Wolfgang Schumann. Biologie bakterieller Plasmide

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1 Wolfgang Schumann Biologie bakterieller Plasmide

2 ,.----Aus dem Programm Biochemie I Biologie Die Zelle von A. Berkaloff, J. Bourguet, P. Farvard, N. Farvard und J.-C. Lacroix Biochemie - ein Einstieg von H. Kindl Arzneistoffe von W. Schumack, K. Mayer und M. Haake Biogene Arzneistoffe von F. C. Czygan (Hrsg.) Pharmazeutische Biologie von E. Teuscher Pestizide und Umweltschutz von G. H. Schmidt Chemie und Umwelt von A. Heintz und G. Reinhardt Analytische Verfahren in der Biotechnologie von K. Schügerl (Hrsg.) Analytische und präparative Labormethoden Grundlegende Arbeitstechniken für Chemiker, Biochemiker, Mediziner, Pharmazeuten und Biologen von K. E. Geckeier und H. Eckstein Vieweg ,

3 Wolfgang Schumann BIOLOGIE BAKTERIELLER PLASMIDE Mit 63 Abbildungen und 16 Tabellen II Vleweg

4 Prof. Dr. Wolfgang Schurnano Lehrstuhl für Genetik Universität Bayreuth Postfach Bayreuth Das vorliegende Werk wurde sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autor und Verlag für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler keine Haftung. Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Buch berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, daß solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Warenschutzgesetzgebung als frei zu betrachten wären und daher von jedermann benutzt werden dürfen. Der Verlag Vieweg ist ein Unternehmen der Verlagsgruppe Bertelsmann International. Alle Rechte vorbehalten Springer Fachmedien Wiesbaden 1990 Ursprünglich erschienen bei Friedr. Vieweg & Sohn Verlagsgesellschaft mbh, Braunschweig 1990 Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung außerhalb der engen Grenzen des Urheberrechtsgesetzes ist ohne Zustimmung des Verlags unzulässig und strafbar. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen. ISBN ISBN (ebook) DOI /

5 V Vorwort Die Entdeckung des F-Faktors, der R-Faktoren und der colicinogenen Faktoren als extrachromosomale DNA-Moleküle bei E. coli in den 50er Jahren wurde zunächst als Besonderheit bei einigen wenigen Stämmen angesehen. In den 60er Jahren wurden Plasmide dann als Modell-Systeme zur Erforschung grundlegender molekulargenetischer Prozesse, wie z.b. der Replikation und der Rekombination entdeckt. Nach der Einfiihrung der Gentechnik sind Plasmide seit Mitte der 70er Jahre zu unverzichtbaren Vektoren bei der Klonierung, Sequenzierung und Genexpression von beliebigen DNA-Fragmenten geworden. Seit etwa Ende der 70er Jahre steht neben der gentechnischen Anwendung die Erforschung der Plasmid-Biologie im Vordergrund. Fast wöchentlich erscheinen Publikationen über neu-entdeckte Plasmide mit neuen Eigenschaften, und bei bereits bekannten Plasmiden werden immer mehr Details über ihren molekularen Aufbau bekannt. Daher ist es schwierig, wenn nicht unmöglich, auf dem gesamten Gebiet der Plasmid-Biologie up-to-date zu sein. Dieser Umstand hat mich lange zögern lassen, ein Lehrbuch über Plasmide zu schreiben. Aber mit diesem Problem hat jeder Autor zu kämpfen, der heutzutage ein Lehrbuch aus dem Bereich der Molekularen Biologie in Angriff nimmt. Erste Überlegungen zur Abfassung dieses Lehrbuchs stammen aus dem Jahr 1983, als ich mir bei meinem Kollegen R. Knippers von der Universität Konstanz Rat holte. Er hat mich damals zu diesem Projekt ausdrücklich ermuntert. Dann vergingen aber weitere fiinf Jahre, bis ich mich an den Computer gesetzt habe, um das vorliegende Buch, ausgehend von Vorlesungsnotizen, niederzuschreiben. Den größten Teil des Manuskripts habe ich in der Zeit von Mai 1988 bis Mai 1989 verfaßt, wobei ich versucht habe, die bis Mai 1989 verfiigbaren Daten mit einzubeziehen, um bei Erscheinen die Aktualität zu wahren. Die Auswahl des Stoffes ist, wie immer bei einem Lehrbuch, subjektiv, ich hoffe aber, die wichtigsten Eigenschaften der Plasmide dargestellt zu haben. Für Anregungen und Verbesserungswünsche bin ich jedoch dankbar, um sie in der nächsten Auflage berücksichtigen zu können. Zum Abschluß möchte ich dem Verlag, insbesondere seinem Lektor, Herrn Björn Gondesen, fiir die fruchtbare Zusammenarbeit, die zur Realisierung dieses Projekts gefiihrt hat, danken. Mein besonderer Dank gilt meiner Frau Christa Schumann, die alle Abbildu~~en in diesem Lehrbuch angefertigt hat und dabei geduldig auf meine vielen Anderungswünsche eingegangen ist. Bayreuth, im Dezember 1989 Wolfgang Schumann

6 VI Inhaltsverzeichnis 1 Einführung Klassifizierung von Plasmiden Warum wird mit und über Plasmide geforscht?... 4 Literatur Wichtige Methoden beim Arbeiten mit Plasmiden Nachweis eines Plasmids Literatur Präparalive Isolierung von Plasmid-DNA Charakterisierung eines Plasmids Kurieren eines Plasmids Interkalierende Farbstoffe Coumermycin und Novabioein Rifampicin und Mitomycin Natriumdodecylsulfat Weitere Methoden Literatur Bestimmung der Kopienzahl eines Plasmids CsCl-Ethidiumbromid-Zentrifugation radioaktiv markierter DNA Agarosegel-Elektrophorese Hybridisierung Sandwich-Hybridisierung Literatur Isolierung von Plasmid-Mutanten mit veränderter Kopienzahl Mutagenese von Plasmiden Transposon-Mutagenese In-vivo-Mutagenese mit Nitrosoguanidin In-vitro-Mutagenese mit Hydroxylamin Deletions- und Insertions-Mutagenese mit Hilfe von Restriktionsenzymen Sequenzspezifische Mutagenese Nachweis Plasmid-codierter Proteine Literatur Konjugation Konjugation bei Gram-negativen Bakterien F-Faktor-vermittelte Konjugation Entdeckung des F-Faktors Integration/Exzision des F-Faktors Aufbau des F-Faktors Die Transfer-Region

7 Inhaltsverzeichnis VII Genetische Regulation des tra-operons Biosynthese des F-Pilus Stabilisierung der Paarungspartner Oberflächen-Ausschluß DNA-Transfer Literatur Weitere konjugative Plasmide bei Gram-negativen Bakterien Konjugation bei Gram-positiven Bakterien Konjugation bei Streptococcen Plasmid-gekoppelter Transfer bei Streptococcus Literatur Konjugative Transposons Konjugation bei Staphylococcus Konjugation bei Streptomyceten Genetischer Austausch zwischen Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien Mobilisierung Mobilisierung des Plasmids ColEl Mobilisierung des Plasmids pbr Mobilisierung des Plasmids pc Artifizielle Mobilisierungssysteme bei Gram-negativen Bakterien Replikation Kartierung und Isolierung eines ori Replikation des Plasmids ColEl.. ; Allgemeine Informationen zur Replikation von ColEl Initiation der Replikation Elongation der Replikation Termination der Replikation Replikation des Plasmids psc Replikation des Plasmids R6K Replikation des F-Faktors RepFIA, das primäre Replicon RepFIB, das sekundäre Replicon RepFIC, ein defektes Replicon Replikation von Staphylococcus-Plasmiden Literatur Kontrolle der Kopienzahl Wird jedes Plasmid einmal pro Generation repliziert? Inhibitor-Target-Strategie Beispiel ColEl Beispiel Rl Beispiel pt

8 VIII Inhaltsverzeichnis 6.3 Heron-Strategie Beispiel F-Faktor Beispiel R6K Literatur Mechanismen der stabilen Vererbung von Plasmiden Der par-locus bei psc Stabilisierung des F-Faktors Stabilisierung des R-Faktors R Stabilisierung des R-Faktors R Inkompatibilität Modellvorstellungen zum Mechanismus der Inkompatibilität Inkompatibilität bei Plasmiden, deren Kopienzahl nach der Inhibitor Target-Strategie kontrolliert wird Inkompatibilität bei Plasmiden, deren Kopienzahl nach der Heron-Strategie kontrolliert wird Plasmide mit weitem Wirtsbereich Das Plasmid RP Der Wirtsbereich Genetischer Aufbau Analyse der Tra-Funktionen Kontrolle der Replikation Literatur Das Plasmid RSF Literatur Lineare Plasmide Isolierung linearer Plasmide Charakterisierung der Plasmide Charakterisierung der kovalenten Bindung zwischen Plasmid- DNA und Protein Literatur Weitere Plasmid-inhärente Eigenschaften oooo o o oo Stabilisierung von Plasmiden durch sequenzspezifische Rekombination... o Literatur... o oo o o 0 o. o o o o o o o 106 1~.2 I!ltegrative Suppression Ltteratur o o o 0 o Shufflons o 0 o Sequenzspezifische Integration konjugativer Streptomyces- Plasmide o Hemmung des konjugativen Transfers o oooo o o o oo 110 Literatur... 0 o oo oo oo o 0 o o o o ooo oo.o. 0 o. o oo 111

9 Inhaltsverzeichnis IX 11.6 Hemmung der Aktivierung des RecA-Proteins Literatur Synthese linearer Plasmid-Multimere Literatur Baderioein-codierende Plasmide Nachweis eines Bacteriocins Qualitativer Nachweis Quantitativer Nachweis Verbreitung der Bacteriocine Produktion und Freisetzung der Colicine Interaktion der Colicine mit der Target-Zelle Physiologische Wirkung der Colicine Insensitivität gegenüber Colicinen Organisation der Colicin-Immunitäts-Lyse-Region bei einigen colicinogenen Plasmiden Microcine Literatur Ti-Piasmide Entdeckung der Ti-Plasmide Struktur der Ti-Plasmide Aufbau der T-DNA Die Virulenz-Gene Transfer der T-DNA Am Transfer beteiligte Komponenten Mechanismus des Transfers Ri-Plasmide Literatur Degradative Plasmide Abbau von Aromaten Abbau von heterocyklischen Verbindungen Degradative Plasmide TOL-Plasmide NAH-Plasmide ,4-D-Plasmide Literatur Medizinisch relevante Plasmide Kolonisierungsfaktoren Invasine Literatur Cytotoxine Enterotoxine Physiologische Faktoren Literatur

10 X Inhaltsverzeichnis 16 Plasmid-codierte Antibiotika-Resistenzen Transposons Umstrukturierungen von R-Plasmiden Strategien der Antibiotikum-Resistenz Inaktivierung des Antibiotikums Resistenz gegen ß-Lactam-Antibiotika :1.2 Resistenz gegen Chloramphenicol Resistenz gegen Aminoglycosid-Antibiotika Änderung der Angriffsstelle des Antibiotikums Herabgesetzte Akkumulierung des Antibiotikums Bypass-Mechanismus Resistenz geget1 Sulfonamide Resistenz gegen Trimethoprim Literatur Plasmid-codierte Schwermetaii-Resistenzen Resistenz gegen Quecksilber und organische Quecksilberverbindungen Resistenz gegen Arsen und Antimon Resistenz gegen Tellur Resistenz gegen Cadmium Resistenz gegen Kupfer Resistenz gegen Silber Weitere Schwermetall-Resistenzen Literatur Weitere Plasmid-codierte Eigenschaften Sym-Plasmide bei Rhizobien Restriktions- und Modifikationssysteme Plasmid-codierte Resistenz gegen DNA-Schäden BT-Toxine Literatur Evolution der Plasmide Möglichkeiten der Entstehung autonom replizierender Plasmide Das Problem der Stabilität Horizontaler Transfer von Plasmiden Phänotypische Funktionen Verwandtschaft der Plasmide untereinander Glossar Anhang Liste der natürlich vorkommenden Plasmide, deren Totalsequenz ermittelt wurde Namen- und Sachwortverzeichnis