T-Zell-Diagnostik in der Veterinärmedizin

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1 Autoimmun Diagnostika GmbH Ebingerstraße 4 D Straßberg Tel.: +49 (0) 7434/ info@aid-diagnostika.com T-Zell-Diagnostik in der Veterinärmedizin 22. Oktober 2014 Infectolab-Vet Dr. N. Ettischer AID GmbH, Germany ettischer@aid-diagnostika.com

2 Das Immunsystem Quelle: wikipedia

3 Lymphozyten

4 T-Helferzellen

5 T-Helferzellen

6 PBMC Isolierung Untersuchungsmaterial: Vollblut bzw PBMCs: Peripheral blood mononuclear cells Heparinblut CPT RöhrchenBD Leucosep(Greiner) CPDA- Röhrchen(Sarstadt) Zu beachten: Röhrchen sollten immer ganz gefüllt sein! Blutsolltenichtälterals48 Std. sein! Blutproben bei RT lagern Nicht stark schütteln/ zentrifugieren

7 Elispot Enzyme Linked Immuno Spot technique Der Elispot detektiert die Anzahl der antigenspezifischen T-Zellen aufgrund ihrer Zytokinausschüttung: 1 Spot = 1 Cytokinproduzierende T-Zelle Material: PBMCs EliSpot-Platte beschichtet mit monoklonalen Antikörpern(IFN-y, etc.)

8 EliSpot Methodik

9 EliSpot Methodik

10 EliSpot Methodik

11 EliSpot Auswertung Beispiel Canine Lymespot (IFNy) LW Positiv Kontrolle Pos. Kontr. 1:5 OspC

12 Interpretation Zur Interpretation der Ergebnisse kann ein Stimulationsindex gebildet werden: Spotanzahl Antigen Mix Spotanzahl Leerwert = Stimulationsindex (SI) Beispiel Canine Lymespot (IFNy) SI ist größer oder gleich 3 SI zwischen 2 und 3 SI kleiner 2 Probe ist reaktiv Probe ist grenzwertig Probe ist negativ

13 Diagnostik Wo wird die Elispot Diagnostik eingesetzt? Autoimmunologie Transplantation Allergie Infektionskrankheiten Impfstoff Monitoring

14 Borrelia burgdorferi sensu lato Pathogene Erreger: B. burgdorferi sensu stricto (Lyme-Arthritis) B. afzelii (Hautmanifestationen) B. garinii (ZNS-Infektionen) B. spielmanii Übertragung durch den gemeinen Holzbock Ixodesricinus sehr selten auch durch fliegende Insekten (Pferdebremsen, Stechmücken)

15 Serologische Diagnostik Antikörper-Anstieg tritt in den meisten Fällen 2-4 Wochen nach dem Zeckenbiss auf, aber auch längere Latenzphasen möglich Ak können auch bei eindeutiger Klinischer Symptomatik fehlen! Frühzeitige Therapie kann eine Antikörpersynthese oder z. B. die Ausbildung von IgM oder IgG Antikörpern partiell oder vollständig unterdrücken Auch unter Therapie sind signifikante Titer-Anstiege möglich Spezifische IgG AK können auch nach effektiver Therapie z. T. über Jahre nachweisbar bleiben Grundsätzlich ist ein positiver Borrelien AK-Befund allein keine Indikation zur Therapie

16 LymeSpot Möglichkeitendes EliSpotsin der Diagnostik der Lyme-Borreliose Alternativmethode zu ELISA / WB bei unklaren Fällen Frühere Diagnose Höhere Sensitivität und Spezifität Therapieüberwachung/ Prognose möglich Seronegative chronische Borreliosen IFN-y Elispot (equine) Antigen: VLSE

17 Therapiemonitoring Antibiotikatiter Borrelien- spezifische T-Zellen Monate nach Beginn der antibiotischen Therapie

18 LymeSpot Borrelien Vollantigen : Aufgereinigtes Bakterien Lysat (Borrelia burgdorferi B31) Borrelien Osp Peptidmix: Peptide von OspA: Borrelia burgdorferi, B. afzelii, B. garinii Natives OspC: B. afzelii Rekominates DbpA VLSE DbpB IFN-y Elispot (equine) Antigen: Lysat IFN-y Elispot (equine) Positivkontrolle IFN-y Elispot (equine) Antigen: OspC

19 LymeSpot(equine) Negativkontrolle (5 spots) Spotanzahl Antigen Mix Spotanzahl Leerwert = Stimulationsindex (SI) Borrelien Vollantigen (40 spots) SI ist größer oder gleich 4 Probe ist reaktiv Stimulationsindex: 40/5= 8 reaktiv

20 Borrelien- Immunoarray Dot1: Dot 2: Dot 3: Dot 4: Dot 5: Dot 6: Dot 7: Dot 8: Dot 9: Dot 10: Dot 11: Dot 12: IgGundIgM IgG IgM OspC(B. burgdorferi) OspC(B. spielmanii) OspC(B. afzelii) p18(b. burgdorferi) BmpA(B. burgdorferi) p41 (B. burgdorferi und B. afzelii) p58(b. burgdorferi) p100(b. burgdorferi) VlsE(B. burgdorferi)

21 Borrelien- Immunoarray

22 Herpesviren Humanpathogene Typen: Herpes simplex-virus (HSV-1) Typ1 Herpes simplex-virus (HSV-2) Typ2 Varizellen Zoster-Virus VZV Epstein-Barr-Virus (EBV) Humanes Cytomegalievirus (HCMV) Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6) A und B Humanes Herpesvirus 7 (HHV-7) Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) Lynn Enquist lab (molbio.princeton.edu) Canines Herpesvirus Typ 1 Equine Herpesviren Typ 1,2,3,4,5

23 Herpesviren Equine Herpesviren EHV1 EHV2 EHV3 EHV4 EHV5 Alpha HV Alpha HV Alpha HV Gamma HV Gamma HV VZV? EBV, HSV VZV? VZV? EBV, HSV equines CMV Virusaborte Respiratorische Erkrankungen Neurologische Erkrankungen (Myeloenzephalopathie) Hohe Durchseuchung, meist asymptomatisch, Bindehautentzündung Koitalexanthem (Bläschenausschlag) Anzeigenpflichtige Tierseuche, Zuchtausschluss Virusaborte Respiratorische Erkrankungen Neurologische Erkrankungen (Myeloenzephalopathie) Hohe Durchseuchung, meist asymptomatisch Canines Herpesvirus Genus CHV1 Alpha HV Related to HSV 1& % Durchseuchung Ältere Tiere asymptomatisch bis leichte Atemwegsinfekte (Zwingerhustenkomplex) Primärinfektion während Trächtigkeit kann Totgeburten auslösen Infektion in den ertsen 3 Wochen kann Welpensterben verursachen

24 Elispot- Herpesviren Negativkontrolle EBV Lysat (EHV2) 25 Spots 187 Spots Stimulationsindex 7,48: Reaktiv Vorteile: EHV pos/neg Status VOR einer Erkrankung (Gerade bei Zuchttieren sinnvoll)

25 AID MultiSpot Multifunktionale Plattform für Zellzählung, EliSpot und FluoroSpot assays in unterschiedlichen Formaten (96-well plates, Glas-Objektträger und Terasaki trays) Enzymatischer und Fluoreszenz-EliSpot Zellzählung und Zellvitalitätstests IF-basierte Gewebeassays HLA screening assays (z.b. CDC assay) Maßgeschneiderte Lösungen auf 96well Platten, Glas-Objektträgern und Terasaki trays ispot AID EliSpot Reader System 2-color assays 2-color assays Enzymatic assays 3-color assays

26 AID - Firmenprofil 1989 von Dr. Schoellhorn in Straßberg (Süd-West Deutschland) gegründetes Unternehmen in Privatbesitz Der Fokus liegt auf der Entwicklung und Herstellung von in-vitrodiagnostika und Readersystemen für deren Auswertung als auch auf dem weltweiten Vertrieb der Produkte

27 AID - Produktpalette Immunoblots / Microarrays für den Nachweis verschiedenster Infektionskrankheiten Bsp. HPV MicroArray Molekularbiologische Testsysteme für den Nachweis von Infektionskrankheiten, Genetischer Mutationen und Antibiotika Resistenzen T-und B-Zell basierte Plattformen für die Verlaufskontrolle und die Bestimmung von Immunreaktionen bspw. nach Transplantationen, Impfungen und Infektionskrankheiten Zertifiziert nach DIN ISO und DIN ISO 9001

28 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit