Totalsynthese von Firefly-Luciferin

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1 Illumina-Chemie.de - Artikel Naturstoffsynthesen Totalsynthese von ((4S)-2-(6-hydroxy-1,3-benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid, D-Luciferin, (-)-Luciferin) Der Begriff Luciferin (vom lat. lucifer, Lichtbringer) bezeichnet verschiedene Naturstoffe, die in biolumineszenzten Organismen vorkommen und das chemilumineszente Substrat einer Biolumineszenz darstellen, deren Oxidation Licht emittiert. Das Chromophor, also das Luciferin, kann bei der Biolumineszenz in drei Formen vorkommen, zum einen als freies Luciferin, als Photoprotein I (Luciferin an katalytisches Protein gebunden) und als Photoprotein II (Luciferin an ein nicht-katalytisches Protein gebunden). Das für die Biolumineszenz erforderliche Enzym wird als Luciferase bezeichnet, wobei sich diese je nach Organismus unterscheiden kann. Das wohl besterforschte Luciferin ist das verschiedener Insektenarten (von z.b. Photinus pyralis), welches auch oft nur als D-Luciferin bezeichnet wird. Der Prozess der Biolumineszenz am Beispiel des D-Luciferins läuft folgendermaßen ab: Zunächst wird das Luciferin mit ATP unter katalytischem Einfluss von Mg2+ und Luciferase zum gemischten Anhydrid von Luciferin und Adenosinmonophosphat umgesetzt: Es bildet sich ein Hydroperoxid: Dieses reagiert unter Abspaltung von Adenosinmonophosphat weiter zu einem Dioxetanon: Das Dioxetanon hinterlässt nach Abgabe von CO2 Oxyluziferin im angeregten Zustand: Dieses kehrt unter Abgabe grünen Lichts in den Grundzustand zurück: 1 von 19

2 (Quelle: Wikipedia) D-Luciferin wurde 1949 erstmals isoliert und es wurde nach einem totalsynthetischen Zugang gesucht. Im letzten Schritt bietet sich zur Synthese des richtigen Enantiomers D-Luciferin eine Umsetzung eines Nitrils mit D-Cystein an; weshalb dieser letzte Schritt bei allen gängigen Syntheserouten gleich ist. Die Schwierigkeit liegt in der Synthese des 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazols, welches auf verschiedene Wege zugänglich ist. Eine neue Methode stellt dabei eine milde Thiolierung von p-anisidin und 2-Chloracetamid dar. Geräte: diverse Bechergläser und Kolben, Thermometer, Magnetheizrührer mit Ölbad (ggf. Sand- oder Metallbad bis 220 C), Rückflusskühler, Möglichkeit zur Vakuumfiltration, Schutzgasanlage, optional: Rotationsverdampfer Chemikalien: p-anisidin (N, T, Xn) Schwefel (Xi) 2 von 19

3 Triethylamin (C, F, T) 2-Chloracetamid (T, Xn) N,N-Dimethylformamid (F, Xi, Xn) Natriumhydroxid (C) Kaliumhexacyanoferrat(III) Phosphoroxychlorid (C, T, Xn) Natriumhydrogencarbonat Pyridinhydrochlorid (Xi) Natriumsulfat D-Cystein (Xi) Salzsäure (2 M) (C, Xi) 2-(4-Methoxyphenylamino)-2-thiooxoacetamid (?) <img src="images/hazard/qm.png" title="unbekannt"> 3 von 19

4 D-Luciferin (?) <img src="images/hazard/qm.png" title="unbekannt"> Hinweis: Bei der Cyclisierung mit rotem Blutlaugensalz entstehen übelriechende Gase, ein gutziehender Abzug wird empfohlen. Vorsicht beim Umgang mit Phosphoroxychlorid. Durchführung: 2-(4-Methoxyphenylamino)-2-thiooxoacetamid (Thioamid) Zu einer Mischung von 3,69 g p-anisidin, 1,92 g Schwefel und 4,8 ml Triethylamin in 60 ml Dimethylformamid werden in kleinen Portionen 3,08 g 2-Chloracetamid zugegeben, sodass die Temperatur nicht über 30 C (maximal 40 C!) steigt (falls die Lösung durch das Lösen des p-anisidins noch kalt ist tritt die Erwärmung bei der Zugabe des Chloracetamids eventuell verzögert und heftig ein). Die Mischung wird für 8 h gerührt, in 600 ml kaltes Wasser gegeben und der entstandene Niederschlag abgesaugt. Ausbeute: 4,1 g (65 % d. Th. Das Produkt enthält aber noch Schwefel, der erst im nächsten Reaktionsschritt abgetrennt wird.) 6-Methoxybenzothiazol-2-carboxamid (Amid) 3,7 g Natriumhydroxid werden in 33,3 ml Wasser gelöst und 3,11 g des Thioamids zugegeben. Nach wenigen Minuten Rühren wird die trübe Lösung filtriert und somit vom Schwefel getrennt. Das Filtrat wird langsam zu einer Lösung von 14,6 g Kaliumhexacyanoferrat(III) in 111 ml Wasser getropft und nach der Zugabe 60 Minuten gerührt. Der Niederschlag wird filtriert, mit Wasser gewaschen bis das Filtrat farblos ist und anschließend im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,86 g (60 % d.th.) 6-Methoxybenzothiazol-2-carbonitril (Methoxy-Nitril) 4 von 19

5 4,37 g des Amids werden in 150 ml DMF gelöst und auf 5 C gekühlt. Dazu werden 4 ml Phosphoroxychlorid gegeben, so dass die Temperatur nicht über 10 C steigt. Es wird anschließend für 2 h bei Raumtemperatur gerührt und die Mischung danach in 500 ml Eiswasser gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen (es kann aus Hexan oder Heptan umkristallisiert werden) und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 2,83 g (71 % d.th.) 6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonitril (Hydroxy-Nitril) 5 g Pyridinhydrochlorid werden im Vakuum getrocknet und unter Argon geschmolzen. Zur Schmelze werden 500 mg des Methoxy-Nitrils gegeben, die Mischung unter Rühren und Schutzgas für 3 h bei 220 C gehalten und über Nacht stehen gelassen. Der dunkle Rückstand wird in Wasser aufgenommen und mit Toluol extrahiert (4 x 50 ml, die organische Phase fluoresziert blau), über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen und das Produkt im Vakuum getrocknet. Ausbeute: ca. 200 mg (ca. 43 % d.th.) D-Luciferin Es werden 110 mg D-Cystein in 2 ml Wasser gelöst und die Lösung mit einer Lösung aus 0,17 g Natriumhydroxid in 1 ml Wasser alkalisch eingestellt. Nach dem Desoxygenieren der Lösung wird das Reaktionsgefäß mit Alufolie umwickelt um die Lösung vor Lichteinwirkung zu schützen. Anschließend werden 120 mg des Hydroxy-Nitrils in 4,5 ml Methanol zugegeben, die Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 2 M Salzsäure auf ph 2,5 eingestellt und für mindestens 20 Stunden im Kühlschrank stehen gelassen. Der Niederschlag wird filtriert und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt ist für Chemolumineszenzversuche ausreichend rein, dennoch sind zu diesem Zeitpunkt noch Verunreinigungen enthalten, die säulenchromatographisch abgetrennt werden sollten. Das nach der chromatographischen Reinigung erhaltene Produkt weist ein Absorptionsmaximum bei λ = 327 nm auf, was der Literaturangabe entspricht. Ausbeute: 70 mg (36 % d.th., overall: 4,28 %) Entsorgung: Die Lösungsmittel werden entsprechend den organischen Lösungsmittelabfällen zugeführt. Da bei dieser Synthese eine größere Menge kontaminierter wässriger Abfälle entstehen, habe ich diese extra gesammelt. Artikel im Web: Das Produkt wird aufgehoben dem am organischen Copyright illumina-chemie.de, Autor: NI2, oder Geschrieben Feststoffabfall zugeführt. 5 von 19

6 Erklärung: Der Schlüsselschritt dieser Syntheseroute ist das einstufige Erreichen des Thioamids. Ausgehend von diesem sind seit einiger Zeit Syntheserouten bekannt, jedoch war das Thioamid zuvor zu schwer zugänglich. Mit dem 2012 veröffentlichten Paper (siehe Quelle) wurde eine einfache, schnelle und vor allem technische kostengünstige Methode zur Synthese der substituierten Benzothiazol-2-carbonitrile entwickelt. Das so entstandene Thioamid wird mit rotem Blutlaugensalz oxidativ cyclisiert und das resultierende Säureamid mit Phosphoroxychlorid zum Nitril umgesetzt und anschließend entschützt. Das Hydroxy-Nitril reagiert mit D-Cystein zum gewünschten Enantiomer des Luciferins - dem D-Luciferin. Das so gewonnene Luciferin eignet sich bereits für Chemilumineszenz-Versuche (in DMF mit DBU), dabei entsteht jedoch nur ein kurzes schwaches Leuchten, welches schwer zu fotografieren ist, da man das Gefäß regelmäßig schütteln muss um ein anhaltendes Leuchten zu erhalten. Die Lösung fluoresziert danach nicht mehr grün sondern grün-gelb-orange und verfärbt sich orange-braun. Die Chemilumineszenz konnte beim gereinigten Produkt bisher jedoch nicht beobachtet werden. Eine Aufreinigung der einzelnen Stufen wäre sinnvoll um ein reineres Produkt zu erhalten, diese gestaltet sich jedoch teilweise schwieriger als angenommen, deshalb sind die Stoffe dunkler als die entsprechenden Reinstoffe. Bilder: 6 von 19

7 Vorgelegter Schwefel mit p-anisidin Lösung der Edukte vor Zugabe des Triethylamins 7 von 19

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10 Reaktionsfortschritt nach Zugabe aller Edukte 10 von 19

11 Gebildeter Niederschlag des Thioamids Kristalle des reinen Thioamids 11 von 19

12 Umkristallisiertes Thioamid 12 von 19

13 Zugabe des Thioamides zum Blutlaugensalz 13 von 19

14 Reaktion des Amides mit Phosphoroxychlorid 14 von 19

15 Isoliertes Methoxy-Nitril Fluoreszenz des Hydroxy-Nitril-Extraktes in Toluol 15 von 19

16 Cystein-Lösung Ausfallendes Luciferin 16 von 19

17 Abfiltriertes Produkt (Rohluciferin) D-Luciferin nach säulenchromatografischer Reinigung 17 von 19

18 Übersicht über die einzelnen Stufen Fluoreszenz des Rohluciferins im Sauren, Neutralen (DMF, durch Verunreinigungen) und Basischen. 18 von 19

19 Fluoreszenz der Lösung nach einem Chemilumineszenz-Versuch Danke an Cyanwasserstoff für die UV/VIS-Messung. Quelle: - H. Würfel, D. Weiss, R. Beckert, A. Güther - A new application of the mild thiolation concept for an efficient three-step synthesis of 2-cyanobenzothiazoles: a new approach to Firefly-luciferin precursors, J. of Sulfur Chemistry 2012, 33, Corinne Farace, B. Blanchot, D. Champiat, P. Couble, G. Declercq, J.-L. Millet - Synthesis and Characterization of a New Substrate of Photinus pyralis Luciferase: 4-Methyl-D-Luciferin, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1990, 28, von 19