Untersuchungsmethoden in der Toxikologie

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1 Inhalte Aufgaben der Toxikologie Kontakte mit Stoffen Arten der Einwirkung von Chemikalien Einteilung von Giftstoffen und ihrer biologischen Wirkung Untersuchungsmethoden in der Toxikologie Schließen vom Experiment auf den Menschen 1

2 Inhalte Akute Schadwirkung - Akute Toxizität - Hautreizung - Schleimhautreizung Sensibilisierende Eigenschaften Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung - Subakut - Subchronisch - Chronisch Mutagenität Kanzerogenität Teratogenität 2

3 Schutzziele und Anwendungsbereiche Schutzziele - Arbeitnehmer - Verbraucher - Über die Umwelt indirekt exponierte Bevölkerungsgruppen Anwendungsbereiche - Neue Chemikalien - Altstoffe - Neue Produkte 3

4 Exposition und Risiken Hautkontakt - Hautschädigung - Kontaktallergie - Resorption Augenkontakt - Augenschädigug - Resorption Inhalation - Lungenschädigung - Allergisches Asthma - Resorption Ingestion oder Resorption - Akute Vergiftung - Chronische Vergiftung Systemische Intoxikation Organspezifische Schädigungen Akkumulation Erbgutschädigungen Kanzerogenität Embryotoxizität Fertilitätsstörungen Neurotoxizität Immuntoxizität 4

5 Grundlagen der Bewertung von Chemikalien Chemische Struktur Physikalisch-chemische Eigenschaften Struktur-Wirkungs-Beziehungen Informationen über chemisch verwandte Stoffe Experimentelle Daten 5

6 Akute Toxizität - oral (1) Ziel Ermittlung der akuten toxischen Eigenschaften eines Stoffes nach einmaliger oraler Applikation (oder mehrmaliger Applikation innerhalb von 24 Stunden) Testsystem Versuchstiere (Ratte, Maus; 5 Tiere / Dosisgruppe / Geschlecht) Durchführung (OECD 401, 1987) - Applikation - Beobachtungszeit mindestens 14 Tage - Sektion nach Versuchsende 6

7 Akute Toxizität - oral (2) Auswertung Parameter Klinische Symptome Körpergewicht Makroskopische und histologische Befunde Angabe der Ergebnisse als mediane letale Dosis LD in mg/kg Körpergewicht 50 Bewertung Einstufung LD 50 oral Ratte (mg/kg) sehr giftig < 25 giftig mindergiftig Besonderheiten Fixed -Dose-Methode (OECD 420, 1991): - Festgelegte Dosierungen (5, 50, 500, 2000 mg/kg) - Beginn mit einer Dosierung - Je nach Toxizitätssymptomen Fortsetzung mit der nächsthöheren bzw. nächstniedrigeren Dosis 7

8 Akute Toxizität - dermal (1) Ziel Ermittlung der akuten toxischen Eigenschaften eines Stoffes nach einmaliger dermaler Applikation Testsystem Versuchstiere (bevorzugt Ratte; Kaninchen oder Meerschweinchen möglich; 5 Tiere / Dosisgruppe / von einem Geschlecht) Durchführung (OECD 402, 1987) - Applikation - Beobachtungszeit mindestens 14 Tage - Sektion nach Versuchsende 8

9 Akute Toxizität - dermal (2) Auswertung Parameter - Klinische Symptome - Körpergewicht - Makroskopische und histologische Befunde Angabe der Ergebnisse als mediane letale Dosis LD in mg/kg Körpergewicht Bewertung Einstufung LD 50 dermal Ratte, Kaninchen (mg/kg) sehr giftig < 50 giftig mindergiftig Besonderheiten Ausführung als Limit-Test: mg/kg - Applikation auf mindestens 10% der Körperoberfläche Keine Prüfung bei ätzenden Eigenschaften des Stoffes 9

10 Akute Toxizität - inhalativ (1) Ziel Ermittlung der akuten toxischen Eigenschaften eines Stoffes nach kurzzeitiger inhalativer Applikation Testsystem Versuchstiere (Ratte, 5 Tiere / Dosisgruppe / Geschlecht) Durchführung (OECD 403) - Applikation über 4 Stunden - Beobachtungszeit mindestens 14 Tage - Sektion nach Versuchsende 10

11 Akute Toxizität - inhalativ (2) Auswertung Parameter - Klinische Symptome - Körpergewicht - Makroskopische und histologische Befunde Angabe der Ergebnisse als mediane letale Konzentration LC 50 Bewertung Einstufung LC 50 inhalativ Ratte (mg/l x 4h) sehr giftig < 0,5 giftig 0,5 2,0 mindergiftig 2,

12 Reizung und Ätzung Test auf akute Hautreizung (OECD 404) Prinzip: Die Testsubstanz wird auf die Haut von Albino-Kaninchen für 4 Stunden unter semiokklusiven Bedingungen aufgetragen. Der Grad der Hautreizung über einen Zeitraum von 72 Stunden wird bewertet (Rötung- und Ödembildung). Nachbeobachtung bis 14 Tage. Validierte in vitro-methoden: z.b. 3D- Hautmodelle (OECD 431) 12

13 3D-Hautmodelle Kultivierung der Hautzellen auf einer speziellen Matrix Physiologisch stabil für Tage - Wochen Biologische Antwort vergleichbar zu menschlicher Haut 3D-Hautmodell Normale menschliche Haut 13

14 Reizung und Ätzung (2) Test auf akute Augenreizung (OECD 405) Prinzip: Die Testsubstanz wird in den Bindehautsack von Albino-Kaninchen appliziert. Die Effekte auf Cornea, Iris und Konjunktiva werden beobachtet und der Schweregrad bewertet. In vitro-alternative: e.g. Hühnerei-Test (HET-CAM) 14

15 HET-CAM Test CAM unbehandelt CAM 10 Sek nach 10 % SDS 15

16 Vergleich 3 Stoffe in 24 Laboren... 16

17 Hautsensibilisierung Typ 4 Allergie : Spätreaktionstyp Tritt erst 12 bis zu 72 Stunden nach dem Allergenkontakt auf. Irreversibel, einmal erworbene Allergie besteht lebenslang. Oft gegenüber Konservierungsmitteln, Parfüminhaltsstoffen, Farbstoffen und Nibzw. Cr-Verbindungen Typ I-Allergie 17

18 Hautsensibilisierung Traditionell Test am Meerschweinchen (OECD 406): GMPT Bühler-Test Neue Alternative: Local Lymph Node Assay an Mäusen (OECD 429); weniger Tiere, Informationen über sensibilisierende Potenz Test am Menschen: Human Repeat Insult Patch Test 18

19 Sensibilisierung (Haut) Ziel Erkennen des sensibilisierenden Potentials eines Stoffes Testsystem Versuchstiere (Meerschweinchen) Durchführung - Vergleich von behandelten und unbehandelten Kollektiven - Induktion - intra- oder epicutan - mit oder ohne Adjuvans - Ruheperiode - Auslösung Auswertung - nicht-reizende Konzentration - Beurteilung der Hautreaktionen (Rötung, Schwellung) - Vergleich der Häufigkeit der Reaktionen bei behandelten und unbehandelten Tieren 19

20 Sensibilisierende Potenz Schneider und Akkan,

21 Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung (1) Ziel Erkennen des chronischen Schädigungspotentials eines Stoffes Testprinzip Vergleich der Effekte zwischen behandelten und unbehandelten Kollektiven Testsystem Versuchstiere (meist Ratten oder Mäuse) Durchführung - Applikation (oral, dermal, inhalativ) in der Regel täglich - unbehandelte Kontrollgruppe, eine oder mehrere Dosisgruppen) - klinische Beobachtung - Laboruntersuchungen (Klinische Chemie, Hämatologie) während und am Ende der Prüfung - Sektion am Versuchsende 21

22 Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung (2) Art der Prüfung Versuchsdauer Zeitbedarf bis zur Auswertung subakut 4 Wochen 7 bis 8 Monate subchronisch 3 Monate 9 bis 10 Monate chronisch 1 Jahr ca. 20 Monate 22

23 Effekte bei wiederholter oder chronischer Einwirkung (3) Auswertung Vergleich der Parameter zwischen behandelten und unbehandelten Kollektiven (biometrische Auswertung) - Futteraufnahme - Wasseraufnahme - Körpergewichtsentwicklung - Klinische Symptome - Mortalität - Hämatologie - Klinische Chemie - Pathologie (makroskopisch und mikroskopisch) Bewertung - NEL (No-Effect-Level) - NOEL (No-Observed-Effect-Level) - in mg/kg tägliche Dosis 23

24 Mutagenität Definitionen Mutation Veränderungen in der genetischen Information Punktmutation Veränderungen im molekularen Aufbau der DNA Chromosomenmutation Strukturelle Veränderungen der Chromosomen Genommutation Veränderungen in der Chromosomenzahl 24

25 Mutagenität - Punktmutation: Ames-Test (1) (Salmonella typhimurium / Säugermikrosomen - Rückmutationstest) Ziel Erkennen eines erbgutverändernden Potentials von Stoffen Testsystem Bakterien (Salmonella thyphimurium) Verschiedene Stämme z.b.: TA 100 Basenpaaraustausch TA 1535 TA 98 Leserastermutationen TA 1537 TA

26 Mutagenität - Punktmutation: Ames-Test (2) Testprinzip Durch mutagene Agenzien induzierte Rückmutation von Histidin-abhängigen zu Histidin-unabhängigen Bakterien Durchführung verschiedene Stämme, mit und ohne metabolische Aktivierung, Negativ- und Positivkontrollen, Konzentrationsreihe mit Prüfsubstanz Inkubation der Bakteriensuspension mit entsprechenden Zusätzen Inkubation auf Minimalagarplatten Auswertung 26

27 Mutagenität - Punktmutation: Ames-Test (4) Bewertung der Ergebnisse - Negativ: Kein mutagenes Agens Keine Erhöhung der Revertantenrate im Vergleich zur Negativkontrolle - Positiv: Bakterielles Mutagen Erhöhung der Revertantenrate im Vergleich zur Negativkontrolle dosisabhängig und/oder reproduzierbar und/oder mindestens Verdoppelung oder Verdreifachung der Revertantenrate (abhängig vom Teststamm) in mindestens einem Teststamm ohne und/oder mit metabolischer Aktivierung Schlußfolgerungen Untersuchter Stoff induziert Genmutationen an bakterieller DNS Überprüfung des Potentials für Punktmutationen an Säugerzellen Überprüfung des Potentials für Chromosomenmutationen an Säugerzellen 27

28 Mutagenität - Chromosomen- und Genommutation: Zytogenetik in vitro (1) Ziel Erkennen eines erbgutverändernden Potentials von Stoffen an Säugerzellen Testsystem Etablierte Zellkulturen oder Primärkulturen vom Säuger z.b.: - Humanlymphozyten - Zellen von Geweben des chinesischen Hamsters (V79 - Lungenfibroblasten, CHO - Ovarialzellen) 28

29 Mutagenität - Chromosomen- und Genommutation: Zytogenetik in vitro (2) Testprinzip Behandlung der Zellkulturen mit den zu prüfenden Stoffen während verschiedener Phasen des Zellzyklus. Zytogenetische Diagnose struktureller Veränderungen (Chromosomenaberrationen) an Zellen, die in der Metaphase arretiert wurden. Durchführung - Unterschiedliche Behandlungszeit und -dauer, mit und ohne metabolische Aktivierung, Negativ- und Positivkontrollen, Konzentrationsreihe mit Prüfsubstanz, 2 Zellkulturen pro Testpunkt - Vorkultivierungsphase und Toxizitätsvortest - Zelleinsaat und Anwachsen der Zellen - Inkubation der Zellkultur mit entsprechenden Zusätzen - Arretierung der Zellen in der Metaphase durch das Spindelgift Colcemid - Aufarbeitung der Zellen (Zellen abernten, Fixieren, Ausstriche, Anfärben) - Mikroskopische Auswertung 29

30 Mutagenität - Chromosomen- und Genommutation: Zytogenetik in vitro (4) Bewertung der Ergebnisse Negativ: Kein mutagenes Agens - Keine Erhöhung der Aberrationsrate im Vergleich zur Negativkontrolle Positiv: Mutagenes Agens an Säugerzellen - Erhöhung der Aberrationsrate im Vergleich zur Negativkontrolle - dosisabhängig und/oder - reproduzierbar und/oder - biologisch und statistisch signifikant (außerhalb des Bereiches historischer Kontrollwerte) Schlußfolgerungen Untersuchter Stoff induziert Chromosomenmutationen an Säugerzellen bei Exposition in vitro Überprüfung des Potentials zur Induktion von Chromosomenmutationen an Säugerzellen bei Exposition in vivo 30 Toxikologie für Chemiker WS 1994/95: Untersuchungsmethoden in der Toxikologie ##

31 Kanzerogenität: Daten zur Beurteilung der krebserzeugenden Wirkung von Chemikalien Chemische Struktur Hinweise aus Mutagenitätstests Tierexperimentelle Ergebnisse Epidemiologie 31

32 Kanzerogenität (1) Ziel Erkennen eines krebserzeugenden Potentials von Stoffen Testsystem Versuchstiere (In der Regel Ratten und Mäuse); mindestens 50 Tiere pro Dosisgruppe und Geschlecht Durchführung (OECD 451, 1981) - Lebenslange Behandlung mit der Prüfsubstanz (meist täglich) - Applikationswege: oral, dermal, inhalativ; in Sonderfällen Injektion - Dauer: 24 Monate (Ratten), 18 Monate (Mäuse) - Mindestens 3 Dosierungen + Kontrollgruppe(n) - Dosierungen unterhalb der chronisch-toxischen Dosis - Substanzanalytik (Stabilität, Dosis, Bioverfügbarkeit) - Klinische Beobachtung - Zwischenuntersuchungen - Enduntersuchung und Sektion bei Versuchsende 32

33 Kanzerogenität (2) Auswertung Entwicklungsverlauf (Futter- und Wasseraufnahme, Körpergewichtsentwicklung) Klinische Beobachtung Hämatologie und klinische Chemie Sektion Histologie aller wichtigen Organe und Gewebe Auftreten von Tumoren im Vergleich zu den Kontrollgruppen - Häufigkeit - Lokalisation - Induktionszeit - benigne / maligne - Dosisabhängigkeit - Vergleich mit historischen Kontrolldaten - Statistische Auswertung aller Parameter Bewertung Bei statistisch signifikanten Unterschieden im Auftreten von Tumoren im Vergleich zu den Kontrollgruppen Einstufung als kanzerogen im Tierversuch 33

34 Reproduktionstoxizität, Segment I/II/III Studie 34

35 Embryotoxizität / Teratogenität (1) Ziel Erkennen des Potentials von Stoffen, während der embryonalen Entwicklung strukturelle und funktionale Veränderungen zu induzieren Testsystem Versuchstiere (bevorzugt Ratten; Kaninchen); 20 Tiere pro Dosisgruppe Durchführung (OECD 414, 1981) - Behandlung Tag der Trächtigkeit - 3 Dosisgruppen, 1 Kontrollgruppe - Applikation in der Regel oral - Substanzanalytik - Klinische Beobachtung Tag der Trächtigkeit Entnahme der Feten (Sectio) 35

36 Embryotoxizität / Teratogenität (2) Auswertung Maternale Toxizität (Körpergewicht, Futteraufnahme, Klinische Beobachtung, Sektion) Uterus- und Plazentagewichte Zahl der Corpora lutea Zahl und Gewicht der Feten Lebend-/Tot- und Geschlechtsverhältnis der Feten Veränderte oder untergewichtige Feten Resorptionen Untersuchung der Feten - Skelett (Alizarin-Färbung) - Weichgewebe (Wilson-Technik) Vergleich mit historischen Daten Bewertung Bei Unterschieden in den entsprechenden Parametern im Vergleich zu den Kontrollgruppen Potential zur Erzeugung von Mißbildungen 36