2.1 Averys sensationelle Entdeckung: DNA kann genetische Information übertragen Auch virale Gene sind Nucleinsäuren...

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2 Vorwort zur amerikanischen Auflage XXXI Der Aufbau dieses Buches... XXXI Neue Kapitel und Hintergrundinformationen... XXXII Zusätzliche Materialien... XXXII Über die Autoren Über die Fachlektoren Vorwort zur ersten deutschen Ausgabe XXXV XXXVI XXXVII TEIL I Chemie und Genetik 1 Kapitel 1 Das Mendel sche Weltbild Mendels Entdeckungen Prinzip der unabhängigen Segregation Erste Mendel sche Regel Manche Allele sind weder dominant noch rezessiv Prinzip der unabhängigen Verteilung Zweite Mendel sche Regel Die Chromosomentheorie der Vererbung Genkopplung und Crossing-over Chromosomenkartierung Der Ursprung der genetischen Variabilität durch Mutationen Frühe Spekulationen über das Wesen der Gene und ihre Funktionsweise Erste Versuche zur Identifizierung einer Gen / Protein-Beziehung Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 2 Nucleinsäuren als Träger der genetischen Information Averys sensationelle Entdeckung: DNA kann genetische Information übertragen Auch virale Gene sind Nucleinsäuren Die Doppelhelix Die Entdeckung der Polymerasen, die DNA synthetisieren Experimentelle Belege für eine Strangseparation während der DNA- Replikation Die genetische Information in der DNA ist in der Sequenz der Nucleotide gespeichert Die DNA kann nicht die unmittelbare Matrize bei der Translation sein RNA und DNA sind chemisch sehr ähnlich Das Zentrale Dogma Die Adapterhypothese von Crick Die Entdeckung der Transfer-RNA Das Paradoxon der scheinbar unspezifischen Ribosomen Die Entdeckung der Messenger-RNA (mrna) VII

3 2.4.5 Die enzymatische Synthese von RNA an DNA-Matrizen Aufklärung des genetischen Codes Ermittlung der Richtung der Proteinbiosynthese Die DNA enthält auch Start- und Stoppsignale Das Zeitalter der Genomik Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 3 Die Bedeutung der schwachen chemischen Wechselwirkungen Merkmale chemischer Bindungen Chemische Bindungen können quantenmechanisch beschrieben 52 werden Die Bildung chemischer Bindungen ist mit der Umwandlung von Energie verbunden Das chemische Gleichgewicht Die Freie Enthalpie K Gl steht in exponentieller Beziehung zu G ' Kovalente Bindungen sind sehr stark Schwache Bindungen in biologischen Systemen Die Bindungsenergien schwacher Bindungen Bei physiologischen Temperaturen werden ständig schwache Bindungen gebildet und gespalten Unterscheidung zwischen polaren und unpolaren Molekülen Van-der-Waals-Kräfte Wasserstoffbrückenbindungen Überlagerung von ionischen Bindungen und Wasserstoffbrücken Schwache Wechselwirkungen erfordern komplementäre molekulare Oberflächen Wassermoleküle bilden untereinander Wasserstoffbrücken Schwache Bindungen zwischen Molekülen in wässrigen Lösungen Organische Moleküle, Wasserstoffbrücken und Wasserlöslichkeit Stabilisierung von makromolekularen Strukturen durch hydrophobe Wechselwirkungen Der Vorteil von kleinen G-Werten zwischen 8 und 20 kj mol Schwache Wechselwirkungen bei der Bindung von Substraten an Enzyme Schwache Bindungen vermitteln die meisten Protein / DNA- und Protein / Protein-Wechselwirkungen Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 4 Die Bedeutung energiereicher Bindungen Energiereiche Moleküle und thermodynamische Stabilität Enzyme senken die Aktivierungsenergie biochemischer Reaktionen Die Freie Enthalpie in Biomolekülen Die Hydrolyse energiereicher Bindungen ist mit einer großen Freien Reaktionsenthalpie verbunden VIII

4 4.4 Energiereiche Bindungen in Biosynthesereaktionen Peptidbindungen werden spontan hydrolysiert Kopplung von endergonischen mit exergonischen Reaktionen Aktivierung von Vorstufen für Gruppenübertragungs reaktionen Die Vielseitigkeit von ATP in Gruppenübertragungsreaktionen Aktivierung von Aminosäuren durch die Verknüpfung mit AMP Nucleinsäurevorläufer werden durch Pyrophosphorylgruppen aktiviert Die Bedeutung von Pyrophosphat in der Nucleinsäurebiosynthese Viele biosynthetische Reaktionen sind mit der Hydrolyse von Pyrophosphat gekoppelt Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 5 Schwache und starke Bindungen bestimmen makromolekulare Strukturen 89 Strukturen höherer Ordnung werden durch intra- und intermolekulare Wechselwirkungen bestimmt DNA kann eine regelmäßige Helix bilden RNA bildet eine breite Vielfalt von Strukturen Chemische Merkmale der Aminosäuren als Bausteine der Proteine Die Peptidbindung Die vier Organisationsebenen der Proteinstruktur α-helices und β-faltblätter sind die häufigsten Sekundärstrukturen Die spezifische Konfor mation eines Proteins resultiert aus seinem Wasserstoffbrückenmuster α-helices bilden gemeinsam Coiled Coils Die meisten Proteine sind modular aus zwei oder drei Domänen aufgebaut Die Anzahl struktureller Motive in Proteindomänen ist erstaunlich 103 gering Verschiedene Proteinfunktionen resultieren aus unterschiedlichen Kombinationen von Domänen Schwache Bindungen sorgen für eine korrekte Positionierung von Proteinen an DNA- und RNA-Molekülen Proteine wandern an der DNA entlang, um ihre spezifischen Bindungsstellen zu finden Verschiedene Strategien zur Erkennung von RNA-Sequenzen durch Proteine Allosterie: Regulation der Aktivität und Funktion von Proteinen durch Änderung ihrer Gestalt Beispiele für die allosterische Regulation durch kleine Liganden, Protein / Protein-Wechselwirkungen und enzymatische Modifizierung Nicht jede Regulation von Proteinen wird durch allosterische Ereignisse vermittelt Zusammenfassung Literaturhinweise IX

5 TEIL II Erhaltung des Genoms 119 Kapitel 6 Die Strukturen von DNA und RNA DNA-Struktur DNA besteht aus Polynucleotidketten Jede der Basen kommt bevorzugt in nur einer ihrer tautomeren Formen vor Die beiden Stränge der Doppel helix verlaufen antiparallel und werden durch Basenpaarungen zusammengehalten Die beiden Stränge der Doppelhelix besitzen komplementäre Sequenzen Bedeutung der Wasserstoff brücken für die Spezifität der Basenpaarungen Basen können aus der Doppel helix herausgeklappt werden Die DNA-Doppelhelix ist normalerweise rechtsgängig Die DNA-Doppelhelix besitzt eine große und eine kleine Furche Die große Furche enthält viele chemische Informationen Die DNA-Doppelhelix kommt in mehreren Konformationen vor Manchmal kommt DNA als linksgängige Doppelhelix vor DNA-Stränge können sich trennen (denaturieren) und wieder assoziieren (renaturieren) Viele DNA-Moleküle sind ringförmig DNA-Topologie Die Verwindungszahl ist eine unveränderliche topologische Eigenschaft 143 kovalent geschlossener, ringförmiger DNA Die Verwindungszahl setzt sich aus der helikalen und der superhelikalen Windungszahl zusammen Lk O ist die Verwindungszahl vollständig entspannter cccdna unter physiologischen Bedingungen DNA in Zellen ist negativ superspiralisiert In Eukaryonten erzeugen Nucleosomen negative Supercoils Topoisomerasen können die Relaxation superspiralisierter DNA katalysieren Prokaryonten besitzen eine spezielle Topoisomerase, die superhelikale Windungen in DNA einführt Toposiomerasen entknoten und entwirren DNA-Moleküle Topoisomerasen bilden eine kovalente Protein / DNA-Verknüpfung im Verlauf des enzymatischen Mechanismus Topoisomerasen bilden molekulare Brücken und führen DNA- Abschnitte durch andere hindurch DNA-Topoisomere können durch Elektrophorese getrennt werden Ethidium-Ionen verursachen die Entwindung von DNA RNA-Struktur RNA enthält Ribose und Uracil und ist normalerweise einzelsträngig RNA-Ketten können durch Rückfaltung auf sich selbst lokale doppelhelikale Bereiche bilden, die der A-Form der DNA ähneln RNA-Moleküle können zu komplexen Tertiärstrukturen falten X

6 6.3.4 Einige RNAs sind Enzyme Das Hammerhead-Ribozym spaltet RNA durch die Bildung eines 2',3'-cyclischen Phosphats Ist das Leben aus einer RNA-Welt hervorgegangen? Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 7 Genomstruktur, Chromatin und Nucleosomen Genomsequenz und Chromosomenvielfalt Chromosomen können linear oder ringförmig sein Jede Zelle bewahrt eine charakteristische Anzahl von Chromosomen Genomgröße und Komplexität eines Organismus korrelieren auf den ersten Blick miteinander Das Genom von Escherichia coli besteht fast nur aus Genen Komplexere Organismen weisen geringere Gendichten auf Gene bilden nur einen kleinen Teil der eukaryotischen chromosomalen DNA Menschliche Intergen-DNA besteht hauptsächlich aus Repeats Duplikation und Segre gation von Chromosomen Zur Erhaltung bei der Zellteilung benötigen eukaryotische 177 Chromosomen Centromere, Telomere und Replikationsursprünge Duplikation und Segregation eukaryotischer Chromosomen erfolgen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus Die Struktur der Chromosomen ändert sich während der eukaryotischen Zellteilung Vermittlung von Kohäsion und Kondensation durch SMC-Proteine Die Mitose Erhalt der Chromosomenzahl Die Rolle der Gap-Phasen Die Meiose Reduktion der Chromosomenzahl Verschiedene Organisations ebenen der Chromosomen struktur unter dem Mikroskop Das Nucleosom Nucleosomen als grundlegende Strukturelemente der Chromosomen Histone sind kleine, positiv geladene Proteine Die molekulare Struktur des Nucleosoms Innerhalb eines Nucleosoms binden die Histone an charak teristische Bereiche der DNA Sequenzunspezifische Bindung der DNA durch Kernhistone Stabilisierung der DNA-Wicklung durch die Histonschwänze Negative Superhelizität durch Wicklung der DNA um den Histon-Kern Höhere Ebenen der Chromatinstruktur Heterochromatin und Euchromatin Das H1-Histon bindet haupt sächlich an die Verbindungs-DNA zwischen den Nucleosomen Nucleosomale DNA kann höher organisierte Strukturen ausbilden: das 30-nm-Chromatinfilament Die N-terminalen Histonschwänze sind für die Bildung des 30-nm- Filaments erforderlich XI

7 7.4.5 Weitere Verdichtung der DNA durch die Bildung großer Schleifen nucleosomaler DNA Histonvarianten verändern die Funktion der Nucleosomen Regulation der Chromatinstruktur Die Histon-Oktamer / DNA-Wechselwirkung besitzt einen dynamischen 207 Charakter Nucleosomen-Umlagerungs komplexe erleichtern die Verschiebung von Nucleosomen Spezifische Positionierung von Nucleosomen Änderungen der Chromatin-Zugänglichkeit durch Modifizierungen der N-terminalen Histonschwänze Spezielle Domänen in Nucleosomen-bindenden Proteinkomplexen erkennen modifizierte Histone Spezifische Enzyme für die Histonmodifizierungen Modifizierung und Umlagerung von Nucleosomen dienen gemeinsam zur Verbesserung der DNA-Zugänglichkeit Der Zusammenbau von Nucleosomen Nucleosomen werden unmittelbar nach der DNA-Replikation 219 zusammengebaut Für den Zusammenbau von Nucleosomen sind Histon-Chaperone erforderlich Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 8 Die Replikation der DNA Die Chemie der DNA-Synthese Für die DNA-Synthese sind Desoxynucleosidtriphosphate und 229 Primer:Matrize-Hybride erforderlich Die DNA-Synthese erfolgt durch Verlängerung des 3'-Endes des Primers Die Hydrolyse des Pyrophosphats ist die treibende Kraft der DNA- Synthese Der Mechanismus der DNA-Polymerase DNA-Polymerasen besitzen ein einzelnes aktives Zentrum zur Katalyse 231 der DNA-Synthese DNA-Polymerasen ähneln einer Hand, die das Primer:Matrize-Hybrid umfassen DNA-Polymerasen sind prozessive Enzyme Korrekturlesen neu synthetisierter DNA durch Exonucleasen Die Replikationsgabel Beide DNA-Stränge werden parallel an einer Replikationsgabel 244 synthetisiert Die Initiation der Synthese eines neuen DNA-Strangs erfordert einen RNA-Primer Zur Vollendung der DNA-Replikation müssen die RNA-Primer entfernt werden DNA-Helicasen entwinden die Doppelhelix unmittelbar vor der Replikationsgabel DNA-Helicase zieht einzel strängige DNA durch eine zentrale Pore XII

8 8.3.6 Einzelstrangbindeproteine stabilisieren ssdna direkt vor der Replikation Topoisomerasen entfernen Supercoilings, die durch die Entwindung an der Replikationsgabel entstehen Enzyme an der Replikationsgabel erweitern die Bandbreite von Substraten für DNA-Polymerasen Die Spezialisierung von DNA-Polymerasen DNA-Polymerasen sind auf verschiedene Rollen in der Zelle 254 spezialisiert Sliding Clamps erhöhen die Prozessivität von DNA-Polymerasen dramatisch Sliding Clamps werden durch Clamp Loader geöffnet und auf die DNA gesetzt Die DNA-Synthese an der Replikationsgabel Das Replisom von Escherichia coli Die Initiation der DNA-Replikation Spezifische genomische DNA-Sequenzen steuern die Initiation der 266 DNA-Replikation Das Replikon-Modell der Initiation der Replikation Replikatorsequenzen beinhalten Initiator-Bindungsstellen und leicht entwindbare DNA Bindung und Entwindung: Selektion und Aktivierung des Replikationsursprungs durch den Initiator Protein / Protein- und Protein / DNA-Wechselwirkungen steuern den Initiationsprozess Eukaryotische Chromosomen werden jeweils genau einmal pro Zellzyklus repliziert Die Bildung des präreplikativen Komplexes ist der erste Schritt der Initiation der Replikation in Eukaryonten Regulation der Bildung und Aktivierung der prä-rcs zur Kontrolle der Replikation während des Zellzyklus Parallelen zwischen der eukaryo tischen und der prokaryotischen Replikationsinitiation Der Abschluss der Replikation Typ-II-Topoisomerasen trennen verkettete ringförmige DNA- 284 Tochtermoleküle Die normale Folgestrangsynthese ist an den äußersten Enden linearer Chromosomen nicht möglich Die Telomerase ist eine neue DNA-Polymerase, die keine exogene Matrize benötigt Telomerase löst das Endreplikationsproblem durch die Verlängerung der 3'-Enden der Chromosomen Telomerbindeproteine regulieren die Telomerase-Aktivität und die Länge der Telomere Telomerbindeproteine schützen die Enden von Chromosomen Zusammenfassung Literaturhinweise XIII

9 Kapitel 9 Die Mutabilität und Reparatur der DNA Replikationsfehler und ihre Reparatur Die Natur von Mutationen Einige Replikationfehler entgehen der Korrekturleseaktivität Durch eine Fehlpaarungs reparatur werden Fehler behoben, die der Korrekturlese aktivität entgangen sind DNA-Schäden Hydrolyse und Desaminierung führen zu spontanen DNA-Schäden DNA-Schäden durch Alkylierung, Oxidation und Strahlung Mutationen können durch Basenanaloga und interkalierende Reagenzien verursacht werden Reparatur von DNA-Schäden Direkte Reparatur von DNA-Schäden Basenexzisionsreparatur-Enzyme entfernen schadhafte Basen durch einen Base-Flipping-Mechanismus Nucleotidexzisionsreparatur-Enzyme spalten den beschädigten DNA- Strang auf beiden Seiten des Schadens Reparatur von DNA-Brüchen durch Rekombination mithilfe der Sequenzinformation unbeschädigter DNA-Kopien DSBs können auch durch die direkte Verknüpfung der Bruchenden repariert werden Die Transläsions-DNA-Synthese ermöglicht die Replikation über DNA- Schäden hinweg Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 10 Die homologe Rekombination auf molekularer Ebene DNA-Doppelstrangbrüche sind häufig und initiieren die homologe Rekombination Modell der homologen Rekombination Die Stranginvasion ist ein früher Schlüsselschritt der homologen 325 Rekombination Die Auflösung der Holliday-Kreuzung ist ein Schlüsselschritt zur Vollendung des genetischen Austausches Das Doppelstrangbruchreparatur-Modell beschreibt viele Rekombinationsereignisse Proteinmaschinen der homologen Rekombination Die RecBCD-Helicase / Nuclease bereitet DNA-Doppelstrangbrüche 334 für die Rekombination vor Chi-Sequenzen kontrollieren RecBCD RecA-Proteine assoziieren mit einzelsträngiger DNA und fördern die Stranginvasion Neue Basenpaarungen zwischen Partnersträngen werden innerhalb des RecA-Filaments etabliert RecA-Homologe kommen in allen Organismen vor Der RuvAB-Komplex erkennt Holliday-Kreuzungen und treibt die Wanderung des Verzweigungspunkts an XIV

10 RuvC spaltet zum Abschluss der Rekombination spezifisch DNA- Stränge an der Holliday-Kreuzung Die homologe Rekombi nation in Eukaryonten In Eukaryonten besitzt die homologe Rekombination zusätzliche 344 Funktionen Die homologe Rekombination ist für die Chromosomensegregation während der Meiose erforderlich Programmierte Erzeugung von Doppelstrangbrüchen in der DNA während der Meiose MRX-Proteine bereiten die Doppelstrangbruchenden auf die Assoziation mit RecA-ähnlichen Strangaustauschproteinen vor Dmc1 ist ein RecA-Homolog und spezifisch an der meiotischen Rekombination beteiligt Viele Proteine arbeiten zusammen, um die meiotische Rekombination zu ermöglichen Paarungstypwechsel Der Paarungstypwechsel wird durch einen sequenzspezifischen 350 Doppelstrangbruch initiiert Der Paarungstypwechsel ist eine Genkonversion und umfasst kein Crossing-over Genetische Folgen des Mechanismus der homologen Rekombination Genkonversion durch DNA-Reparatur während der Rekombination Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 11 Sequenzspezifische Rekombination und Transposition von DNA Konservative sequenzspezifische Rekombination (CSSR) Die sequenzspezifische Rekombination erfolgt an spezifischen DNA- 361 Sequenzen in der Ziel-DNA Sequenzspezifische Rekombinasen bilden ein kovalentes Protein / DNA- Zwischenprodukt Serin-Rekombinasen erzeugen DSBs in DNA und leiten die Rekombination durch den Austausch der Strangenden ein Die Struktur des Serin-Rekombinase / DNA-Komplexes deutet auf einen Strangaustausch durch die Rotation der Untereinheiten hin Tyrosin-Rekombinasen rekombinieren immer nur zwei DNA-Stränge gleichzeitig Strukturen von Tyrosin-Rekombinase / DNA-Komplexen offenbaren den Mechanismus des DNA-Austausches Biologische Rollen der sequenzspezifischen Rekombination Die λ-integrase fördert die Integration und Exzision eines viralen 370 Genoms Für die Exzision der λ-dna ist ein neues DNA-krümmendes Protein erforderlich Die Hin-Rekombinase invertiert ein DNA-Segment und ermöglicht die Expression alternativer Gene Die Hin-Rekombination benötigt einen DNA-Enhancer XV

11 Rekombinasen wandeln multimere ringförmige DNA-Moleküle in Monomere um Weitere Mechanismen, um die Rekombination zu spezifischen DNA- Segmenten zu lenken Transposition Einige genetische Elemente wechseln durch Transposition zu neuen 379 chromosomalen Positionen Es gibt drei Hauptklassen transponierbarer Elemente DNA-Transposons umfassen ein von Rekombinationsstellen flankiertes Transposase-Gen Autonome und nichtautonome Transposons Virus-ähnliche Retrotransposons und Retroviren enthalten termi nale Repeats und zwei für die Rekombination wichtige Gene Poly(A)-Retrotransposons DNA-Transposition durch einen nichtreplikativen Cut-and-Paste- Mechanismus Abschluss der Cut-and-Paste-Transposition durch die Reparatur der Lücke im Zwischenprodukt Es gibt mehrere Mechanismen zur Spaltung der nichttransferierten Stränge im Verlauf der DNA-Transposition DNA-Transposition durch einen replikativen Mechanismus Die Transposition Virus-ähnlicher Retrotransposons und Retroviren erfolgt über ein RNA-Zwischenprodukt DNA-Transposasen und retrovirale Integrasen sind Mitglieder der gleichen Protein-Superfamilie Die Transposition von Poly(A)-Retrotransposons erfolgt über einen reversen Spleißmechanismus Beispiele transponierbarer Elemente und ihrer Regulation Transposons der IS4-Familie sind kompakte Elemente mit mehreren 395 Mechanismen zur Kontrolle ihrer Kopienzahl Die Tn10-Transposition ist mit der zellulären DNA-Replikation gekoppelt Der Phage Mu ist ein äußerst stabiles Transposon Mu nutzt seine Zielimmunität zur Vermeidung der Transposition in seine eigene DNA Tc1 / Mariner-Elemente sind äußerst erfolgreiche DNA-Transposons in Eukaryonten Die Ty-Elemente der Hefen transponieren in sichere Häfen im Genom LINEs fördern ihre eigene Transposition und transponieren sogar zelluläre RNAs V(D)J-Rekombination Die frühen Schritte der V(D)J-Rekombination ähneln mechanistisch der 405 Exzision eines Transposons Zusammenfassung Literaturhinweise XVI

12 TEIL III Expression des Genoms 413 Kapitel 12 Mechanismen der Transkription RNA-Polymerasen und der Transkriptionszyklus RNA-Polymerasen treten in verschiedenen Formen auf, besitzen aber 421 viele gemeinsame Merkmale Die Transkription durch RNA-Polymerase verläuft in mehreren Schritten Die Initiation der Transkription umfasst drei definierte Schritte Der Transkriptionszyklus in Bakterien Bakterielle Promotoren variieren in Stärke und Sequenz, weisen aber 426 gemeinsame definierende Merkmale auf Der σ-faktor vermittelt die Bindung der Polymerase an den Promotor Strukturelle Veränderungen der RNA-Polymerase und der Promotor- DNA beim Übergang in den offenen Komplex Die RNA-Polymerase initiiert die Transkription ohne einen Primer Während der Transkriptions initiation bleibt die RNA-Polymerase stationär und zieht die stromabwärts liegende DNA in sich hinein Die Ablösung vom Promotor ist mit dem Bruch der Polymerase / Promotor- und Polymerase / σ-wechsel wirkungen verbunden Die elongierende RNA-Polymerase ist eine prozessive RNA- Synthesemaschine mit Korrekturleseaktivität Die RNA-Polymerase kann stecken bleiben und muss dann entfernt werden Die Termination der Transkription wird durch Signale in der RNA- Sequenz ausgelöst Die Transkription in Eukaryonten Der RNA-Polymerase-II-Kern promotor besteht aus Kombina tionen von 439 vier verschiedenen Sequenz elementen RNA-Polymerase II bildet am Promotor mit den allgemeinen Transkriptionsfaktoren einen Präinitiationskomplex Zur Ablösung vom Promotor muss zuvor die C-terminale Domäne der Polymerase phosphoryliert werden TBP bindet und verzerrt die DNA durch die Einlagerung eines β-faltblatts in die kleine Furche Auch die anderen allgemeinen Transkriptionsfaktoren spielen eine Rolle bei der Initiation In vivo erfordert die Initiation der Transkription weitere Proteine wie den Mediatorkomplex Der Mediatorkomplex besteht aus vielen Untereinheiten, von denen einige von der Hefe bis zum Menschen konserviert sind Ein weiterer Satz von Faktoren stimuliert die Elongation und das Korrekturlesen der RNA durch die RNA-Polymerase II Die elongierende RNA-Polymerase muss auf ihrem Weg Histone überwinden Elongierende RNA-Polymerasen sind bereits mit Faktoren für verschiedene Typen der RNA-Prozessierung assoziiert XVII

13 Die Termination der Transkription ist an den RNA-Abbau durch eine hochgradig prozessive RNase gekoppelt Transkription durch die RNA-Polymerase I und III RNA-Pol I und Pol III erkennen andere Promotoren, nutzen andere 455 Transkriptionsfaktoren, benötigen aber immer auch TBP Promotoren der Pol III liegen stromabwärts des Transkriptionsstartpunkts Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 13 Das Spleißen von RNA Die Chemie des RNA-Spleißens Sequenzen in der RNA bestimmen, wo ein Spleißvorgang stattfindet Introns werden in einer als Lasso bezeichneten Form entfernt und dabei die flankierenden Exons miteinander verknüpft Exons unterschiedlicher RNA-Moleküle können durch trans-spleißen miteinander fusioniert werden Die Maschinerie des Spleißosoms RNA-Spleißen wird von einem großen supramolekularen Komplex, 469 dem Spleißosom, durchgeführt Ablauf des RNA-Spleißens Zusammenlagerung, Umlagerungen und Katalyse durch das 470 Spleißosom: Der Ablauf des Spleißens Selbstspleißende Introns zeigen, dass RNA alleine die Spleißreaktion katalysieren kann Gruppe-I-Introns setzen anstelle eines Lassos ein lineares Intron frei Wie kann das Spleißosom verlässlich die Spleißstellen an der RNA finden? Eine kleine Gruppe von Introns wird von einem alternativen Spleißosom gespleißt, das aus einem abweichenden Satz von snrnps besteht Alternative Spleißvorgänge Ein einzelnes Gen kann durch alternatives Spleißen mehrere Produkte 479 hervorbringen Es existieren mehrere Mechanismen, die das wechselseitig ausschließende Spleißen garantieren Der ungewöhnliche Fall des Drosophila Dscam-Gens: Sich wechselseitig ausschließende Spleißvorgänge in großem Maßstab Die sich wechselseitig aus schließende Spleißreaktion des Exons 6 von Dscam lässt sich mit keinem der Standardmechanismen erklären und beruht auf einer neuartigen Strategie Das alternative Spleißen wird durch Aktivatoren und Repressoren reguliert Die Regulation des alternativen Spleißens ist bei Fliegen an der Geschlechtsfestlegung beteiligt Mischen von Exons: Exon-Shuffling Exons werden durch Rekombi nation vertauscht. Dabei werden Gene 490 erzeugt, die neue Proteine codieren XVIII

14 13.6 RNA-Editierung Die RNA-Editierung ist ein weiterer Weg, die Sequenz 495 einer mrna abzuändern Guide-RNAs dirigieren als Lotsen die Insertion und Deletion von Uridinresten mrna-transport Einmal prozessiert, wird die mrna verpackt und für die Translation 498 aus dem Zellkern in das Cytoplasma exportiert Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 14 Translation Messenger-RNA (= Boten-RNA; mrna) Die Sequenz der Polypeptidketten wird von offenen Leserahmen 505 festgelegt Prokaryotische mrnas besitzen Ribosomenbindungsstellen, die die Translationsmaschinerie rekrutieren Eukaryotische mrnas sind am 5'- und am 3'-Ende modifiziert, um die Translation zu erleichtern Transfer-RNA (trna) trnas sind Adaptoren, die zwischen Codons und Aminosäuren 508 vermitteln trnas haben eine gemeinsame Sekundärstruktur, die an ein Kleeblatt erinnert trnas besitzen eine L-förmige Tertiärstruktur Verknüpfung von Aminosäuren mit trnas Beladung der trna durch Ver knüpfung der Aminosäure mit dem 511 3'-terminalen Nucleotid mittels einer energiereichen Acyl-Bindung Aminoacyl-tRNA-Synthetasen beladen trnas in zwei Schritten Jede Aminoacyl-tRNA-Synthetase verknüpft nur eine Art von Aminosäure mit einer oder mehreren verschiedenen trnas Aminoacyl-tRNA-Synthetasen erkennen spezifische Merkmale einer trna Die Aminoacyl-tRNA-Bildung verläuft höchst präzise Manche Aminoacyl-tRNA-Synthetasen benutzen eine Editierungsstelle, um trnas mit hoher Genauigkeit zu beladen Das Ribosom ist unfähig, zwischen korrekt und unkorrekt beladenen Aminoacyl-tRNAs zu unterscheiden Das Ribosom Ribosomen bestehen aus einer großen und einer kleinen Untereinheit Die große und die kleine ribosomale Untereinheit assoziieren erst und dissoziieren wieder im Verlauf jeder Translation Neue Aminoacylreste werden an den Carboxyterminus der wachsenden Polypeptidkette angeknüpft Peptidbindungen bilden sich beim Transfer der Polypeptidkette von einer trna auf die nächstfolgende Ribosomale RNAs (rrnas) sind sowohl strukturgebende als auch katalytisch aktive Bestandteile des Ribosoms XIX

15 Das Ribosom hat drei trna-bindungsstellen Durch das Ribosom verlaufende Kanäle ermöglichen der mrna den Durch- und der Polypeptidkette den Austritt aus dem Ribosom Initiation der Translation Prokaryotische mrnas werden durch Basenpaarung mit der rrna von 525 der kleinen Untereinheit des Ribosoms rekrutiert Eine spezielle, mit einem modifizierten Methionin beladene trna bindet direkt an die kleine Ribosomenuntereinheit von Prokaryonten Drei Initiationsfaktoren leiten die Zusammenlagerung des Initiationskomplexes an Eukaryotische Ribosomen werden durch die 5'-Cap der mrna rekrutiert Das Startcodon wird gefunden, indem die kleine Untereinheit die mrna vom 5'-Ende her entlangläuft Die Initiationsfaktoren der Translation halten die mrna zirkulär Elongation der Translation Aminoacyl-tRNAs werden vom Elongationsfaktor Tu (EF-Tu) zur 531 A-Stelle geleitet Das Ribosom nutzt mehrere Mechanismen, um falsche AminoacyltRNAs von der Translation auszuschließen Ribosomen sind Ribozyme Die Ausbildung der Peptidbin dung und der Elongationsfaktor EF-G treiben die Translokation der trna und der mrna an Elongationsfaktor G (EF-G) treibt die Translokation der an die A-Stelle gebundenen trna an EF-Tu GDP und EF-G GDP müssen ihr GDP gegen GTP austauschen, um erneut an einem Elongationsschritt teilnehmen zu können Eine Zyklus der Peptidbindungs bildung verbraucht zwei Mole küle GTP und ein Molekül ATP Termination der Translation Freisetzungsfaktoren beenden die Translation beim Erreichen eines 543 Stoppcodons Kurze Abschnitte von Klasse-I-Release-Faktoren erkennen Stoppcodons und lösen die Freisetzung der Peptidkette aus GDP / GTP-Austausch und GTP-Hydrolyse steuern die Funktion der Klasse-II-Release-Faktoren Der Ribosome Recycling Faktor (RRF) ahmt eine trna nach Regulation der Translation Protein- oder RNA-Bindung in der Nähe der Ribosomen bindungsstelle einer mrna ist ein negativer Regulator für die Translationsinitiation 549 bei Bakterien Regulation der prokaryotischen Translation: Ribosomale Proteine sind Repressoren ihrer eigenen Synthese Globale Regulatoren der eukaryotischen Translation Die räumliche Steuerung der Translation durch mrna-spezifische 4E-Bindeproteine Ein eisenreguliertes RNA-Bindungsprotein steuert die Translation des Ferritin-Gens XX

16 Die Proteinbiosynthese des Hefetranskriptionsaktivators Gcn4p wird durch kurze ORFs stromaufwärts und den ternären Komplex kontrolliert Translationsabhängige Regulation der Stabilität von Proteinen und mrna Die SsrA-RNA rettet Ribosomen, die unvollständige mrnas 561 translatieren Eukaryotische Zellen bauen mrnas ab, die unvollständig sind oder verfrühte Stoppcodons besitzen Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 15 Der genetische Code Der Code ist degeneriert Welche Ordnung lässt sich in der Struktur des Codes erkennen? Wobble-Anticodons Drei Codons signalisieren den Kettenabbruch Wie der Code geknackt wurde Stimulation des Aminosäureeinbaus durch synthetische mrnas Poly-U codiert Polyphenylalanin Gemischte Copolymere ließen weitere Codon-Zuordnungen zu Transfer-RNA-Bindung an definierte Trinucleotidcodons Codonzuordnung über Copolymere mit sich wieder holenden Nucleotideinheiten Drei Regeln, die den genetischen Code bestimmen Drei Arten von Punktmutationen verändern die Information, 579 die eine Nucleotidsequenz codiert Genetische Belege dafür, dass der genetische Code in Gruppen von drei Nucleotiden gelesen wird Suppressormutationen können im gleichen oder einem anderen Gen liegen Die intergenale Suppression beruht auf Mutanten-tRNAs Nonsensesuppressoren lesen auch normale Terminationssignale Nachweis der Gültigkeit des genetisches Codes Der genetische Code ist nahezu universell Zusammenfassung Literaturhinweise TEIL IV Regulation 589 Kapitel 16 Transkriptionelle Regulation in Prokaryonten Prinz ipien der transkrip tionellen Regulation Die Expression von Genen wird durch regulatorische Proteine 596 gesteuert Die meisten Aktivatoren und Repressoren wirken auf der Ebene der Transkriptionsinitiation Viele Promotoren werden durch Aktivatoren reguliert, die die RNA- Polymerase bei der Bindung an die DNA unterstützen, und durch Repressoren, die diese Bindung blockieren XXI

17 Manche Aktivatoren und Repressoren wirken durch Allosterie und regulieren Schritte der transkriptionellen Initiation nach der RNA- Polymerasebindung Fernwirkung und Schleifenbildung der DNA Kooperative Bindung und Allosterie spielen bei der Genregulation wichtige Rollen Antitermination und darüber hinaus: Nicht immer beruht die Genregulation auf der Kontrolle der transkriptionellen Initiation Regulation der Trans kriptions initiation: Bei spiele aus Prokaryonten Ein Aktivator und ein Repressor steuern gemeinschaftlich die lac-gene CAP und Lac-Repressor haben entgegengesetzte Wirkungen auf die Bindung der RNA-Polymerase an den lac-promotor CAP hat getrennte Aktivierungs- und DNA-Bindungsoberflächen CAP und Lac-Repressor binden mithilfe eines weit verbreiteten Strukturmotivs an die DNA Die Aktivität des Lac-Repressors und des CAP wird allosterisch durch Signalmoleküle reguliert Kombinatorische Kontrolle: CAP steuert auch noch andere Gene Alternative σ-faktoren leiten die RNA-Polymerase zu alternativen Promotorsätzen NtrC und MerR: Transkriptions aktivatoren, die ihre Wirkung durch Allosterie und nicht durch Rekrutierung entfalten NtrC ist eine ATPase und übt seine Wirkung gebunden an DNA- Sequenzen aus, die weit vom regulierten Gen entfernt liegen MerR aktiviert die Transkription durch Verwindung der Promotor-DNA Manche Repressoren fixieren die RNA-Polymerase am Promotor, statt sie durch eigene DNA-Bindung fern zu halten AraC und die Steuerung des arabad-operons durch Antiaktivierung Die Situation bei dem Bakteriophage λ: Mehrere Regulationsebenen Alternative Genexpressions muster führen zur lytischen oder lysogenen 616 Phagenvermehrung Regulatorproteine und ihre Bindungsstellen Der λ-repressor bindet in kooperativer Weise an den Operator λ-repressor und Cro binden unterschiedlich bei der Steuerung der lytischen und lysogenen Vermehrung Die Lysogeninduktion erfordert die Proteolyse des λ-repressors Die negative Autoregulation des λ-repressors erfordert Fernwechselwirkungen und eine große Schleifenbildung der DNA Cll, ein weiterer λ-aktivator, legt nach der Wirtszell-Infektion den lytischen oder lysogenen Vermehrungszyklus fest Die Anzahl der Phagen, die eine bestimmte Zelle infizieren, hat einen Einfluss auf den Vermehrungszyklus Die Wachstumsbedingungen von E. coli beeinflussen die Stabilität des CII-Proteins und damit den lytischen oder lysogenen Verlauf der Infektion Transkriptionelle Antitermi nation in der λ-vermehrung XXII

18 Retroregulation: Das Zusammenspiel von RNA-Synthese und Abbau bestimmt die Expression des int-gens Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 17 Transkriptionelle Regulation in Eukaryonten Konservierte Mechanismen der Transkriptions regulation von Hefen bis zu den Säugetieren Aktivatorproteine besitzen separate DNA-Bindungs- und Aktivierungsmodule Eukaryotische Regulatoren nutzen eine Reihe von DNA- Bindungsdomänen, doch folgt die DNA-Erkennung denselben Prinzipien wie bei Bakterien Aktivierende Bereiche sind keine wohldefinierten Strukturen Die Rekrutierung von Proteinkomplexen an die DNA durch eukaryotische Aktivatoren Aktivatoren lokalisieren den Transkriptionsapparat an zu transkribierende Gene Aktivatoren rekrutieren auch Nucleosom-Modifizierer, die die Promotorbindung und Initiation des Transkriptionsapparates unterstützen Aktivatoren rekrutieren weitere Faktoren, die an manchen Promotoren für eine effiziente Initiation oder Elongation benötigt werden Fernwirkungen: Schleifen und Isolatoren Die ordnungsgemäße Regulation einiger Gruppen von Genen hängt von Locuskontrollbereichen ab Signalintegration und kombinatorische Steuerung Aktivatoren arbeiten bei der Integration von Signalen synergistisch 654 zusammen Signalintegration: Das HO-Gen wird durch zwei Regulatoren gesteuert einer rekrutiert Nucleosom-Modifikatoren, der andere einen Mediator Signalintegration: Kooperative Bindung von Aktivatoren am β-interferongen des Menschen Die kombinatorische Steuerung ist die Basis der Komplexität und Diversität bei Eukaryonten Kombinatorische Steuerung der Paarungstypgene der Bäckerhefe Transkriptionsrepressoren Signaltransduktion und die Steuerung von Transkriptionsregulatoren Signale werden oft über Signaltransduktionswege an Transkriptionsregulatoren übermittelt Signale steuern die Aktivitäten eukaryotischer Transkriptionsregulatoren auf vielfältige Weise Aktivatoren und Repressoren sind manchmal fragmentiert Gen-Stillegung oder Abschaltung durch Modifikation der Histone und der DNA In Hefezellen wird die Gen stilllegung durch Deacetylierung und 669 Methylierung der Histone bewirkt XXIII

19 In Drosophila-Zellen erkennt HP1 methylierte Histone und kondensiert das Chromatin In Säugetierzellen geht die Stilllegung von Genen mit der Methylierung der DNA einher Epigenetische Genregulation Manche Expressionszustände von Genen werden bei der Zellteilung weitervererbt, auch wenn das auslösende Signal gar nicht mehr 674 einwirkt Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 18 Regulatorische RNAs Regulation durch RNAs in Bakterien Riboswitches sind Teil der Transkripte, deren Expression sie durch 688 Änderung der Sekundärstruktur steuern RNA-Interferenz als ein Hauptmechanismus der Regulation in Eukaryonten Kurze RNAs, die die Geneexpres sion abschalten, haben verschie dene 695 Ursprünge, erreichen aber die Stilllegung auf drei Wegen Synthese und Funktion von mirna-molekülen mirnas besitzen eine charakteristische Struktur, die ihre und die 698 Identifizierung ihrer Zielgene unterstützt Eine aktive mirna entsteht durch nucleolytische Prozessierung in zwei Schritten Dicer ist das zweite RNA-spaltende Enzym während der mirna-reifung Der Einbau einer Guide-RNA in den RISC ergibt erst den vollständigen Komplex, der bereit ist, die Genexpression stillzulegen sirnas sind regulatorische Ribonucleinsäuren, die aus langen, doppelsträngigen RNAs gebildet werden Kleine RNAs können Gene auch durch Auslösen einer Chromatin- Modifizierung und Umbildung transkriptionell stilllegen Evolution und Anwendung von RNAi Hat sich die RNA-Interferenz als Teil des Immunsystems evolviert? Die RNA-Interferenz hat sich zu einem leistungsstarken Hilfsmittel für die Veränderung der Genexpression entwickelt Regulatorische RNAs und X-Chromosom inaktivierung Inaktivierung des X-Chromosoms erzeugt Mosaikindividuen Xist ist eine Regulator-RNA, die in den Zellen weiblicher Säugetiere eines der X-Chromosomen inaktiviert Zusammenfassung Literaturhinweise Kapitel 19 Genregulation in Entwicklung und Evolution Drei Strategien zur Expression entwicklungs spezifischer Gensätze Einige mrnas werden in Eizellen und Embryonen infolge einer intrinsischen Polarität des Cytoskeletts in bestimmten Regionen 722 positioniert XXIV

20 Zell / Zell-Kontakte und sezer nierte Signalstoffe rufen Ver änderungen der Genexpression in benachbarten Zellen hervor Gradienten sezernierter Boten stoffe können Zellen anweisen, in Abhängigkeit ihrer Position im Körper unterschiedliche Entwicklungswege einzuschlagen Beispiele für die drei Strategien zur Etablierung differenzieller Genexpression Der lokalisierte Repressor Ash1 von Hefezellen legt durch Stilllegung 726 des HO-Gens den Paarungstyp fest Eine lokalisierte mrna initiiert die Differenzierung von Muskeln im Seescheidenembryo Zell / Zell-Kontakte rufen bei dem sporenbildenden Bakterium Bacillus subtilis eine differenzielle Genexpression hervor Die Notch-Signaltransduktion kontrolliert einen regulatorischen Schalter zur Bildung von Haut- oder Neuralgewebe im Zentralnervensystem von Insekten Ein Gradient des Morphogens Sonic hedgehog steuert die Bildung unterschiedlicher Neuronen im Neuralrohr von Wirbeltieren Die molekulare Embryo genese bei Drosophila Kurze Übersicht über die Embryogenese bei Drosophila sp Ein Morphogengradient steuert die dorsoventrale Musterbildung im Drosophila-Embryo Die Segmentierung wird durch lokalisierte RNAs am anterioren und posterioren Zellpol des unbefruchteten Eis initiiert Bicoid und Nanos regulieren hunchback Der Gradient des Repressors Hunchback etabliert verschiedene Grenzen der Expression von Lückengenen Hunchback und Lückenproteine erzeugen segmentale Streifen der Genexpression Gradienten des Repressors Gap erzeugen zahlreiche Genexpressionsstreifen Transkriptionsrepressoren mit kurzer Reichweite ermöglichen es verschiedenen Enhancern, im komplexen Regulationsbereich von eve unabhängig voneinander zu agieren Homöotische Gene: Eine wichtige Klasse von Entwicklungsregulatoren Veränderungen im Expressionsverhalten homöotischer Gene sind für 755 die Artenvielfalt der Gliederfüßler (Arthropoden) verantwortlich Gliederfüßler (Arthropoden) haben vielfältige Körpergestalten Veränderungen der Expression von Ubx erklären Umbildungen der Gliedmaßen von Krustentieren (Crustaceen) Warum Insekten am Hinterleib keine Gliedmaßen haben Flügelmodifikationen können durch die evolutionäre Änderung regulatorischer DNA-Sequenzen zustande kommen Zusammenfassung Literaturhinweise XXV

21 Kapitel 20 Genomik und Systembiologie Genomik eine kurze Übersicht Bioinformatische Hilfsmittel erleichtern die Suche nach 768 proteincodierenden Genen in Genomen Genomweite Tiling-Arrays zur Visualisierung des Transkriptoms Regulatorische DNA-Sequenzen lassen sich mit speziellen Vergleichsprogrammen identifizieren Die ChIP-Chip-Methode ist der beste Weg, um Enhancer zu identifizieren Unterschiedliche Tierarten weisen erstaunlich ähnliche Genausstattungen auf Viele Tiere enthalten ungewöhnliche Gene Syntenie ist ein evolutionär altes Charakteristikum Über Deep Sequencing wird den Ursprüngen des Menschen nachgespürt Molekulare Systembiologie Transkriptionsschaltkreise bestehen aus Knoten und Kanten Negative Autoregulation bewirkt Rauschunterdrückung und ermöglicht schnelle Reaktionszeiten Die Genexpression ist verrauscht Positive Autoregulation verzögert die Genexpression Manche Schalterelemente von Regelkreisen rasten in alter nativen stabilen Zuständen ein Positive Regelkreise sind Dreiknotennetze mit nützlichen Eigenschaften Positive Rückkopplungsschleifen in der ontogenetischen Entwicklung Manche Schaltkreise erzeugen oszillierende Genexpressionsmuster Synthetische Regelkreise imitieren einige der Eigenschaften natürlicher Regulationsnetzwerke Ausblick Zusammenfassung Literaturhinweise TEIL V Methoden 797 Kapitel 21 Methoden der Molekularbiologie Nucleinsäuren Gelelektrophorese trennt DNA- und RNA-Moleküle nach ihrer Größe Restriktions-Endonucleasen schneiden DNA-Moleküle an genau festgelegten Stellen Die DNA-Hybridisierung kann eingesetzt werden, um bestimmte DNA- Moleküle zu identifizieren Mit Hybridisierungssonden kann man elektrophoretisch getrennte DNA- und RNA-Spezies nachweisen Isolierung spezifischer DNA-Segmente DNA-Klonierung Die Klonierung von DNA in Vektor-Plasmide XXVI

22 Vektor-DNA kann durch Transformation in Wirtszellen eingeschleust werden DNA-Bibliotheken können durch Klonierung erzeugt werden Durch Hybridisierung lässt sich ein bestimmter Klon in einer DNA- Bibliothek nachweisen Chemische Oligonucleotidsynthese Die Polymerasekettenreaktion amplifiziert DNA durch wiederholte DNA-Replikation in vitro Gruppen partiell überlappender DNA-Fragmente ermöglichen es, eine durchgehende Nucleotidsequenz abzuleiten Schrotschuss-Sequenzierung eines Bakteriengenoms Die Schrotschuss-Strategie ermöglicht eine Teilassemblierung großer Genome Die Assemblierung großer Genome gelingt über den Vergleich der Endsequenzen verschiedener Fragment-Bibliotheken Das 1000-$-Humangenom ist in Sicht Proteine Aus Zellextrakten lassen sich gezielt bestimmte Proteine abtrennen 830 und reinigen Die Isolierung eines Proteins erfordert eine spezifische Nachweismöglichkeit Gewinnung von Zellextrakten, die aktive Proteine enthalten Proteintrennung durch Säulenchromatographie Die Affinitätschromatographie ermöglicht oft eine schnellere Proteinisolierung Proteintrennung in Polyacylamidgelen Antikörper ermöglichen den gezielten Proteinnachweis nach einer elektrophoretischen Trennung Proteinmoleküle sind sequenzierbar Proteomik Kopplung von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie 837 erlaubt den Nachweis einzelner Proteine in einem komplexen Extrakt Proteomvergleiche erlauben Unterschiede zwischen Zellen zu identifizieren Mit der Massenspektrometrie lassen sich auch Unterschiede in der Protein-Modifikation nachweisen Protein / Protein-Wechselwirkungen können Informa tionen über die Funktion der Proteine liefern Nucleinsäure / Protein-Wechselwirkungen Die elektrophoretische Mobilität eines DNA-Moleküls wird durch 842 Proteinbindung verändert DNA-gebundene Proteine schützen die DNA vor dem Angriff von Nucleasen und chemischer Modifikation Chromatinimmunopräzipitation kann die Protein-DNA-Bindung in Zellen nachweisen Die DNA- oder RNA-Bindungs stellen eines Proteins sind durch In-vitro-Selektion identifizierbar Literaturhinweise XXVII