Mitotic chromosome movement in human cells

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1 Research Collection Doctoral Thesis Mitotic chromosome movement in human cells Author(s): Cartaxo Amaro, Ana Catarina Publication Date: 2010 Permanent Link: Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library

2 DISS. ETH NO MITOTIC CHROMOSOME MOVEMENT IN HUMAN CELLS a dissertation submitted to ETH Zürich for the degree of Doctor of Sciences presented by ANA CATARINA CARTAXO AMARO Licenciatura Degree in Biological Engineering Instituto Superior Técnico Technical University of Lisbon born January 20, 1981 citizen of Portugal accepted on the recommendation of Prof. Dr. Patrick Meraldi, examiner Prof. Dr. Daniel Gerlich, co-examiner Prof. Dr. Jonathon Pines, co-examiner 2010

3 SUMMARY Chromosome segregation in mammalian cells requires the alignment of sisterchromatids onto the metaphase plate. These movements are driven by kinetochores, multi-protein complexes that connect chromosomes to dynamic spindle microtubules, and regulate the plus-end dynamics of the attached microtubules. These bundles of kinetochore-bound microtubules alternate between phases of growth and shrinkage, making chromosomes undergo regular oscillatory movements along the spindle axis. These movements are, in general, accompanied by changes in the distance between sister-kinetochores, which are commonly referred to as breathing. However, the molecular mechanisms that coordinate these movements and regulate microtubule plusend dynamics remain poorly understood. To investigate these processes, we developed, in a consortium, a four-dimensional imaging protocol combined with computational image analysis that tracks the movement of individual kinetochores over time, and identifies sister-kinetochore pairs from their trajectories. Our data show that oscillation and breathing speeds of sister-kinetochore pairs in late prometaphase and metaphase are controlled by the microtubule depolymerases MCAK and Kif18A, while the period of oscillation and breathing is defined by the stiffness of the mechanical linkage between sisters. Furthermore, as cells progress towards anaphase, their metaphase plates get thinner, due to a progressive decrease in oscillation speed. Thus, we propose that formation and thinning of the metaphase plate depend on a rigorous control of the state of the mechanical linkage between sisters. Using our established kinetochore tracking assay, we screened for kinetochore proteins required for the control of microtubule dynamics and chromosome oscillations during metaphase. Strikingly, we found that the centromeric nucleosome-associated complex CENP-A NAC/CAD, which was believed to be only a structural scaffold within the kinetochore, is essential for such regular movements. Cells lacking this complex fail to congress all chromosomes, suggesting that oscillations are necessary for the organization of the metaphase plate. Our results indicate that CENP-A NAC/CAD mediates these effects by regulating microtubule plus-end tubulin turnover. Moreover, we show that the stoichiometry of CENP-A NAC/CAD on individual sister-kinetochores dynamically changes as their bound microtubules switch from growth to shrinkage in vivo, and that at least one CENP-A NAC/CAD subunit can bind microtubules in vitro. 1

4 Thus, we propose that the CENP-A NAC/CAD directly regulates microtubule plus-ends within a kinetochore, and that the asymmetric distribution of its components could be part of a feedback mechanism necessary for the production of chromosome oscillations in mitosis. 2

5 ZUSAMMENFASSUNG Chromosomensegregation in Säugetierzellen benötigt die Anordnung der Schwester- Chromatiden in der Metaphasen-Platte. Diese Ausrichtung wird durch Kinetochore gesteuert und angetrieben. Kinetochore sind Komplexe bestehend aus mehreren Proteinen, welche die Chromosomen mit den dynamischen Spindel-Mikrotubuli verbinden und welche die Plus-End-Dynamik der daran fixierten Mikrotubuli regulieren. Diese Mikrotubuli haben wechselweise Phasen des Wachstums und des Schrumpfens, was eine regelmässige, oszillierende Bewegung der Chromosomen entlang der Spindelachse zur Folge hat. Zusätzlich verändert sich im Allgemeinen auch die Distanz zwischen den Schwester-Chromatiden, was gemeinhin als Atmen bezeichnet wird. Die molekularen Mechanismen, welche hinter all diesen Prozessen stehen, sind bis heute schlecht verstanden. Wir haben mit anderen Arbeitsgruppen ein Konsortium gebildet, um diese Prozesse zu untersuchen und besser zu verstehen. Dabei verwendeten wir ein vier-dimensionales bildgebendes Verfahren in Kombination mit einer Computer-basierten Bildanalyse, welche die Bewegungen individueller Kinetochore über die Zeit verfolgt und analysiert und zusammengehörende Schwester-Kinetochore anhand ihrer jeweiligen Bahnen identifiziert. Unsere Experimente zeigten, dass die Oszillations- und Atmungsgeschwindigkeit von Schwester-Kinetochor-Paaren in der späten Prometaphase und Metaphase durch die Mikrotubuli-Depolymerasen MCAK und Kif18A kontrolliert werden. Im Gegensatz dazu hängen die Perioden der Oszillation und der Atmung von der Starrheit der mechanischen Verbindung zwischen den Schwesterpaaren ab. Des Weiteren konnten wir nachweisen, dass wenn Zellen zur Anaphase voranschreiten ihre Metaphasenplatten wegen einer voranschreitenden Verringerung der Oszillationsgeschwindigkeit dünner werden, was auch eine Folge der Starrheit der Verbindung zu sein scheint. Wir folgern daraus, dass die Bildung und Verdünnung der Metaphasenplatte direkt von einer rigorosen Kontrolle des Zustandes der mechanischen Verbindung zwischen den Schwestern abhängig ist. Mit Hilfe des etablierten Kinetochor-Tracking-Assays suchten wir anschliessend Kinetochorproteine, welche für die Kontrolle der Mikrotubuli Dynamik und der Chromosomen-Oszillationen während der Metaphase unabdingbar sind. Bemerkenswerterweise fanden wir, dass der zentromere Nukleosom-assoziierte Komplex CENP-A NAC/CAD, von welchem angenommen wurde, dass er nur als 3

6 strukturelles Gerüst innerhalb der Kinetochore fungiert, für solche regelmässigen Bewegungen essentiell ist. Zellen ohne diesen Komplex können nicht alle Chromosomen in einer Metaphasen-Platte versammeln, was die Wichtigkeit der Oszillation für die Organisation zeigt. Wir wiesen nach, dass CENP-A NAC/CAD diese Effekte durch die Regulation des Mikrotubuli Plus-End Tubulin Turnovers vermittelt. Des Weiteren zeigten wir, wie sich die Stöchiometrie von CENP-A NAC/CAD an einzelnen Schwester- Kinetochoren dynamisch verändert, wenn die daran gebundenen Mikrotubuli in vivo vom Wachstum zum Schrumpfen wechseln, und dass mindestens eine CENP-A NAC/CAD Untereinheit in vitro an Mikrotubuli binden kann. Demzufolge schlagen wir vor, dass CENP-A NAC/CAD die Mikrotubuli Plus-Enden innerhalb eines Kinetochores direkt reguliert, und dass die asymmetrische Verteilung der einzelnen Proteine ein Teil eines Feedback-Mechanismus ist, welcher für die Oszillation der Chromosomen in der Mitose erforderlich ist. 4