MegaBLOT IgG BORRELIA canis ad us. vet.

Transkript

1 MegaBLOT IgG BORRELIA canis ad us. vet. Immunoblot zum qualitativen Nachweis von IgG-Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi sensu lato (B. b. sensu stricto, afzelii und garinii) im Plasma oder Serum des Hundes In vitro Diagnostikum GEBRAUCHSINFORMATION Immunoblot for the qualitative detection of IgG antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato (B. b. sensu stricto, afzelii and garinii) in plasma or serum of the dog In vitro diagnosticum INSTRUCTIONS FOR USE Hersteller / Manufacturer: Lochauer Str. 2 A-6912 Hörbranz AUSTRIA (+43) (+43) info@megacor.at Version 07/2015

2 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Seite 2 1. EINLEITUNG Die Borreliose, eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit des Hundes sowie anderer Tierarten und des Menschen, wird von der Spezies Borrelia burgdorferi sensu lato (B. b. s. l. Genospezies B. b. sensu stricto, B. garinii, B. afzelii) verursacht. Die die Borrelien übertragenden Zecken (Ixodes ricinus, Gemeiner Holzbock) sind bis zu 30 % mit Borrelien infiziert. Die Antikörperprävalenz korreliert bei Hunden in endemischen Gebieten (z. T. bis zu 95 %) mit der Haltung, der Zeit, die die Hunde im Freien verbringen und der Saugdauer der Zecken. Die definitive Diagnose Lyme-Borreliose gestaltet sich in der Praxis häufig schwierig, da diese nur durch eine analytische Betrachtung umfangreicher Informationen wie Krankheitsgeschichte, klinische Symptome (z. B. Lethargie, Abgeschlagenheit, Fieber, geschwollene Lymphknoten, wechselnde Lahmheit, Arthritis und neurologische Ausfallserscheinungen) und v. a. durch Labordiagnostik zu stellen ist. Wichtig für eine erfolgreiche Therapie ist das frühzeitige Erkennen infektionsbedingter Symptome, die etwa zwei bis fünf Monate nach Zeckenexposition einsetzen. Ein Antikörpernachweis (IgM vor IgG) gelingt frühestens 4 6 Wochen nach Exposition, nach ca. 3 Monaten ist die Antikörperkonzentration am höchsten. Den klinischen Symptomen Lahmheit und Fieber geht fast immer ein Titeranstieg (Serokonversion) voraus. Damit kann ein negativer Test bei einem Tier mit klinischen Symptomen eine akute Borreliose ausschließen. Bei der Antikörperbestimmung gilt die Zwei-Stufen-Diagnostik als Mittel der Wahl. Zunächst wird ein IgM / IgG-Antikörper-Screening-Test wie Schnelltest (ICT), ELISA und / oder IFA durchgeführt. Da falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse nicht auszuschließen sind, sollte ein positives Ergebnis oder ein unklares negatives Ergebnis durch einen Immunoblot-Bestätigungstest wie den MegaBLOT IgG BORRELIA canis (2. Stufe der Borrelien-Diagnostik) abgesichert werden. Die serologische IgM- / IgG-Antwort auf eine Borrelien-Infektion kann von mannigfaltigen Kriterien wie Alter, Immunstatus, Infektionsgrad mit der jeweiligen Borrellien- Genospezies und / oder kreuzreagierenden Erregern (v. a. Spirochäten), Zeitpunkt der labordiagnostischen Untersuchung, Behandlung mit Glucocorticoiden etc. abhängen. Hierbei erweist sich der MegaBLOT IgG BORRELIA canis als die Methode der Wahl, um eine abschließende Befundung über den tatsächlichen Borreliosestatus des Tieres zu erhalten. 2. VERWENDUNGSZWECK Der MegaBLOT IgG BORRELIA canis ist ein qualitativer Immunoblot zum Nachweis spezifischer IgG-Antikörper gegen Borrelia burgdorferi sensu lato im Plasma oder Serum des Hundes.

3 Seite 3 MegaBLOT IgG BORRELIA canis 3. TESTPRINZIP Proteine aus Borrelia garinii wurden elektrophoretisch gemäß ihrem Molekulargewicht mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt. Anschließend wurden die Proteinbanden auf eine PVDF-Membran übertragen, unspezifische Bindungsstellen blockiert und die Membran in gebrauchsfertige Streifen geschnitten. Verdünnte Hundeseren oder -plasma werden mit den Westernblot-Streifen inkubiert. Sind borrelienspezifische IgG-Antikörper vorhanden, binden diese an ihre auf der Membran fixierten Ziel-Antigene. Nach einem Waschschritt werden Anti-Hund-IgG-Antikörper, die an Meerrettichperoxidase gekoppelt sind, zugegeben. Am Ende der zweiten Inkubation wird nicht-gebundenes Konjugat durch Waschen entfernt. Gebundenes Konjugat wird durch die Zugabe eines chromogenen Substrats sichtbar gemacht. Nach dem Trocknen können die gefärbten Antigenbanden anhand der mitgelieferten kit-spezifischen Schablone mit definierten Borrelia-Antigenen verglichen werden. 4. TESTKITKOMPONENTEN 4.1. MITGELIEFERTE TESTKITKOMPONENTEN / REAGENZIEN Die Reagenzien einer Packung reichen für 10 Bestimmungen. 1. Borrelia garinii Antigen-Streifen (IgG, 1 Röhrchen mit 10 fortlaufend nummerierten Westernblot-Streifen), beschichtet mit Borrelia garinii-antigenen 2. Schablone (1 vorentwickelter Kontroll-Westernblot-Streifen, kit-spezifisch) ml Probenverdünnungspuffer (PVP, Phosphatpuffer mit Stabilisatoren, ph 7,2 ± 0,2, gelb gefärbt, enthält 0,1 % Kathon), gebrauchsfertig, weiße Kappe ml Waschpuffer (20 Puffer, ph 7,2 ± 0,2, enthält nach Verdünnung 0,1 % Bronidox L), weiße Kappe ml Konjugat (Peroxidase-konjugierte Anti-Hund-IgG-Antikörper, rot gefärbt, enthält 0,2 % Bronidox L), gebrauchsfertig, schwarze Kappe ml Substrat (3,3,5,5 -Tetramethylbenzidin [TMB]/ Wasserstoffperoxid), gebrauchsfertig, blaue Kappe. Nicht dem direkten Sonnenlicht aussetzen! 7. 1 Test-Protokoll 8. 1 Ergebnisblatt 9. 2 Inkubationswannen Gebrauchsinformation 4.2. ERFORDERLICHE, NICHT MITGELIEFERTE REAGENZIEN / ZUBEHÖR Destilliertes oder deionisiertes Wasser Einmal-Probenröhrchen Laborpipette ( µl, 1 ml) Vortex-Mixer Vakuum-Saugpumpe mit Desinfektionsfalle

4 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Seite 4 Filterpapier / Labortücher Kippschüttler Kunststoff-Pinzette für die Westernblot-Streifen Messzylinder (1000 ml) Stoppuhr Abfallbehälter mit einer 0,5%-igen Hypochloritlösung 5. HALTBARKEIT UND LAGERUNG 2 8 C Lagerung 2 8 C Verwendbar bis siehe Etikett Für den tierärztlichen Gebrauch In vitro Diagnostikum Gebrauchsinformation genau beachten LOT! Chargen-Bezeichnung Keine Reagenzien verschiedener Testkits, Chargennummern oder mit abgelaufenem Verfallsdatum verwenden. Der verdünnte Waschpuffer ist bei einer Lagerung von 2 8 C 5 Wochen haltbar. Mikrobielle Kontamination ist zu vermeiden. Nach Erreichen des Verfallsdatums kann keine Qualitätsgarantie mehr übernommen werden. Die benötigte Anzahl an Westernblot-Streifen entnehmen, die restlichen sofort wieder in das Röhrchen geben, verschließen und bei 2 8 C lagern. Eine direkte Lichteinwirkung auf das farblose bis blassgelbe Substrat ist unbedingt zu vermeiden, um einer Zersetzung bzw. Blaufärbung durch Autooxidation vorzubeugen. Bei aufgetretener Blaufärbung kann das Substrat nicht mehr verwendet werden (Funktionsunfähigkeit)! 6. INFORMATIONEN ZUM PROBENMATERIAL Nur Hunde-Plasma oder Serum verwenden! Das Probenmaterial vor der Verwendung gut homogenisieren! Ungekühlt (20 25 C) sollte das Plasma oder Serum innerhalb von 4 Stunden getestet werden! Bei 2 8 C kann das Plasma oder Serum bis max. 5 Tage gelagert werden. Plasma- oder Serumproben können aliquotiert und dauerhaft bei mindestens 20 C aufbewahrt werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Nicht hitze-inaktivieren!

5 Seite 5 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Beachten Sie, dass das Probenmaterial, ebenso wie alle verwendeten Testkitkomponenten, zum Zeitpunkt der Anwendung Raumtemperatur haben sollte. ACHTUNG: Unvollständig gefüllte und / oder unzureichend durchmischte EDTA-, Citrat- oder Heparinröhrchen können Störeffekte verursachen, die zu unterschiedlichen Testergebnissen führen können. 7. TESTVORBEREITUNG Gebrauchsinformation vor Durchführung des Tests sorgfältig lesen. Für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist es notwendig, die Gebrauchsinformation genau zu befolgen. Den Test in der angegebenen Reihenfolge und ohne Verzögerung!durchführen. Für jeden Pipettierschritt saubere Einmalspitzen verwenden ALLGEMEINES Die benötigte Menge an Westernblot-Streifen erst nach Erreichen der Raumtemperatur mithilfe einer Kunststoff-Pipette dem Röhrchen entnehmen. Die Reagenzien sind unmittelbar vor ihrer Verwendung gut zu vermischen. Nach Gebrauch der Pipettenspitzen sind diese zu verwerfen und eine neue Spitze einzusetzen. Nach Gebrauch sind sowohl die nicht verwendeten Westernblot-Streifen (im verschlossenen Röhrchen) als auch die Reagenzien wieder bei 2 8 C zu lagern. Einmal benutzte Westernblot-Streifen dürfen nicht wiederverwendet werden. Beschädigte Testkitkomponenten dürfen nicht verwendet werden. Ein direkter Kontakt von Proben mit den Testkitkomponenten ist zu vermeiden (Kreuzkontamination). Direkte Sonneneinstrahlung während der Testdurchführung vermeiden HERSTELLUNG DES WASCHPUFFERS 1:20 1 Teil des Waschpufferkonzentrates wird mit 19 Teilen destilliertem Wasser gemischt, z. B. 10 ml Waschpuffer mit 190 ml Wasser. Sollten im Waschpufferkonzentrat Kristalle zu sehen sein, lösen Sie diese durch Erwärmen des Waschpufferkonzentrates im Wasserbad bei 37 C auf. Der verdünnte Puffer ist bei Raumtemperatur (20 25 C) 5 Tage haltbar PROBENVORBEREITUNG / PROBENVERDÜNNUNG Geben Sie 1,2 ml (1200 µl) MegaBLOT IgG BORRELIA canis Probenverdünnungspuffer (PVP) in ein gekennzeichnetes Einmal-Probenröhrchen! Geben Sie 12 µl Probe in den PVP. Homogenisieren Sie die Proben-Puffer-Mischung (PPM) gut (mehrmaliges Mischen mit der Pipette oder auf einem Vortex-Mixer).

6 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Seite 6 8. TESTDURCHFÜHRUNG Probenmaterial vor der Verwendung gut homogenisieren! 8.1. PROBENAUFTRAG UND ERSTE INKUBATION Anzahl an benötigten Westernblot-Streifen in die einzelnen Rinnen der Inkubationswanne geben. 1,2 ml verdünntes Hundeplasma / -serum in die entsprechende Rinne der Inkubationswanne pipettieren. Alle Streifen müssen vollständig untergetaucht sein. Wenn nötig, die Wanne sanft schütteln oder die Streifen mit einer sauberen Pipettenspitze vorsichtig in die Lösung schieben. Die Nummerierung muss nach oben zeigen, da auf dieser Seite die Antigene gebunden sind. Inkubieren Sie für 60 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) unter leichtem Schwenken WASCHEN SORGFÄLTIG und STRIKT NACH ANLEITUNG! Flüssigkeit aus jeder Rinne sorgfältig absaugen. Entsorgen Sie das Inkubat durch Ausleeren in einen Abfallbehälter mit Hypochlorit. Gemäß den behördlichen Vorschriften entsorgen! Geben Sie 1 ml Waschpuffer pro Rinne zu. Auf dem Kippschüttler für 5 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubieren. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal ZWEITE INKUBATION Geben Sie je 1 ml Konjugat in jede Rinne der Inkubationswanne. Inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) unter leichtem Schwenken WASCHEN Waschen wie in Punkt DRITTE INKUBATION Geben Sie 1 ml Substrat (TMB) in jede Rinne. Inkubieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) und unter Beobachtung unter leichtem Schwenken. Achtung: Nicht überentwickeln! Bei einigen Serum- / Plasmaproben kann sich der Hintergrund der Streifen sehr schnell blau färben. In diesem Fall ist die Farbreaktion vorzeitig durch Spülen mit deionisiertem Wasser zu stoppen STOPPEN DER REAKTION Reaktion durch Absaugen der Flüssigkeit abstoppen und jeden Streifen mit 1 ml deionisiertem Wasser waschen. Westernblot-Streifen 5 Minuten unter Schütteln inkubieren, Wasser absaugen und den Waschschritt wiederholen. Streifen aus der Inkubationswanne nehmen und mit der Nummerierung nach oben auf Filterpapier trocknen (ewta 30 Minuten bei Raumtemperatur). Um ein Ausbleichen zu verhindern, sollten die Streifen vor Licht geschützt werden.

7 Seite 7 MegaBLOT IgG BORRELIA canis 9. TESTAUSWERTUNG 9.1. AUSWERTUNG DER TESTERGEBNISSE Nach dem Trocknen Westernblot-Streifen mit durchsichtigem Klebeband auf das Ergebnisblatt kleben. Der MegaBLOT IgG BORRELIA canis enthält eine Schablone in Form eines bereits entwickelten Westernblot-Streifens. Er stammt aus derselben Membrancharge, die zur Herstellung der im Testkit enthaltenen Westernblot-Streifen verwendet wurde, ist also kit-spezifisch. Er wurde mit einem positiven Kontrollserum inkubiert, um Lyme-Borreliose-repräsentative Banden anzuzeigen. Korrespondierende Proteinbanden sind rechts neben der Schablone aufgelistet. Zur Probenauswertung wird die kit-spezifische Schablone herangezogen. Dazu muss die Index-Linie der Schablone exakt an die horizontale Linie am unteren Rand des Westernblot-Streifens angelegt werden. Als Reaktionskontrolle ist am oberen Rand des Streifens canines IgG aufgetragen, welches durch eine intensive Farbreaktion eine ordnungsgemäße Testdurchführung anzeigt. Zur Bewertung der Probe wird die jeweilige Reaktivität / Farbintensität folgender Banden bestimmt: p100 (93 kda), p58 (58 kda), Flagellin (41 kda), BmpA (39 kda), OspA (32.5 kda), OspC (22 23 kda) und p18 (18 kda) SPEZIFITÄT DER ANTIGEN-BANDEN Bande Borrelienantigene und ihre diagnostische Relevanz p100 (93 kda) hochspezifischer Marker im Verlauf chronischer Borreliose-Infektionsstadien 75 kda spezifischer Marker, wahrscheinlich zur bakteriellen DNA gehörend kda Hitzeschock-Proteine, nicht spezifisch für Borrelien-Infektionen, häufig auch bei anderen Infektionen; kein diagnostischer Nutzen 66 kda Spezies-abhängiger, aber spezifischer Marker für Borrelien-Infektionen 60 kda verbreitetes bakterielles Antigen, nicht spezifisch; kein diagnostischer Nutzen 58 kda Spezies-abhängiger, aber infektionsspezifischer Marker Infektionen mit starkem Antigenkontakt (häufig in Kombination mit p18) nach Impfungen sehr häufig (relativ impfspezifischer Marker) Flagellin (41 kda) Flagellin-Protein alle Infektionsstadien Kreuzreaktion mit anderen Spirochäten

8 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Seite 8 Bande BmpA (39 kda) Borrelienantigene und ihre diagnostische Relevanz hochspezifisches Membranprotein A alle Infektionsstadien 37 kda gilt als früher Infektionsmarker, Spezifität allerdings nicht gesichert OspA (32.5 kda) OspC (22 23 kda) hochspezifisches Oberflächenprotein A nach Infektion; selten, in späten Stadien, wenig intensiv (stärker bei multiplen Antigenkontakten) nach Impfung: früh, sehr intensiv und lang anhaltend hochspezifisches Oberflächenprotein C nach Infektion: meist früh (wichtiger IgM-Marker), aber auch später gelegentlich nach Impfungen (frühes und kurzzeitiges Auftreten) 18 kda hochspezifischer Marker späte Infektionsstadien (v. a. bei hochgradig positiven Seren) Hundeseren können zusätzlich weitere Banden zu den oben erwähnten aufweisen. Solche Banden dürfen nicht in die Testinterpretation einfließen! 9.3. BEWERTUNG DER ANTIGEN-BANDEN Vor der Bewertung der Banden müssen folgende Aspekte berücksichtigt werden: 1. Ist das Tier häufig Zeckenbissen ausgesetzt? In diesem Fall kann der Blot auch in Abwesenheit einer akuten Infektion spezifische Banden aufweisen. Andere serologische Tests werden wahrscheinlich positiv sein, und eine komplette Analyse der Westernblot-Banden ist erforderlich, um zwischen einer früheren Exposition und einer laufenden Infektion zu unterscheiden. Im Gegensatz dazu werden negative Seren von Hunden, die keinen Zeckenbissen ausgesetzt sind, nur sehr wenige Banden im Immunoblot zeigen (häufigste Banden: 60 kda, 41 kda). 2. Deutet das klinische Erscheinungsbild auf eine akute Borreliose hin? In Abwesenheit von Fieber und / oder Lahmheit kann eine Differenzierung zwischen einem vorausgegangenen Kontakt und einer gerade ablaufenden Infektion äußerst schwierig sein. 3. Gesamtbild des Streifens: Ein positives Ergebnis entspricht einem Streifen mit mehreren sauberen, darunter einigen stark gefärbten Banden. Positive Blots ähneln dem Kontrollstreifen auf der mitgelieferten Schablone. WICHTIG: Nur solche Banden dürfen in die Bewertung einbezogen werden, deren Farbintensitäten mindestens der jeweilig zugehörigen Bande auf dem kit-spezifischen Kontrollstreifen (Schablone) entsprechen.

9 Seite 9 MegaBLOT IgG BORRELIA canis 9.4. PUNKTEBEWERTUNG IMMUNODOMINANTER BORRELIEN-ANTIGENE Borrelienantigen Molekulargewicht (kda) Punkte IgG p p Flagellin 41 1 BmpA 39 5 OspA OspC p Addieren Sie die Punkte für jede Patientenprobe und bewerten Sie wie folgt: 1. Das Blotergebnis kann aufgrund einer einzigen reaktiven Bande nicht als positiv betrachtet werden. 2. Ist nur eine der folgenden Banden p100, p39, OspC oder p18 ausgebildet, sollte nach 2 3 Wochen eine neu abgenommene Probe mittels MegaBLOT IgG BORRE- LIA canis untersucht werden. 3. Sobald mindestens zwei der Banden p100, p39, OspC oder p18 sichtbar sind, ist die Probe als positiv zu bewerten. Die Wahrscheinlichkeit einer Borrelien-Feldinfektion liegt bei > 95 %. 4. Es gibt keine klassischen Impf- oder Infektionsbanden, sondern nur Banden, die nach Impfungen stärker reagieren als nach Infektionen (z.b. OspA). Summe der Punkte Bewertung IgG < 5 negativ 5 7 fraglich 8 positiv 10. EINSCHRÄNKUNGEN DES TESTS Die Abwesenheit von Antikörpern gegen Borrelien-Antigene im MegaBLOT IgG BORRELIA canis kann eine Borrelien-Infektion nicht in jedem Fall ausschließen. In der Frühphase der Infektion können Antikörper noch nicht oder in nicht detektierbarer Menge vorhanden sein. Ebenso kann eine Antibiotika-Therapie im Frühstadium der Infektion die Antikörperbildung supprimieren. Die Anwesenheit von IgG-Antikörpern gegen Borrelien-Antigene im MegaBLOT IgG BORRELIA canis muss nicht zwingend eine akute Infektion anzeigen, da IgG- Antikörper-Titer einer früheren Infektion u. U. über Monate persistieren.

10 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Seite 10 Eine Interpretation des Testergebnisses sollte nur in enger Verbindung mit den klinischen Befunden (Impfpass!) erfolgen. Bei unklaren oder fraglichen Testergebnissen sind Wiederholungsuntersuchungen in 2 3 wöchigem Abstand anzuraten. 11. SICHERHEITSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE Tragen von Schutzkleidung (Einmal-Handschuhe) und Händewaschen nach Ende der Testdurchführung. Essen und Trinken während der Testdurchführung verboten. Das Probenmaterial muss als potentiell infektiös angesehen werden und ist mit den verwendeten Testkitkomponenten nach der Testdurchführung fachgemäß zu entsorgen. Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit den Reagenzien dieses Testkits verwenden. Keine Reagenzien unterschiedlicher Chargen zusammen verwenden. Verschlusskappen der einzelnen Reagenzien nicht untereinander vertauschen. Flaschen nach Gebrauch sofort fest verschließen, um Verdunstung und mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Nach dem ersten Öffnen Reagenzien-Fläschchen vor weiterem Gebrauch auf mikrobielle Kontamination prüfen. Probenverdünnungspuffer enthält Kathon als Konservierungsmittel. Substratlösung enthält Wasserstoffperoxid. Eine Berührung mit der Haut oder Schleimhaut ist unbedingt zu vermeiden! Waschpuffer und Konjugat enthalten Bronidox L als Konservierungsmittel. In der verwendeten Konzentration besitzt Bronidox L kaum toxikologische Risiken bei Kontakt mit Haut und Schleimhäuten. ACHTUNG: Flüssigabfall, der Stopp-Reagenz enthält, muss zuerst neutralisiert werden, bevor er in eine Hypochloritlösung gegeben wird! Nur saubere Pipettenspitzen, Dispenser und Labormaterialien verwenden. Niemals mit dem Mund pipettieren! Beschriften Sie Probenmaterial und zugehöriges Probenröhrchen, damit die exakte Zuordnung gewährleistet ist. Für jede Probe ein neues Probenröhrchen verwenden. Westernblot-Streifen vorsichtig mit einer Kunststoff-Pinzette handhaben. Während der Inkubations- und Waschschritte müssen die Rinnen vollständig mit Flüssigkeit bedeckt sein. Zur Vermeidung von Kreuzkontamination und falschen Testergebnissen Patientenproben und Konjugat sorgfältig in die Rinnen pipettieren. Der MegaBLOT IgG BORRELIA canis ist nur für die Anwendung durch Fachpersonal vorgesehen, das die Arbeitstechniken einwandfrei beherrscht.

11 Seite 11 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Die Testdurchführung, die Information, die Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise in der Gebrauchsanweisung sind strikt zu befolgen. Bei Anwendung des Testkits auf Diagnostika-Geräten ist die Testmethode zu validieren. Jede Änderung am Aussehen, der Zusammensetzung und der Testdurchführung sowie jede Verwendung in Kombination mit anderen Produkten, die der Hersteller nicht autorisiert hat, ist nicht zulässig; der Anwender ist für solche Änderungen selbst verantwortlich. Der Hersteller haftet nicht für falsche Ergebnisse und Vorkommnissse, die mit diesen Gründen in Zusammenhang stehen. Auch für falsche Ergebnisse aufgrund visueller Auswertung wird keine Haftung übernommen. 12. HAFTUNG Das gesamte Haftungsrisiko im Zusammenhang mit der Verwendung dieses Produktes liegt beim Käufer. Der Hersteller übernimmt keine Haftung für indirekte, spezielle oder daraus folgende Schäden jeglicher Art, die aus der Benutzung, Testdurchführung und -auswertung dieses Produktes resultieren.

12 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Seite KURZ-PROTOKOLL MegaBLOT IgG BORRELIA canis TESTVORBEREITUNG Benötigte Westernblot-Streifen und Reagenzien auf Raumtemperatur (20 25 C) bringen. Waschpuffer 1:20 mit destilliertem Wasser verdünnen. Proben mit Probenverdünnungspuffer verdünnen (12 µl Probe µl PVP) TESTDURCHFÜHRUNG 1200 µl der verdünnten Plasma- oder Serumproben in je eine Rinne pipettieren. 60 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) unter leichtem Schwenken inkubieren. 3 unter leichtem Schwenken mit je 1 ml 1 Waschpuffer waschen. Je 1 ml Konjugat in jede Rinne pipettieren. 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) unter leichtem Schwenken inkubieren. 3 unter leichtem Schwenken mit je 1 ml 1 Waschpuffer waschen. 1 ml Substrat (TMB) in jede Rinne pipettieren. 10 Minuten bei Raumtemperatur (20 25 C) inkubieren. Beobachten. Durch Spülen mit deionisiertem Wasser stoppen. Evaluation im Vergleich zur Schablone.

13 Page 13 MegaBLOT IgG BORRELIA canis 1. INTRODUCTION Borreliosis caused by the borrelia species Borrelia burgdorferi sensu lato (B. b. s. l., genospecies B. b. sensu stricto, B. garinii, B. afzelii) is a world-wide spread infectious disease in dogs, other animals and in humans. Borrelia transmitting ticks (Ixodes ricinus, castor bean tick) are infected up to 30 % with borrelia. In dogs from endemic areas, the antibody prevalence (up to 95 %) correlates with dog ownership, dog s outdoor time and sucking time of the ticks. The definitive in-clinic diagnosis Lyme borreliosis is often complex and can only be done by an analytical view combining many details like case history, clinical symptoms (e. g. lethargy, exhaustion, fever, swollen lymph glands, switching lameness, arthritis and neurological disorders) and especially by laboratory diagnostics. A successful therapy is based on an early detection of symptoms (first signs 2 to 5 months after tick exposition). Antibody detection (IgM before IgG) succeeds earliest in week 4 6 after tick exposition, after 3 months the antibody level is highest. A titre increase (seroconversion) mostly is seen before clinical signs of lameness and fever. Therefore, a negative test in an animal with clinical symptoms can rule out an acute borreliosis. For the detection of antibodies, a two-step diagnostics is known to be golden standard. First step starts with an IgM / IgG antibody screening test like rapid test (ICT), ELISA and / or IFA test. Due to false positive and false negative test results, a positive test result or unclear negative test result should be verified by a confirmatory test like the MegaBLOT IgG BORRELIA canis (2 nd step of diagnostics). Various criteria affect the serological IgM / IgG answer like age, immune status, rate of infection, Borrelia genotype species, cross reactions with other spirochaetes, time of testing, medical treatment with glucocorticoids etc. The MegaBLOT IgG BORRELIA canis is proven to be a reliable tool for a concluding appraisal for the actual Borreliosis status of the dog. 2. INTENDED USE MegaBLOT IgG BORRELIA canis is a qualitative immunoblot for the detection of specific IgG antibodies against Borrelia burgdorferi sensu lato in plasma or serum of the dog. 3. TEST PRINCIPLE Proteins derived from Borrelia garinii were separated electrophoretically according to their molecular weight using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Following electrophoresis, the separated protein bands were transferred to a PVDF membrane. The antigen-bearing membrane was blocked and cut into ready-to-use strips. Diluted dog sera or plasma samples are incubated with the antigen strips. If present, Borrelia-specific IgG antibodies will bind to their target antigens fixed on the mem-

14 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Page 14 brane. After washing, anti-dog IgG antibodies conjugated with horseradish peroxidase are added. At the end of a second incubation step, non-bound conjugate is removed by washing. The bound conjugate is visualised by the addition of a chromogenic substrate. Strips are dried and analysed. Using the kit-specific template supplied with the kit, the position of the stained bands can be correlated with defined Borrelia antigens. 4. TEST-KIT COMPONENTS 4.1. COMPONENTS / REAGENTS PROVIDED WITH THE TEST-KIT The reagents of one package are sufficient for 10 determinations. 1. Borrelia garinii antigen strips (IgG, 1 tube containing 10 consecutively numbered western blot strips), coated with Borrelia garinii antigens 2. Template (1 predeveloped control western blot strip, kit-specific) ml Sample Dilution Buffer (SDB, phosphate buffer with stabilisers, ph 7.2 ±0.2, yellow stained, contains 0.1 % Kathon), ready to use, white cap ml Wash Buffer (20 buffer, ph 7.2 ±0.2, contains 0.1 % Bronidox L after dilution), white cap ml Conjugate (peroxidase-conjugated anti-dog IgG antibodies, red stained, contains 0.2 % Bronidox L), ready to use, black cap ml Substrate (3,3,5,5 -tetramethylbenzidine [TMB]/ hydrogen peroxide), ready to use, blue cap. Do not expose to sun light! 7. 1 test protocol 8. 1 result sheet 9. 2 incubation trays instructions for use 4.2. REQUIRED, NON-PROVIDED REAGENTS / DEVICES Distilled or deionised water Disposable sample tubes Laboratory pipettes ( µl, 1 ml) Vortex mixer Vacuum apparatus with disinfection trap Filter paper / laboratory cloths Shaking platform Plastic tweezers for the western blot strips Measuring cylinder (1000 ml) Stop watch Waste bin with a 0.5 % hypochlorite solution

15 Page 15 MegaBLOT IgG BORRELIA canis 5. STABILITY AND STORAGE 2 8 C Store at 2 8 C Expiry date see label For veterinary use only In vitro diagnosticum Follow instructions for use precisely LOT! Lot number Do not use test-kit components from different kits, lot numbers or beyond stated expiry date. The diluted Wash Buffer is stable for 5 weeks when stored at 2 8 C. Microbial contamination must be avoided. After the expiration date, the guarantee of quality is not provided. Remove the required amount of western blot strips, leave the remaining strips in the tube, close the tube and store it at 2 8 C. A direct influence of light onto the colourless to pale yellow Substrate must be absolutely avoided to prevent degradation / autooxidation / colour change to blue. If the Substrate colour has changed to blue, it cannot be used any more (functional incapacity). 6. INFORMATION ON THE SAMPLE MATERIAL Use only dog plasma or serum samples! Mix the sample material well before use! Non-cooled (20 25 C), plasma or serum should be tested within 4 hours! At 2 8 C, the plasma or serum can be stored up to 5 days. Plasma or serum samples can be aliquoted and permanently stored at minimum 20 C. Avoid repeated freezing and thawing. Do not heat inactivate! Keep in mind that the sample material, as well as all used test-kit components, should have reached room temperature at the time of application. ATTENTION: Partially filled and / or insufficiient mixed EDTA, Citrate or Heparin tubes could create interference effects resulting in varying test results.

16 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Page TEST PREPARATION Read instructions for use carefully before starting the test. For the reliability of the results, it is important to follow the instructions for use exactly as described. Carry out the test in the given order and without delay. Use clean disposable tips!for each pipetting step GENERAL Using tweezers, carefully remove the number of required western blot strips from the tube after they have reached room temperature. Mix the reagents well immediately before their use. After use of pipette tips, discard the tips and use a new tip for the next pipetting step. After use, both non-used western blot strips (in closed tube) and reagents should be stored at 2 8 C again. Western blot strips that were once used cannot be used again. Damaged test-kit components must not be used. Direct contact of samples with the test-kit components has to be avoided (crosscontamination). Direct solar radiation during testing must be avoided PREPARATION OF WASH BUFFER 1:20 Mix 1 part of the Wash Buffer concentrate with 19 parts of distilled water, e. g. 10 ml Wash Buffer with 190 ml water. When crystals are visible in the Wash Buffer concentrate, dissolve these by warming the Wash Buffer concentrate up to 37 C in a water bath. The diluted Buffer will be stable for 5 days if stored at room temperature (20 25 C) SAMPLE PREPARATION / SAMPLE DILUTION Add 1.2 ml (1200 µl) MegaBLOT IgG BORRELIA canis Sample Dilution Buffer (SDB) into an appropriate sample tube. Add 12 µl of sample into the SDB. Homogenise the sample-buffer mixture (SBM) well (repeated mixture with pipette or vortex mixer).

17 Page 17 MegaBLOT IgG BORRELIA canis 8. TEST PROCEDURE Mix sample material well before application! 8.1. SAMPLING AND FIRST INCUBATION Place the required amount of western blot strips in the channels of the incubation tray. Pipet 1.2 ml of diluted dog plasma or serum into the appropriate channel of the incubation tray. Check that all antigen strips are completely covered. If needed, gently shake the tray or push the strips delicately into the solution with a clean pipette tip. The numbered side of the strip must face up, because the antigens are bound to this side of the membrane. Incubate for 60 minutes at room temperature (20 25 C) with soft shaking WASHING CAREFULLY and STRICTLY FOLLOWING THE INSTRUCTIONS! Carefully aspirate the liquid of each channel. Remove the incubation solution by emptying into a waste bin with hypochlorite. Disposal must be made according to official regulations! Add 1 ml of Wash Buffer per channel. Place the incubation tray on the shaking platform for 5 minutes at room temperature (20 25 C). Repeat the wash step twice SECOND INCUBATION Add 1 ml Conjugate into each channel. Incubate for 30 minutes at room temperature (20 25 C) with soft shaking WASHING Wash as described in issue THIRD INCUBATION Add 1 ml Substrate (TMB) into each channel. Incubate for 10 minutes at room temperature (20 25 C) and under observation with soft shaking. Caution: Do not overdevelop! Some plasma or sera show excessive blue background staining on the strips. To avoid this, stop the reaction earlier by washing with deionised water STOP THE REACTION Aspirate the contents of each channel and rinse each strip with 1 ml of deionised water. Place the incubation tray back on the shaking platform for 5 minutes. Repeat the rinsing step. Remove the strips from the incubation tray and place them with the number face up on filter paper to dry (approximately 30 minutes at room temperature). To prevent fading, the strips should be protected from exposure to light.

18 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Page TEST EVALUATION 9.1. INTERPRETATION OF RESULTS Once dried, attach the strips to the result sheet using clear tape. The MegaBLOT IgG BORRELIA canis utilizes a template in form of a pre-developed western blot strip cut from the same membrane lot used to prepare the western blot strips provided in the test-kit and therefore is kit-specific. This strip has was incubated with a positive control serum in order to exhibit bands representative for a Lyme infection. The corresponding protein bands are listed on the right side of the template. For evaluation of the sample, the kit-specific template is used. Herefore, the index line of the template must be applied exactly on the horizontal line at the bottom of the western blot strip. At the top of the strip canine IgG is applied as a reaction control. This band must show a distinct colour reaction to prove a proper test performance. For band scoring, determine the reactivity of the following bands: p100 (93 kda), p58 (58 kda), Flagellin (41 kda), BmpA (39 kda), OspA (32.5 kda), OspC (22 23 kda) and p18 (18 kda) 9.2. ANTIGEN BAND SPECIFICITY Band Borrelia antigens and their diagnostic value p100 (93 kda) highly specific marker in the course of chronic infection stages 75 kda specific marker, probably belonging to the bacterial DNA kda heat shock proteins, not specifically associated with a Borrelia infection and are found in several bacterial infections; no diagnostic value 66 kda species-dependent but specific marker for Borrelia infections 60 kda common bacterial antigen, non-specific; no diagnostic value 58 kda species-dependent but infection-specific marker infections with high Borrelia load (often in combination with p18) common after vaccinations (relatively vaccination-specific marker) Flagellin (41 kda) BmpA (39 kda) Flagellin protein all stages of infection cross reaction with other spirochaetes highly specific membrane protein A all stages of infection 37 kda considered to be an early marker, but specifity has not been established

19 Page 19 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Band OspA (32.5 kda) OspC (22 23 kda) Borrelia antigens and their diagnostic value highly specific outer surface protein A after infection: rare in later stages with low intensity (stronger in case of multiple antigen contacts) after vaccination: early, very intensive and long-lasting highly specific outer surface protein C after infection: often in early stages (important IgM marker), but also in late stages occasional after vaccinations (early and short appearance) 18 kda highly specific marker late infection stages (especially in strong sera) Dog plasma or sera may exhibit other bands than those mentioned above. Such bands should not be considered when interpreting the results EVALUATION OF ANTIGEN BANDS Before analysing the bands, two questions have to be addressed: 1. Is the animal frequently exposed to tick bites? If this is the case, the blot will show several specific bands even in the absence of an ongoing infection. Other serological tests will probably be positive and a complete analysis of the western blot bands will be needed to differentiate between a past exposure and an ongoing infection. In contrast, dogs which are not exposed to tick bites will show an immunoblot result with very few bands, when seronegative (most frequent bands: 60 kda, 41 kda). 2. Is the clinical presentation suggestive of an ongoing Borreliosis? In the absence of fever and / or lameness, distinguishing between a past exposure and an ongoing infection may be extremely difficult. 3. Overall presentation of the strip: A positive result corresponds to a strip with several neat bands, including some very intense bands. Positive blots are very similar to the control strip on the kit template. IMPORTANT: Only bands with the same or stronger intensities than the according band shown on the kit-specific control strip (template) are considered for evaluation POINT EVALUATION OF IMMUNODOMINANT BORRELIA ANTIGENS Borrelia antigen Molecular Weight (kda) Points IgG p p Flagellin 41 1 BmpA 39 5 OspA OspC p

20 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Page 20 Sum up the points for each patient specimen and interpret as follows: 1. The blot result cannot be considered as positive basing on a single reactive band. 2. If only one of the following bands p100, p39, OspC or p18 is reactive, a second specimen should be retested after 2 3 weeks using the MegaBLOT IgG BORRELIA canis. 3. As soon as at least 2 bands are visible (p100, p39, OspC or p18), the sample is considered to be positive. The likelihood of a natural Borrelia infection is > 95 %. 4. There are no classical vaccination or infection bands, but there are bands reacting more intensive after vaccination than after infection, i. e. OspA. Sum of points Evaluation IgG < 5 negative 5 7 questionable 8 positive 10. LIMITATIONS OF THE TEST PROCEDURE The absence of IgG antibodies reactive with Borrelia antigens on the MegaBLOT IgG BORRELIA canis cannot exclude a Borrelia infection in all cases. In the early phase of infection, detectable amounts of IgG antibodies may not or not yet be present. In case of a negative MegaBLOT IgG BORRELIA canis, but suspicious symptoms for an acute infection, please retest the dog after 2 3 weeks using a new sample with MegaBLOT IgG BORRELIA canis. In addition, antibiotic therapy in early stages of infection can suppress the formation of antibodies. The presence of IgG antibodies specific for Borrelia antigens does not necessarily indicate an acute infection since high IgG titres of a previous infection can possibly persist for several years. Serological results should not be used as the sole criterion on which a diagnosis is established. They are an aid to diagnosis only, and their significance must be interpreted in relationship to the clinical presentation of the animal. In the case of unclear or equivocal findings, repeated testing extending over several weeks is recommended. 11. SAFETY MEASURES AND PRECAUTIONS Wear safety clothes (disposable gloves) and wash the hands after finishing the test procedure. No eating and drinking during test procedure. The sample material must be seen as potentially infectious and disposed of accordingly, together with the used test-kit components. The disposal of this kind of waste is regulated through national and regional laws and regulations. Contact your local authorities or waste management companies which will give advice on how to dispose of hazardous waste.

21 Page 21 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Do not mix reagents of different Lot numbers. Do not use reagents of other manufacturers together with the reagents of this test-kit. Do not change the caps of the individual reagents among each other. Close bottles immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination. After first opening, the reagent bottles must be checked for microbial contamination before reusing. Sample Dilution Buffer contains Kathon as preservative. Substrate solution contains hydrogen peroxide. Absolutely avoid skin or mucosa contact! Wash Buffer and Conjugate contain Bronidox L as preservative. In the used concentration, Bronidox L has hardly any toxicological risk upon contact with skin and mucous membranes. Only use clean pipette tips, dispenser and laboratory material. Never pipet with your mouth! Label sample material and associated sample tube to ensure a precise assignment. Use a new sample tube for each sample. Always use tweezers to handle western blot strips. During the incubation and wash steps, the western blot strips must be completely covered with liquid and the numbered side of the strips must face up. To avoid cross contamination and false test results, pipet the patient samples and conjugate carefully into the channels of the incubation tray. MegaBLOT IgG BORRELIA canis is only provided for the use of qualified staff that knows the work technique objectionable. The test procedure, the information, the safety measures and warnings in the Instructions for use are to be followed strictly. For use of the test-kit in diagnostical instruments, the test method has to be validated. Each change in appearance, composition and the application as well as each use in combination with other products not authorised by the manufacturer is not permitted. The manufacturer is not liable for false results and incidents being associated herewith. The user himself is responsible for such changes. No liability is accepted for false rest results due to visual evaluation. 12. LIABILITY The entire risk due to the performance of this product is assumed by the purchaser. The manufacturer shall not be liable for indirect, special or consequential damages of any kind resulting from the use of this product.

22 MegaBLOT IgG BORRELIA canis Page SHORT PROTOCOL MegaBLOT IgG BORRELIA canis TEST PREPARATION Warm needed western blot strips and reagents to room temperature (20 25 C). Dilute Wash Buffer 1:20 with distilled water. Dilute samples with Sample Dilution Buffer (12 µl sample µl SDB) TEST PROCEDURE Add 1200 µl of diluted plasma or serum samples each in a cavity. Incubate 60 minutes at room temperature (20 25 C) with soft shaking. Wash 3 with soft shaking with 1 ml 1 Wash Buffer each. Add 1 ml of Conjugate in each cavity. Incubate 30 minutes at room temperature (20 25 C) with soft shaking. Wash 3 with soft shaking with 1 ml 1 Wash Buffer each. Add 1 ml of Substrate (TMB) in each cavity. Incubate 10 minutes at room temperature (20 25 C). Watch. Stop by rinsing with deionised water. Evaluate in comparison with template.

23 Page 23 MegaBLOT IgG BORRELIA canis MegaBLOT IgG BORRELIA canis ad us. vet. Inhaltsverzeichnis Seite 1. Einleitung 2 2. Verwendungszweck 2 3. Testprinzip 3 4. Testkitkomponenten 3 5. Haltbarkeit und Lagerung 4 6. Informationen zum Probenmaterial 4 7. Testvorbereitung 5 8. Testdurchführung 6 9. Testauswertung Einschränkungen des Tests Sicherheitsmaßnahmen und Warnhinweise Haftung Kurz-Protokoll MegaBLOT IgG BORRELIA canis 12 Contents Page 1. Introduction Intended use Test principle Test-kit components Stability and storage Information on the sample material Test preparation Test procedure Test evaluation Limitations of the test procedure Safety measures and precautions Liability Short protocol MegaBLOT IgG BORRELIA canis 22