Highend diagnostic products. Optiplex Borrelia IgM Screening Test
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- Jasmin Edwina Neumann
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1 Highend diagnostic products Optiplex Borrelia IgM Screening Test 1
2 Highend diagnostic products Optiplex Borrelia IgM Screening Test Multiplex Bead Assay (MBA) zum Screening nach IgM- Antikörpern in humanem Serum basierend auf semiquantitativen Messungen gegen Borrelia-Antigene. Artikel-Nr: IN0501 Anzahl der Messungen: 96 Bestimmungen Lagerung: 2 8 C Gebrauchsanweisung/ Instruction sheet / Carnet d instruction / instrucciones de uso / gebruiksaanwijzing / istruzioni per l uso / σελίδα οδηγιών / bruksanvisning / modo de emprego: 1. Einleitung Die Lyme-Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Infektionskrankheit in der nördlichen Hemisphäre. Die Prävalenz von Antikörpern gegen Borrelia spec. beträgt bei Blutspendern 5-19 % mit regionalen Unterschieden. Der serologische Nachweis von IgM-Antikörpern gelingt in der Regel frühestens 3 Wochen nach der Infektion (2) und damit oft erst nach Abklingen eines Erythema migrans (EM). Mit beginnender Generalisierung der Infektion nach ca. 6 Wochen lassen sich steigende IgG-Antikörper-Titer gegen eine zunehmende Zahl Borrelia-Antigene nachweisen (4,5) während die IgM-Antwort langsam abklingt (Serokonversion). Für die späten Borrelioseformen sind hohe spezifische IgG-Titer bei geringen bis nicht nachweisbaren IgM-Titern charakteristisch (3,6). 2. Testprinzip Dieser MBA detektiert die IgM-Antikörperklasse gegen 3 Borrelia-Antigene in verdünnten humanen Seren. Der MBA besteht aus optisch unterscheidbaren Sets von Beads, die durch verschiedene Kombinationen zweier unterschiedlicher Farbstoffe gekennzeichnet sind. Jedes Bead-Set ist mit einem anderen Antigen beschichtet. Die Testdurchführung beinhaltet 2 Inkubationsschritte. Verdünnte Seren werden zunächst mit der multiplexen Mischung der Bead-Suspension inkubiert. Wenn vorhanden, binden spezifische Antikörper an das Antigen eines Bead-Sets aus dem MBA. Die verschiedenen Bead-Sets des MBAs sind mit folgenden, von verschiedenen Borrelia-Arten isolierten Antigenen beschichtet (1): 2 Antigen Spezies Antigen-Typ Lysat MMS Borrelia afzelii nativ OspC PBi Borrelia garinii rekombinant OspC PKo Borrelia afzelii rekombinant Im 2. Inkubationsschritt werden Phycoerythrin-konjugierte Ziege-anti-human IgM-Nachweismoleküle ( Konjugat ) zugegeben, um die an die Beads gebundenen IgM-Antikörper detektieren zu können. Die Beads werden basierend auf der Bead-spezifischen Farbkombination und der Menge an gebundenen Phycoerythrin-markierten Nachweismolekülen (anti-igm), welche die für Borrelia-Antigene spezifischen Antikörper anzeigen, im Luminex-Analysesystem identifiziert. Binden Konjugatmoleküle an freies IgM aus der Probe, so werden sie nicht vom Gerät detektiert. Der gesamte Nachweis kann daher ohne Waschschritte zur Entfernung von ungebundenen Antikörpern erfolgen. Das 4. Bead-Set des MBAs, CR1, dient der Überprüfung des IgM-Levels der Probe und zur Kontrolle der Nachweisreaktion durch das Konjugat. 3. Inhalt der Testpackung DIL Assay-Puffer; 1 x 100 ml gebrauchsfertig. NEG M Negativkontrolle (Serum)*; 1 x 300 µl gebrauchsfertig, enthält keine detektierbaren Borrelia-spezifischen IgM-Antikörper. REF M Referenzkontrolle (Serum)*; 1 x 300 µl gebrauchsfertig, enthält humane Borrelia-spezifische IgM-Antikörper. POS M Positivkontrolle (Serum)*; 1 x 300 µl gebrauchsfertig, enthält humane Borrelia-spezifische IgM-Antikörper. BMM Bead-Mix; 1 x 2,6 ml gebrauchsfertig, enthält 4 Bead-Sets. CON M Konjugat; Phycoerythrin-konjugiertes Ziegeanti-human IgM; 1 x 6 ml gebrauchsfertig. MTP Mikrotiterplatte (Break-Apart-Strips); 1 Stück. Arbeitsanleitung, Chargenzertifikat, Abklebefolien 4. Hinweise Gebrauch nur durch Fachpersonal. Lizenz für Endanwender Das Kit enthält modifizierte Beads. Diese sind von Luminex autorisiert. Durch den Erwerb dieses Kits erhält der Kunde die Rechte zu Verwendung dieses Produkts nur in Kombination mit dem Luminex-Analysesystem. Die Nutzung von Luminex-Beads ist durch ein US- Patent geschützt. Sicherheitshinweise *Die Kontrollen NEG M, REF M und POS M sind durch anerkannte Methoden für HIV 1, HIV 2, HbS Ag und Antikörper gegen HCV getestet und negativ befunden worden. Trotzdem sollten Kontrollen und Proben als
3 potentiell infektiös behandelt werden. Empfehlung: in der WASTE-Flasche geeignetes Desinfektionsmittel vorlegen, Feststoff-Abfall autoklavieren (30 Minuten, 121 C). Regeln guter Laborpraxis beachten! Flüssige Komponenten enthalten ProClin 0,05% als Konservierungsmittel. Kontakt mit Augen, Haut oder Schleimhaut vermeiden. Entsorgungshinweise Bei der Beseitigung der Testpackung sind die nationalen gesetzlichen Bestimmungen in der jeweils aktuellen Fassung zu beachten. Chemikalien und Zubereitungen, die als Reststoffe anfallen, sind in der Regel Sonderabfälle. Besondere Hinweise zur Entsorgung sind zusätzlich im Sicherheitsdatenblatt aufgelistet. Maßnahmen bei Beschädigung Im Falle einer erheblichen Beschädigung der Testpackung ist der Händler zu benachrichtigen. Bei erheblicher Beschädigung einzelner Komponenten sind diese nicht zur Testdurchführung zu verwenden. Sie sollten so lange aufbewahrt werden, bis der Transportschaden geregelt ist. Danach sollten sie ordnungsgemäß entsorgt werden. 5. Benötigte, zusätzliche Materialien Reaktionsgefäße (1,5 ml) für Probenverdünnungen Präzisionspipetten ( µl) Schüttler (Vortex) Orbitalmischer Inkubationsschrank 37 C Luminex-Analysesystem Stoppuhr Handschuhe 6. Haltbarkeit Die Komponenten sind ungeöffnet bei sachgerechter Lagerung (2-8 C) bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten haltbar. Nach Anbruch beträgt die Haltbarkeit 6 Wochen. Nicht Einfrieren! Beads sind lichteempfindlich! Direkte Lichteinstrahlung vermeiden! Außer des Assay-Puffers ist eine Mischung der Komponenten verschiedener Chargen nicht zulässig. 7. Probenmaterial Humane Serumproben sollten frisch eingesetzt werden. Bei Lagerung unterhalb von 20 C, können die Proben jedoch auch nach mehreren Monaten Lagerung eingesetzt werden. Mehrfaches Frieren/Tauen ist dabei zu vermeiden. Hämolysierte, lipämische, ikterische oder kontaminierte Proben, sowie präzipitierte oder viskose Proben sollten nicht analysiert werden, da sie zu Resultatverfälschungen führen können. 8. Testvorbereitung Luminex-Analysesystem gemäß Handbuch vorbereiten. Die zur Erstellung eines Templates notwendigen Parameter sind im Anhang aufgeführt. Zum Test passendes Template aufrufen. Name der Messreihe eintragen. Bezeichnungen der Proben gemäß Pipettierschema (s. u.) eintragen. Inhalt der Testpackung auf Raumtemperatur bringen (20-25 C). BMM Bead-Mix IgM (BMM) unbedingt unmittelbar vor Gebrauch durch sorgfältiges Vortexen resuspendieren. Direkte Lichtexposition vermeiden, Beads sind lichtempfindlich! Probenverdünnung Serumproben Serumproben mit gebrauchsfertigem Assay-Puffer 1:201 verdünnen. Auf gleichmäßige Durchmischung der Verdünnungen achten! µl Serum µl Puffer 9. Testdurchführung Die Arbeitsanleitung ist strikt zu befolgen, um eine optimale Funktion des Nachweises zu gewährleisten. Die Inkubationszeiten haben Toleranzen von ± 5 Minuten, die Inkubationstemperaturen besitzen Toleranzen von ± 2 C. Um eine optimale Durchmischung der Reagenzien zu gewährleisten und die Messzeit pro Probe zu minimieren, wird folgendes Vorgehen empfohlen: Die MTP ist vor jeder Inkubation bzw. unmittelbar vor der Messung für sec. auf einem Orbitalmischer bei U/min zu schütteln. Ist eine Messung direkt nach der letzten Inkubation nicht möglich, so kann der Ansatz maximal 30 Minuten bei 2-8 C zwischengelagert werden µl Negativkontrolle (NEG M) in Kavität A1 geben µl Positivkontrolle (POS M) in Kavität B1 geben µl Referenzkontrolle (REF M) in Kavität C1 geben µl verdünnte Serumprobe in die benötigten Kavitäten der Mikrotiterplatte vorlegen µl Bead-Mix (BMM) zu jeder Kavität zugeben. 6. Mikrotiterplatte mit Folie abkleben min bei 37 C im Dunkeln inkubieren µl Konjugat (CON M) zu jeder Kavität zugeben. 9. Mikrotiterplatte mit Folie abkleben min bei 37 C im Dunkeln inkubieren. 11. Ansatz umgehend im Luminex-Analysesystem analysieren. 3
4 10. Qualitätskontrolle Als Qualitätskontrollparameter für die Durchführung des gesamten Assays dienen die gemessenen Werte der Positiv-, Referenz- und Negativkontrolle. Für eine zuverlässige Bewertung muss das Verhältnis der MFI- Werte von Referenz- und Positivkontrolle innerhalb des im Chargenzertifikat angegebenen Referenzbereichs (Quotient) liegen. Die Negativkontrolle muss für alle Antigene als negativ bewertet werden. Als Validitätskriterium für die Tests der einzelnen Proben dienen in allen Kavitäten die Fluoreszenzsignale des Kontroll-Bead-Sets CR1. Über diese Signalwerte werden die Zugabe und das Verhältnis von verdünnter Serumprobe und Konjugat kontrolliert. Bei ordnungsgemäßer Durchführung müssen die Messwerte innerhalb der im Chargenzertifikat angegebenen Grenzwerte liegen. 11. Testauswertung Im Luminex-Analysesystem werden in jeder Kavität von jedem individuellen Bead-Set des Mixes 70 Beads fluorimetrisch vermessen. Die gemessenen Fluoreszenz-intensitäten werden über die Software des Luminex-Analysesystems ausgewertet und in einem nach der Messreihe benannten Ordner in der Datei Output. csv gespeichert. Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten jeder Probe sind in dieser Datei unter dem Punkt Data Type: Median tabellarisch aufgeführt. Aus den Messwerten der Referenzkontrolle in der Kavität C1 wird für jedes Bead-Set mit Hilfe der im Chargenzertifikat angegebenen Indizes der für diesen Testlauf spezifische Cut-off berechnet gemäß: Messwert REF M, Agn Index Die Fluoreszenzintensitäten der mit den Serumproben inkubierten Beads werden durch den Cut-off der entsprechenden Bead-Sets geteilt, um den Cut-off-Index zu berechnen: Agn Der Cut-off-Index zeigt an, um welchen Faktor die auf diesem Bead-Set gemessene Fluoreszenz der jeweiligen Probe unter oder über dem berechneten testspezifischen Cut-off-Wert liegt. Die Einzelindexwerte der Probe werden addiert, wobei von den beiden OspC-Werten nur der höhere in die Bewertung eingeht: REF M, Ag n Messwert Probe xy, Cut - off Index Probe = Cut off Ag n Agn = Cut Off Index Probe, Ag n Ag = Cut Off Index n Probe Negativ: Cut-off-Index < 2,5 Keine Antikörper gegen das Antigen dieses Bead-Sets nachgewiesen. Schwach positiv: 2,5 Cut-off-Index < 3,0 Verdacht auf Antikörper gegen das Antigen dieses Bead-Sets. 4 Positiv: Cut-off-Index 3,0 Antikörper gegen das Antigen dieses Bead-Sets nachgewiesen. 12. Interpretation der Ergebnisse Auf Grundlage der Kombination der spezifischen Nachweise von Antikörpern gegen verschiedene Borrelia- Antigene ergibt sich folgendes Bewertungsschema: 1. Cut-off-Index < 2,5 Immunserologisch kein Hinweis auf Borreliose 2. 2,5 Cut-off-Index < 3,0 Immunserologisch Borreliose nicht sicher ausgeschlossen 3. Cut-off-Index 3,0 Immunserologischer Hinweis auf Borreliose Im Fall von Punkt 2 und 3 sollte eine Überprüfung der Probe mit Optiplex Borrelia IgG / IgM Test durchgeführt werden. Auf Anfrage wird von der Firma DiaMex GmbH eine Software zur automatischen Kontrolle der Qualitätsparameter und Auswertung der Messergebnisse kostenlos zur Verfügung gestellt. 13. Testkenndaten Die Intra-Assay Varianz wurde bestimmt durch 12 fache Messung von Seren mit unterschiedlicher Reaktivität gegen die im Optiplex Borrelia IgM Screening Test eingesetzten Antigene. Intra-Assay Varianz: VK < 8 % Die Inter-Assay-Varianz wurde in 5 unabhängigen Messungen von Seren mit unterschiedlicher Reaktivität gegen die im Optiplex Borrelia IgM Screening Test eingesetzten Antigene bestimmt. Inter-Assay Varianz: VK < 6 % 14. Einschränkungen Die Resultate des Optiplex Borrelia IgM Screening Tests sollten nur zusammen mit der klinischen Diagnose interpretiert werden. Bei der serologischen Befundung von Patienten mit klinischem Verdacht auf Borreliose sollten sowohl die Ergebnisse des Optiplex Borrelia IgM Tests als auch die des Optiplex Borrelia IgG Tests mit einbezogen werden. Eine im frühen Infektionsstadium durchgeführte Antibiotikatherapie kann eine immunologische Antwort gegen Borrelia sp. verhindern. Polyklonale B-Zellstimulationen (z. B. durch EBV-Infektionen), Autoimmun-Erkrankungen oder Immun-defekte können zu verfälschten Ergebnissen führen (8,10). Entsprechende Befunde sind differential-diagnostisch auszuschließen. Flagellin-Antigene (p41) sind auch bei anderen Gattungen der Spirochaeten (Treponema spec., Leptospira spec.) verbreitet und können zu entsprechenden Kreuzreaktivitäten führen (7,8,9). Plasmidkodierte Antigene (z. B. OspC) können durch lateralen Transfer auch auf andere Arten übertragen
5 werden (11). Kreuzreaktionen können bei solchen pathogenitätsassoziierten Antigenen auch mit anderen Erregern (z. B. Yersinien und Chlamydien) auftreten. In seltenen Fällen treten Seren mit unspezifischen Bindungseigenschaften gegen die Bead-Sets auf. Sie sind i.d.r. gekennzeichnet durch niedrige Cut-off-Indizes bei den Borreliose-Frühmarkern und hohen Indizes bei den Bead-Sets der für die Spätphase typischen IgG- Marker. Solche Seren sollten durch alternative Technologien bewertet werden. 15. Problembehandlung Messwerte der Kontrollen sind außerhalb der Grenzwerte Überprüfung des Pipettiervolumens der Kontrollen und des Konjugats; Wiederholungsmessung der Kontrollen. Sollte das Problem weiterbestehen, bitte den Händler kontaktieren. CR1-Werte der Serumproben sind außerhalb der Grenzwerte Pipettiervolumen der Serumproben und die Serumverdünnung kontrollieren; Wiederholungsmessung mit frisch verdünnten Seren. Sollte das Problem weiterbestehen, bitte den Händler kontaktieren. Einzelne, besonders hoch- oder niedrigtitrige Seren können ebenfalls zu Messwerten außerhalb der Grenzwerte führen. In diesen Fällen wird eine Bestimmung des Antikörper-Gehalts und ggf. eine individuell angepasste Verdünnung empfohlen. Stark streuende CR1-Werte innerhalb einer Testreihe sind ein Indiz für eine inhomogene Verdünnung oder schlechte Durchmischung. 16. Literatur 1. Hauser U., Lehnert G., Wilske B. (1998): Diagnostic Value of Proteins of Three Borrelia Species (Borrelia burgdorferi Sensu Lato) and Implications for Development and Use of Recombinant Antigens for Serodiagnosis of Lyme Borreliosis in Europe. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5: Vogt A (1990): Die Labordiagnostik der Borreliaburgdorferi-Infektion, Fortschr Med 108: Wilske B, Fingerle V, Herzer P, Hofmann A, Lehnert G, Peters H, Pfister H-W, Preac-Mursic V, Soutschek E, Weber K (1993): Recombinant immunoblot in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. Med Microbiol Immunol 182: Steere A C (1989): Medical progress - Lyme disease. N Engl J Med 321: Putzker M, Sauer H (1995): Labordiagnostik von Infektionen mit Borrelia burgdorferi sensu lato, Klin. Lab.; 41: Herzer P, Wilske B, Preac-Mursic V, Schierz G, Schattenkirchner M, Zöllner N (1986): Lyme arthritis: clinical features, serologicalal and radiographic findings of cases in Germany. Klin. Wochenschr 64: Bruckbauer H, Preac-Mursic V, Fuchs R, Wilske B (1992): Cross-reactive proteins of Borrelia burgdorferi. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 11: Horst H (1997): Einheimische Zeckenborreliose (Lyme-Krankheit) bei Mensch und Tier, 3. überarb. Aufl., Spitta Verlag Tewald F, Braun R (1998): Durchführung und Interpretation serologischer Tests bei Verdacht auf Borrelia-Infektionen, Clin.Lab 44: Goosens HAT, van den Boogard AE, Nohlmans MKE (1999): Epstein-Barr-Virus and Cytomegalovirus infections cause false positive resuts in IgM two-test protocoll for early lyme borreliosis, Infection 27: Wie-Gang Q, Schutzer SE, Bruno JF, Attie O, Xu Y, Dunn JJ, Fraser CM, Casjens SR, Luft BJ (2004): Genetic exchange and plasmid transfers in Borrelia burgdorferi sensu stricto revealed by three-way genome comparisons and multilocus sequence typing, PNAS 101: DiaMex GmbH, Siemensstraße 38, Heidelberg, Deutschland Tel. +49(0) , Fax +49(0) Gültig ab: V03-D IN0501 5
6 Kurzanleitung Optiplex Borrelia IgM Screening Test Serumverdünnung, 1:201 vorbereiten: 1+200: 5 µl Serum µl Puffer Proben: 25 µl NEG M, REF M, POS M, (unverdünnt), Serumproben (verdünnt), siehe Pipettierschema BMM in jede Kavität (unmittelbar vor Gebrauch mischen!) 25 µl sec bei U/min schütteln, Inkubation: 60 Min. 37 C, im Dunkeln CON M in jede Kavität 50 µl sec bei U/min schütteln, Inkubation: 60 Min. 37 C, im Dunkeln sec bei U/min schütteln Umgehende Messung Pipettierschema A NEG M B POS M C REF M D E F G H 6
7 Vorgaben zur Template-Erstellung für Optiplex Borrelia IgM Screening Test unter Luminex IS Software (ab Version 2.2 SP1) Eingaben Seite 1: Template Name: DM_BorScreen_IgM Version No.: 1.0 Template Type: Data collection only Sample Vol. (µl): 50 Sample Timeout (sec): 70 Doublet Discriminator Gate Low Limit: 6800 High Limit: Eingaben Seite 2: Tests: 4 Name Units Description Bead ID MinBeads CR1 MFI LysMMS MFI OspCPBi MFI OspCPKo MFI Die Reihenfolge und Schreibweise der Bead-Sets ist bei Verwendung der durch die DiaMex GmbH gestellten Auswerte-Software strikt zu beachten. Eingaben Seite 3: Template Commands Wash from reservoir Acquire Test specimen Zur Sicherung des Templates: Save + Export Erläuterung der verwendeten Symbole Gebrauchsanweisung beachten Für <x> Bestimmungen Chargennummer Bestellnummer Temperaturlimit In-Vitro-Diagnostikum Verwendbar bis Hersteller Konformitätskennzeichnung 7
8 Highend diagnostic products DiaMex GmbH Siemensstraße Heidelberg, Deutschland Tel. +49(0) Fax +49(0) DE-DX-L-I-BE
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