo-66. Two receptors for Nogo-66, Nogo-66 receptor 1 (NgR1) and Paired immunoglobulin-like receptor B (PirB), together with co-receptors, have been previously identified. NgR1 and PirB also bind to the Nogo protein isoforms Nogo-B and Nogo-C as well as to other multiple ligands. The existence of a Nogo-A-Δ20-specific receptor or receptor complex has been postulated in numerous studies; however, its molecular identity remained elusive up to now. The major focus of this thesis lies on the identification and characterization of the receptor(s) transducing signals from the inhibitory Δ20 domain of Nogo-A. The introductory Chapter 1 of this thesis reviews the structural and molecular characteristics of Nogo-A, and provides a broad picture of its signal transducers and pathways. Moreover, it describes emerging physiological roles of Nogo-A in restricting different forms of plasticity in the adult CNS and during development. In chapter 2, potential genetic compensatory mechanisms in the CNS of Nogo-A knockout (KO) mice are investigated, which may explain why the regenerative phenotype in Nogo-A KO mice is less pronounced than after acute blockade of Nogo-A. The results show an upregulation of several repulsive axon guidance molecules and identify EphrinA3 as a novel neuronal growth inhibitor signaling via the receptor EphA4. These i

4 findings suggest a role for EphA4 in partially mediating the residual inhibition observed in Nogo-A KO mice. In chapter 3, I describe the G protein-coupled receptor (GPCR) Sphingosine 1- phosphate receptor 2 (S1PR2) as the first functional receptor for Nogo-A-Δ20. By using a combination of biochemical, cell biological and immunohistochemical methods, I show that S1PR2 fulfills essential criteria to be a Nogo-A-Δ20-specific receptor. In addition, the physiological relevance of this interaction is demonstrated by the ability of S1PR2 to restrict long-term potentiation (LTP) in the hippocampus as well as in the motor cortex, similar to Nogo-A. Importantly, these effects are not observed in Nogo-A KO mice or upon Nogo-A neutralization. Capitalizing on the findings presented in chapter 3, I show in chapter 4 that Nogo- A-Δ20-mediated inhibition is subjected to an important layer of regulation by heparan sulfate proteoglycans (HSPGs). I show that Nogo-A-Δ20 binds to HSPGs and that cell surface HSPGs are essential for the inhibitory activity of Nogo-A-Δ20. This thesis concludes with chapter 5 by discussing the significance of the results obtained and gives an outlook on future directions that I envision the Nogo-A field to take. I am confident that this thesis paves the way for future studies on the composition and physiological relevance of a Nogo-A-Δ20 receptor complex, which we are only beginning to understand. ii

5 Zusammenfassung Im Vergleich zum adulten peripheren Nervensystem (PNS) weist das Zentralnervensystem (ZNS) eine limitierte Wachstums- und Regenerationskapazität nach Verletzung auf. Ursächlich für die Hemmung der Regeneration des ZNS sind diverse zellintrinsische als auch zellextrinsische Mechanismen. Einer der beststudierten zellextrinsischen Faktoren ist das Membranprotein Nogo-A. Akute Nogo-A Blockade mittels neutralisierender Antikörper führt zu regenerativem Wachstum von Neuronen, vermehrtem Aussprossen und erhöhter Plastizität, sowie zur funktionellen Erholung nach unterschiedlichen Verletzungsarten des adulten ZNS von Säugetieren. Interessanterweise wird auch eine Erhöhung der strukturellen und synaptischen Plastizität nach genetischer oder akuter Neutralisierung von Nogo-A im intakten ZNS beobachtet, womit Nogo-A eine wichtige physiologische Rolle als Unterdrücker neuronaler Plastizität und Stabilisator der adulten ZNS Anatomie einnimmt. Nogo-A hat zwei unterschiedliche inhibitorische extrazelluläre Domänen: Nogo-A- Δ20 and Nogo-66. Zwei Rezeptoren für Nogo-66, Nogo-66 Rezeptor 1 (NgR1) und Paired immunoglobulin-like Rezeptor B (PirB), zusammen mit deren Korezeptoren, wurden bereits identifiziert. Sowohl NgR1 als auch PirB binden an die Nogo Proteinisoformen Nogo-B und Nogo-C sowie an andere Liganden. Mehrere Studien haben das Vorhandensein von einem Nogo-A-Δ20-spezifischen Rezeptor oder Rezeptorkomplex postuliert, dennoch bleibt seine molekulare Identität bis heute unbekannt. Diese Doktorarbeit beschreibt die erstmalige Identifizierung und Charakterisierung Nogo-A-Δ20- spezifischer Rezeptoren, die wachstumsinhibitorische Signale in die Zelle weiterleiten. Das Einleitungskapitel 1 dieser Doktorarbeit fasst die strukturellen und molekularen Eigentschaften von Nogo-A zusammen und liefert ein detailliertes Bild dessen Signalüberträger und Signalwege. Zusätzlich wird eine aufkommende Rolle von Nogo- A als Unterdrücker unterschiedlicher Formen von Plastizität im adulten ZNS sowie während der Gehirnentwicklung beschrieben. In Kapitel 2 werden genetische kompensatorische Mechanismen im ZNS von Nogo- A Knockout (KO) Mäusen untersucht, die potentiell erläutern, warum die beobachteten Regenerationseffekte in Nogo-A KO Mäusen kleiner sind als nach akuter Neutralisierung iii

6 von Nogo-A. Die Resultate zeigen eine Hochregulation unterschiedlicher repulsiver axonaler Wegleitungsmolekülen, und identifizieren EphrinA3 als neuen Inhibitor von neuronalem Wachstum, der Signale über den Rezeptor EphA4 weiterleitet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass EphA4 partiell zu der verbleibenden Inhibition in Nogo-A KO Mäusen beisteuert. In Kapitel 3 beschreibe ich den G Protein-gekoppelten Rezeptor (GPGR) Sphingosin 1-Phosphat Rezeptor 2 (S1PR2) als ersten funktionellen Rezeptor für Nogo-A-Δ20. Mittels einer Kombination von biochemischen, zellbiologischen und immunhistochemischen Methoden zeige ich, dass S1PR2 essentielle Kriterien erfüllt um als Nogo-A-Δ20- spezifischer Rezeptor zu fungieren. Zusätzlich wird die physiologische Relevanz dieser Interaktion durch die Fähigkeit von S1PR2 eine Langzeitpotenzierung im Hippokampus sowie im motorischen Kortex (ähnlich wie Nogo-A) zu hemmen, gezeigt. Wichtig ist die Tatsache, dass diese Effekte weder in Nogo-A KO Mäusen noch nach akuter Nogo-A Neutralisierung zu beobachten sind. Basierend auf Kapitel 3 zeige ich in Kapitel 4, dass die Signalübertragung von Nogo- A-Δ20 massgebend reguliert wird duch Heparansulfatproteoglykane (HSPGs). Ich zeige, dass Nogo-A-Δ20 an HSPGs bindet und, dass Zelloberflächen-HSPGs essentiell sind für die inhibitorische Aktivität von Nogo-A-Δ20. Diese Doktorarbeit schliesst mit Kapitel 5 ab. Die Signifikanz der erarbeiteten Ergebnisse sowie weiterführende Projekte werden diskutiert. Ich bin zuversichtlich, dass diese Arbeit den Weg geebnet hat für zukünftige Studien über die Zusammenstellung und physiologische Relevanz eines Nogo-A-Δ20-spezifischen Rezeptorkomplexes, den wir gerade erst allmählich zu verstehen beginnen. iv