Bestimmung von Enterobakterien

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1 Bestimmung von Enterobakterien von Mariella Sele, Nicole Rupp Studiengang CH09_BC Abgabedatum: 20. April

2 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung Aufgabenstellung Grobdifferenzierung Keim Makroskopische Charakteristika Mikroskopische Beobachtungen und Morphologie Physiologische Beobachtungen Kombination der Grobdifferenzierten Ergebnisse Grobdifferenzierung des Belebtschlammisolats B Makroskopische Charakteristika Mikroskopische Beobachtungen und Morphologie Physiologische Beobachtungen Kombination der Grobdifferenzierten Ergebnisse... Fehler! Textmarke nicht definiert. 5 Bunte Reihe LactaseTest IndolBildung UreaseTest TSI Zusammengefasste Resultate Identifikation mit Hilfe des ApiTestkits und MaldiTOF Vergleichen der Identifikationen Zusätzliche Test

3 1 Zusammenfassung Ein unbekannter Keim (Keim 3) wurde mittels einer Bunten Reihe, einem Api E20 und einer MALDI TOF Untersuchung als Proteus mirabilis identifiziert. Ein Klärschlammisolat (B7.4) wurde ebenfalls mit den gleichen Methoden als Routella terrigena identifiziert. 2 Einleitung Enterobakterien gehören zur natürlichen Darmflora des Menschen und stellen im Normalfall keine Gefahr dar. Diese Bakterien können auch zu schweren Infektionen führen, falls eine immungeschwächte Person in falschen Kontakt mit ihnen kommt. Zudem finden sich diese Keime im Klärschlamm und somit auch in durch Fäkalien verseuchten Gewässern. Die Identifikation dieser Keime besitzt daher einen grossen Stellenwert in der medizinischen Diagnostik und Qualitätsüberwachung von Gewässern. Über klassische Grobdifferenzierung sowie Nutzung der Bunten Reihe, API E20 TestKit und MALDITOF konnte ein Identifikationsszenario für zwei unbekannte Keime durchgespielt werden. Dabei konnte vor allem das Problem des unterschiedlichen Verhaltens von Bakterien in ihrer eigenen Gattung nachvollzogen werden. 3 Aufgabenstellung Ein, aus einer Auswahl von neun Enterobaktern zugeteilter Keim soll mit gängigen Methoden identifiziert werden. Dazu soll ausschliesslich mit klassischen Kultivierungsmethoden und einem Mikroskop gearbeitet werden. Zusätzlich sollen die gängigsten SchnellTests (als Beispiel: Katalase Test) kennengelernt werden. Im Voraus soll eine mögliche Strategie entwickelt werden um diesen Keim zu identifizieren und diese soll auf ihre Umsetzbarkeit überprüft werden. Unbekannte Keime Escherichia coli Enterobacter cloacae terrigena Citrobacter freundii Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Salmonella enteriditis Serratia marcescens Vibrio fluvialis 3

4 4 Grobdifferenzierung Keim Makroskopische Charakteristika Die unbekannte Kultur Keim 3 bildet auf einem Festmedium weit ausgebreitete, durch Rillen voneinander abgetrennte, flächige Kulturen und besitzt keine auffällige Färbung sondern liegt weissbeige vor. Einzelkulturen sind nicht wirklich ersichtlich. Bei einem StichAgar kann eine starke Bewegung um den Kanal beobachtet werden. Dies spricht für einen stark bewegten Keim. Im Flüssigmedium verteilt sich der Keim homogen in der Lösung. 4.2 Mikroskopische Beobachtungen und Morphologie Unter dem Mikroskop kann eine starke Beweglichkeit des Keims beobachtet werden. Zudem handelt es sich um stäbchenförmige Kulturen, um welche ein flimmernder Hof, welcher für eine Begeisselung spricht, existiert. Bei einer Gramfärbung wurden nur rote Bakterien gefunden. Dies spricht für einen Gram Negativen Keim. Abbildung 1 Photographie des Unbekannten Keims 4.3 Physiologische Beobachtungen Der durchgeführte Katalase Test fiel positiv aus. Die Kultur schäumte kräftig. Der unbekannte Keim ist daher in der Lage H2O2, H2O oder O2 zu spalten. Beim OxidaseTest konnte keine violette Verfärbung beobachtet werden. Der Keim besitzt somit kein Cytochrom c System. Über den OxidationFermentationTest mit Glucose konnte durch die gelbe Färbung ein oxidativer und fermentativer Abbau der Glucose nachgewiesen werden. Es handelt sich daher um einen fakultativen anaeroben Keim. 4.4 Kombination der Grobdifferenzierten Ergebnisse Durch Kombination des Verhaltens mit GramNegativ, Katalase positiv, Oxidation negativ und O/F fakultativ anaerob kann es sich nicht um Vibrio fluvialis oder Pseudomonas aeruginosa handeln. Diese beiden Keime verhalten sich Oxidation positiv. Zudem ist Pseudomonas aeruginosa beim O/FTest Aerob. 4

5 5 Grobdifferenzierung des Belebtschlammisolats B Makroskopische Charakteristika Die Probe B7.4 ist ein Isolat aus Belebtschlamm der Abwasserreinigung Wädenswil. Der Keim bildet leicht rötliche runde Kolonien. Bei einem StichAgar bildet sich keine Verteilung um den Einstich, was für einen unbewegten Keim spricht. Im Flüssigmedium verteilt sich der Keim homogen in der Lösung. 5.2 Mikroskopische Beobachtungen und Morphologie Unter dem Mikroskop kann beobachtet werden, dass der Keim wenig bis gar nicht beweglich ist. Bei der Gramfärbung wurde erwiesen, dass es sich um einen Gram negativen, stäbchenförmigen Keim handelt. Abbildung 2 Photographie des Klärschlammisolates B Physiologische Beobachtungen Der durchgeführte Katalase Test fiel positiv aus. Die Kultur schäumte allerdings nicht sehr kräftig. Der unbekannte Keim ist daher in der Lage H2O2, H2O oder O2 zu spalten. Beim OxidaseTest konnte keine violette Verfärbung beobachtet werden. Der Keim besitzt kein Cytochrom c System. Über den OxidationFermentationTest mit Glucose konnte ein fakultativ anaerobes Verhalten nachgewiesen werden, welches sich zudem mit einer starken Gasbildung sichtbar machte. Aufgrund des negativen OxidaseTests können Vibrio fluvialis und Pseudomonas aeruginosa ausgeschlossen werden. 5

6 6 Bunte Reihe 6.1 LactaseTest Durch Kultivierung auf einem mit Neutralrot versetzten MacConkey Agar kann LactoseAbbau nachgewiesen werden. Dabei verfärben sich die Kulturen und das Agar dunkelrot bei Säurebildung und Lactose Verwertung. Keim 3: negativ Isolat B7.4: negativ Beide Keime liessen den ph auf dem Agar steigen. Dadurch verfärbte sich die Nährplatte gelb. Somit können die Keime Escherichia coli, Enterobacter cloacae, aerogeneses und oxytoca, pneumoniae ausgeschlossen Abbildung 4 Keim3 Abbildung 4 Isolat B7.4 werden. 6.2 IndolBildung Verschiedene Keime können Tryptophan mit Wasser zu Indol, Pyruvat und Ammoniak abbauen. Mit der KovacsReagenz wird das Indol durch eine starke Rotfärbung nachgewiesen werden. Keim 3: negativ Isolat B7.4: negativ Dadurch scheiden Escherichia coli, oxytoca und Proteus vulgaris aus. Abbildung 5 Links Isolat B7.4, rechts Keim3 beobachtbar ist keine Rotfärbung Abbildung 6 Links Isolat B7.4 rechts Keim3 beobachtbar ist eine intensive pink Färbung bei Keim3 6.3 UreaseTest Durch das Enzym Urease wird Harnstoff gespalten. Dabei entsteht Ammoniak wobei der phwert erhöht wird und der Indikator Phenolrot auf kräftiges Pink umschlägt. ProteusArten spalten den Harnstoff sehr schnell. Keim 3: Isolat B7.4: positiv negativ Durch den eindeutig positiven UreaseTest des Keims 3 könnte auf Proteus mirabilis rückgeschlossen werden. Beim Klärschlammisolat können ProteusArten aufgrund des negativen Ergebnisses ausgeschlossen werden. 6

7 6.4 TSI Mittels des TSIAgars kann zwischen fermentierenden und schwefelreduzierenden Enterobakterien differenziert werden. Das Nähragar enthält dabei den Indikator Phenolrot sowie die drei Zucker Glucose, Lactose und Saccharose. Zudem kann der Abbau von Thiosulfat zu Sulfid über Ausfällung von schwarzem Eisensulfat nachgewiesen werden. Keim 3: Baut nur Glucose ab, Bildet FeSO 4 Isolat B7.4: Baut Glucose und Lactose oder Saccharose ab, Bildet Abbildung 7 Links Isolat B.7.4 rechts Keim3 kein FeSO 4 Durch die Bildung von FeSO 4 können für Keim 3 Proteus mirabilis, Salmonella, Citrobacter freundii oder Proteus vulgaris in Frage kommen. Beim unbekannten Isolat könnte es sich um Escherichia coli, Enterobacter, Serratia, Providencia, Shigella, Morganella oder Klebsiealla handeln. 6.5 Zusammengefasste Resultate Test Ergebnis Keim3 Ergebnis Isolat B7.4 LactaseTest IndolTest UreaseTest TSI Nur Glucose Glucose, Lactose oder Saccharose TSI FeSO 4 Kein FeSO 4 Aus diesen Ergebnissen kann für Keim 3 auf Proteus mirabilis geschlossen werden. Beim Isolat könnte es sich um eine Unterart von handeln. Hier spricht jedoch der negative LactaseTest dagegen. 7

8 7 Identifikation mit Hilfe des ApiTestkits und MALDITOF Tabelle 1 Erhaltene Ergebnisse API 20E und MALDITOF Api Keim 3 Isolat B7.4 Bemerkungen Wiedersprüche ONPG negativ ADH negativ negativ LDC negativ ODC negativ CIT negativ H2S negativ URE negativ TDA negativ IND negativ negativ VP negativ GEL negativ GLU MAN negativ INO negativ SOR negativ RHA negativ SAC negativ MEL negativ AMY negativ ARA negativ OX negativ negativ NO2 negativ N2 negativ MOB negativ McC Übereinstimmung mit TSI Übereinstimmung mit UreaseTest Übereinstimmung mit IndolTest Wachsen auf MacConkey Keim: P. mirabilis 52% Isolat: K. pneumoniae 86% Isolat: K. pneumoniae 75% Isolat: R. terrigena, K. pneumoniae 100% OFO negativ negativ Isolat: alle 100% OFF APIErgebnis MALDITOF Proteus mirabilis 99.9 % Proteus mirabilis Roultella terrigena 93% pneumoniae 6.7% pneumoniae 8

9 8 Identifikationsstrategie Im Vorfeld wurde die folgende Strategie zur Identifikation des unbekannten Keim3 aufgestellt. Dabei wurden nur die neun genannten Enterobakterien (siehe: Aufgabenstellung) berücksichtigt. Tabelle 2 Im Voraus entwickelte Identifikationsstrategie IndolTest UreaTest Eschericha coli Eschericha coli Citrobacter Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacale Proteus mirabellis H 2 STest Citrobacter Proteus mirabellis Enterobacter cloacale Pseudomonas aeruginosa LactoseTest Citrobacter Proteus mirabellis CitratTest UreaTest Enterobacter cloacale Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacale Lactose Test Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabellis Gelatinetest: Gelatine bleibt nach Kultivierung mit Serratia marcescens im flüssigen Zustand TCBSKultivierung: handelt es sich bei der Kultur um Vibrio fluvialis so wachsen farbige Kulturen 9

10 Mit dieser Strategie wird im Fall des Keim3 eine falsche Bakterienart identifiziert. Die Gattung Salmonnela wurde durch den in Tabelle 1 aufgezeigten Weg gefunden. Tabelle 3 Weg der Identifikation von Keim3 IndolTest LactoseTest Citrobacter Pseudomonas aeruginosa Enterobacter cloacale Proteus mirabellis Citrobacter Proteus mirabilis Proteus mirabellis H 2STest CitratTest Salmonella wird aufgrund des positiven CitratTests als gesuchter Keim identifiziert. Hier kann das Hauptproblem dieser Identifikationsstrategie verstanden werden. Unterschiede in derselben Art wurden nicht berücksichtig und somit der Anteil an 48% Proteus mirabillis, welche Citrat abbauen können, nicht einbezogen. Dies verfälscht das erhaltene Resultat erheblich. Das gleiche Problem konnte auch beim Klärschlamm Isolat beobachtet werden. So findet man mit dieser Identifizierungsstrategie Pseudomonas aeruginosa. Dieses falsche Ergebnis erklärt sich vor allem aus dem negativen UreaseTestergebnis. 9 Zusätzliche Test Da für das Klärschlammisolat eine Diskrepanz zwischen MALDITOF und API E20 Ergebnis gefunden wurde, ist nach einem alternativen Test gesucht worden. Als möglicher Test, wurde eine Methode der Kultivierung bei unterschiedlichen Temperaturen gefunden. Zur Unterscheidung von Roultella terrigena und pneumoniae wurde das Isolat B7.4 auf einem Nähragar ausgestrichen und bei 510 C inkubiert. Die Unterart Roultella terrigena kann unter diesen Bedingungen wachsen. Nach einer Woche konnten keine neu gewachsenen Kulturen beobachtet werden. Dies bestätigt, dass es sich bei der isolierten Probe um pneumoniae handeln muss. 10

11 10 Literaturverzeichnis Bergy, D. ( ). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Lippencott Williams & Wil. 11 Abildungsverzeichnis Abbildung 1 Photographie des Unbekannten Keims... Abbildung 2 Photographie des Klärschlammisolates B Abbildung 4 Keim3... Abbildung 4 Isolat B Abbildung 5 Links Isolat B7.4, rechts Keim3 beobachtbar ist keine Rotfärbung... Abbildung 6 Links Isolat B7.4 rechts Keim3 beobachtbar ist eine intensive pink Färbung bei Keim3... Abbildung 7 Links Isolat B.7.4 rechts Keim Tabellenverzeichnis Tabelle 1 Erhaltene Ergebnisse API 20E und MALDITOF... 8 Tabelle 2 Im Voraus entwickelte Identifikationsstrategie... 9 Tabelle 3 Weg der Identifikation von Keim