Immunhistochemische Lokalisation der Annexine I, II, und IV im menschlichen Peniskarzinom. Inauguraldissertation. zur

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1 Aus der Klinik für Urologie ( Direktor: Prof. Dr. med. K.-J. Klebingat ) und dem Institut für Anatomie ( Direktor: Prof. Dr. med. K. Endlich ) der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald Immunhistochemische Lokalisation der Annexine I, II, und IV im menschlichen Peniskarzinom Inauguraldissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin ( Dr. med. ) an der medizinischen Fakultät der Ernst Moritz Arndt - Universität Greifswald Vorgelegt von Matthias Richter, geboren am in Mülheim an der Ruhr Greifswald, im Jahre 2007

2 Dekan: Professor Dr. rer. nat. H. K. Kroemer 1. Gutachter: Professor Dr. med. Dombrowski 2. Gutachter: Professor Dr. med. Klebingat 3. Gutachter: Professor Dr. med. Endlich 4. Gutachter: Professor Dr. med. Jünger Ort: Institut für Pathologie, Friedrich Löffler Strasse 23e Tag der Disputation:

3 Inhaltsverzeichnis Seiten 1. Einleitung Pathogenese des Peniskarzinoms Stadieneinteilung des Peniskarzinoms Therapie des Peniskarzinoms Lymphknotenmetastasierung Prognostische Marker für Lymphknotenmetastasen Annexine Funktionen der Annexine und deren Expression in malignen Tumoren Material und Methoden Patienten und Präparate Patientenkollektiv Diagnose und Therapie TNM Klassifikation Histologie und Grading Klinischer Verlauf Primäre Aufarbeitung der Präparate Material Chemikalien HE Färbung Detektionssysteme für die Immunhistochemie Antikörper Kunststoff und Glasmaterialien Häufig verwendete Lösungen und Chemikalien Geräte und Apparaturen Verwendete Software Methoden Präparation der Paraffinschnitte Entparaffinierung HE Färbung Antikörperverdünnungen Färbung mit Antikörpern monoklonal / polyklonal Annexinexpression 24

4 Lichtmikroskopische Untersuchung Ergebnisse Klinische Daten Patienten und Tumorstadien Überlebensdaten Annexin Expression Annexin I Annexin I Expression in gesundem Plattenepithel Expression von Annexin I bei Carcinoma in situ und verrukösem Karzinom Annexin I Expression in pt1 N0 M0 Tumoren Annexin I Expression bei pt2 und pt3 N0 M0 Karzinomen Annexin I Expression bei pt1 N+ - Tumoren Annexin I bei pt2 N+, pt3 N+ und pt4 N+ - Tumoren Annexin I und klinische Parameter Tumorstadium und Metastasierungsverhalten Überlebenszeit Annexin I Mikroskopische Befunde: Annexin I Annexin II Annexin II Expression in gesundem Plattenepithel Expression von Annexin II bei Carcinoma in situ und verrukösem Karzinom Annexin II Expression in pt1 N0 M0 Tumoren Annexin II Expression bei pt2 und pt3 N0 M0 Karzinomen Annexin II Expression bei pt1 N+ - Tumoren Annexin II bei pt2 N+, pt3 N+ und pt4 N+ - Tumoren Annexin II und klinische Parameter Tumorstadium und Metastasierungsverhalten Überlebenszeit Annexin II Mikroskopische Befunde: Annexin II Annexin IV Annexin IV Expression in gesundem Plattenepithel 48

5 Expression von Annexin IV bei Carcinoma in situ und verrukösem Karzinom Annexin IV Expression in pt1 N0 M0 Tumoren Annexin IV Expression bei pt2 und pt3 N0 M0 Karzinomen Annexin IV Expression bei pt1 N+ - Tumoren Annexin IV bei pt2 N+, pt3 N+ und pt4 N+ - Tumoren Annexin IV und klinische Parameter Tumorstadium und Metastasierungsverhalten Überlebenszeit Annexin IV Mikroskopische Befunde: Annexin IV Direkter Vergleich der Patienten bezüglich der Expression von Annexin I, II und IV Carcinoma in situ und verruköse Karzinome pt1 pt4 pn0 Tumoren pt1 pt4 pn+ - Tumoren Diskussion Bisherige Prognoseparameter beim Peniskarzinom Expression der Annexine I, II und IV im gesunden Plattenepithel Annexin I im Tumorgewebe Annexin II im Tumorgewebe Annexin IV im Tumorgewebe Zusammenfassung Literaturverzeichnis Eidesstattliche Erklärung Lebenslauf Danksagung 88

6 1. Einleitung Maligne Tumoren des Penis sind mit circa 600 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland sehr selten. In der Literatur finden sich Angaben zur Inzidenz zwischen 0,4 und 0,8 pro Einwohnern pro Jahr. In bestimmten Regionen wie Japan, China, Vietnam, Uganda, Mexiko und Puerto Rico stellt das Peniskarzinom hingegen eine deutlich häufigere Tumorentität dar. Es ist dort teilweise das zweithäufigste Malignom des Mannes. Zum Diagnosezeitpunkt sind 60 % der Betroffenen älter als 65 Jahre und 16 % der Erkrankten sind jünger als 50 Jahre. Peniskarzinome sind bereits im ersten Jahrhundert vor Christus mit einer Penisamputation und Koagulation des Stumpfes beschrieben. Erste Schilderungen über eine partielle Penektomien, die von Valsalva durchgeführt wurden, existieren aus dem Jahre 1761 von Morgagni. Dennoch ist, bedingt durch die geringe Inzidenz des Peniskarzinoms, die Datenlage zur Therapie bzw. zum therapeutischen Procedere und zu den prognostischen Parametern dieser Erkrankung im Vergleich zu anderen Tumorerkrankungen sehr unbefriedigend. 1.1 Pathogenese des Peniskarzinoms Chronische Balanoposthitis und Smegmaretention, welche durch eine relative oder absolute Phimose begünstigt werden, gelten als pathogenetische Faktoren. In Regionen, in denen bei der Geburt aus religiösen oder traditionellen Gründen eine Circumcision durchgeführt wird, tritt das Peniskarzinom praktisch nicht auf. Eine generelle Circumcision zur Prävention ist bei der relativen Seltenheit des Peniskarzinoms jedoch nicht indiziert. Eine adäquate Genitalhygiene stellt eine entscheidende präventive Maßnahme dar. Auch eine Beschneidung in der Adoleszenz birgt keinen Vorteil [1]. Der Zusammenhang zwischen einer Infektion mit humanen Papillomaviren, vor allem der Serotypen 16 und 18 und der Entwicklung anogenitaler Karzinome ist inzwischen zweifelsfrei gesichert. Bei der Frau besteht eine nahezu 100 %ige Korrelation zwischen einer Infektion mit humanen Papillomaviren onkogener Genotypen und der Entwicklung eines Zervixkarzinoms. Bei % der Plattenepithelkarzinome des Penis fanden sich humane Papillomaviren, darunter zu % der Subtyp 16 und zu circa 10 % der Subtyp 18. Im Gegensatz dazu werden die benignen Condylomata accuminata von humanen Papillomaviren der Serotypen 6, 11 und 42 hervorgerufen [2]. 1

7 Als prämaligne Läsionen beziehungsweise Präkanzerosen gelten der Morbus Bowen und die Erythroplasie Queyrat (Carcinoma in situ der Schleimhaut). Der destruierend wachsende Buschke Löwenstein Tumor (Condyloma accuminatum giganteum) wird dem verrukösen hochdifferenzierten Plattenepithelkarzinom zugeordnet. Im Gegensatz zur Frau stellt der Lichen sclerosus et atrophicus des Mannes (Balanitis xerotica obliterans) nur ausnahmsweise eine Präkanzerose dar. Die Erythroplasie Queyrat der Glans penis, die klinisch durch erhabene rote Herde imponiert und der Morbus Bowen der Vorhaut sind Präkanzerosen und dem Carcinoma in situ der Portio uteri vergleichbar. Der Morbus Paget, das intraepitheliale Karzinom, tritt beim Mann neben dem Anus bevorzugt am Skrotum, seltener an der Glans penis auf. Die bowenoide Papulose des Penis ist durch multiple, zwei bis zehn Millimeter große Effloreszenzen bei jungen Männern zwischen 20 und 40 Jahren charakterisiert und wird durch das humane Papillomavirus 16 hervorgerufen [3]. In über 90 % handelt es sich bei den malignen Tumoren des Penis um Plattenepithelkarzinome. Eine Übersicht über die histologische Unterteilung gibt die Tabelle 1. Plattenepithelkarzinome des Penis keratinisierter Typ basaloider Typ verruköser Typ kondylomatöser Typ sarkomatoider Typ adenosquamöser Typ Tabelle 1: Histologische Unterteilung des Peniskarzinoms nach Cubilla [4]. Weitere Tumoren des Penis und des Skrotums sind maligne Melanome, Sarkome sowie das maligne Hämangioendotheliom. Mit zunehmender Verbreitung des humanen Immunodeficency Virus (HIV) kommen vermehrt Kaposi Sarkome im Bereich des Penis vor. 2

8 1.2. Stadieneinteilung des Peniskarzinoms Biologisch betrachtet ist das Peniskarzinom ein langsam wachsender Tumor. Die primäre Lokalisation findet sich in 50 % der Patienten im Bereich der Glans penis, bei weiteren 20 % am Präputium. Bei 15 % sind sowohl Präputium als auch die Glans penis betroffen. Erstsymptom ist bei der Hälfte der Männer eine schmerzlose Erhabenheit im Bereich der Glans penis und des distalen Praeputiums. Durch Angst und Schamgefühl der Patienten, aber auch aufgrund von psychischer Indolenz wird die Diagnosestellung des Peniskarzinoms oftmals über Jahre verschleppt. In fortgeschrittenen Stadien kann es zur Exulceration kommen. Durch Sekundärinfektion des Primärherdes wird eine Lymphknotenschwellung im Bereich der Leiste verursacht. Dies macht die klinische Differenzierung zwischen Metastasen oder entzündlichen Schwellungen der Lymphknoten unmöglich [5]. Die histopathologische Stadieneinteilung erfolgt nach der TNM-Klassifikation. T Tx Tis Ta T1 T2 T3 T4 Primärtumor Primärtumor kann nicht beurteilt werden Carcinoma in situ Nichtinvasiver Tumor Infiltration subepithelialen Bindegewebes durch den Tumor Tumor reicht bis in das Corpus cavernosum oder spongiosum Tumor infiltriert Urethra oder Prostata Infiltration anderer Nachbarstrukturen (z.b. Harnblase, Rektum) N Nx N0 N1 N2 N3 Regionäre Lymphknoten regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden kein Anhalt für inguinale Lymphknotenmetastasen solitäre oberflächliche LK Metastase mehrere ein oder beidseitige Leistenlymphknotenmetastasen Metastasen in tiefen Leisten oder Beckenlymphknoten (uni oder bilateral) 3

9 M Mx M0 M1 Fernmetastasen Das Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden Fernmetastasen liegen nicht vor Vorhandensein von Fernmetastasen Bezüglich der Tumordifferenzierung und damit dem Malignitätsgrad wird wie folgt unterschieden: Gx G1 G2 G3 Der Differenzierungsgrad kann nicht beurteilt werden Hoher Differenzierungsgrad (geringe Malignität) Mäßiger Differenzierungsgrad Geringer Differenzierungsgrad (hohe Malignität) Weitere gebräuchliche Einteilungen sind die nach Jackson oder nach den Kriterien der UICC (Union contre le cancere) / AJC von 1997: Stadium I (A): Tumor auf Glans und / oder Praeputium beschränkt Stadium II (B): Tumor greift auf den Penisschaft über Stadium III (C): Tumor mit operablen inguinalen Lymphknoten Stadium IV (D): Tumor mit Infiltration benachbarter Strukturen, Tumor mit inoperablen inguinalen Lymphknoten, Tumor mit Fernmetastasen Die Metastasierung erfolgt lymphogen, zunächst in die oberflächlichen und dann in die tiefen inguinalen Lymphknoten, ipsilateral und möglicherweise auch kontralateral, da sich die Lymphgefäße an der Penisschaftbasis zum Teil kreuzen. Die erste Station für Metastasen ist der oberflächliche Lymphknoten an der Vena epigastrica superficialis, der auch als Schildwächter (sentinel -) Lymphknoten bezeichnet wird. Im Stadium der hämatogenen Metastasierung finden sich hepatische, pulmonale und ossäre Metastasen. 4

10 1.3. Therapie des Peniskarzinoms Die primäre Therapie erfolgt chirurgisch zum Zwecke der histologischen Sicherung. Das Ausmaß bzw. die Radikalität des ersten Behandlungsschrittes ist auch heute noch umstritten. Nach derzeitiger Datenlage kann prinzipiell folgendes festgehalten werden: Im Stadium Cis Ta erfolgt die histologische Diagnose mittels tiefer Probeexcision. Entsprechend dem histologischen Ergebnis erfolgt entweder eine lokale chirurgische Excision des Befundes oder alternativ eine Lasertherapie mit dem Neodym YAG Laser (bevorzugt für tiefe Läsionen) oder dem CO 2 Laser (für oberflächliche Befunde). Eine weitere Alternative stellt die topische Applikation des Chemotherapeutikums 5 Fluouracil (5 FU) dar. Unter Berücksichtigung der viralen Genese findet heute gelegentlich auch eine primäre Therapie bzw. anschließende Rezidivprophylaxe mit Imiquimod Anwendung. Eine organerhaltende Therapie kann bei kleinen T 1 Tumoren mittels lokaler Excision, Laserbehandlung oder Radiatio versucht werden. Bei großen T 1 Karzinomen und höheren Tumorstadien ist meist die partielle Penektomie bzw. eine totale Penisamputation mit Anlage eines Neomeatus der Urethra erforderlich. Prinzipiell wird ein Sicherheitsabstand von zwei Zentimetern gefordert, ggf. mit intraoperativer Schnellschnittuntersuchung. Cubilla et al. haben betreffend des Absetzungsrandes das Tumorgrading untersucht und halten bei G 1 - und G 2 Tumoren einen Abstand von 1 cm und bei G 3 Tumoren einen Abstand von 1,5 cm für ausreichend [3]. Bei Patienten, welche die operative Therapie ablehnen oder bei ausgedehnten, primär inoperablen Befunden kann eine Strahlentherapie nach histologischer Sicherung durchgeführt werden. Dabei sind allerdings bei dem gering radiosensiblen Plattenepithelkarzinom Strahlendosen von mindestens 60 Gy erforderlich, welche sodann auch eine hohe Nebenwirkungsrate mit sich bringen. Als rein palliative Maßnahme muß die Radiatio bei einem Tumordurchmesser von > 3 cm und bei der Invasion von tieferen Strukturen des Penis angesehen werden. Eine Radiochemotherapie mit einem Radiosensitizer ist mit intravenös oder intramuskulär verabfolgtem Bleomycin durchgeführt worden, allerdings nur bei wenigen Patienten mit retrospektiver Analyse der Daten. Weitere Ansätze in Form einer Kontaktbestrahlung sowie die interstitielle Strahlentherapie sind denkbar. Die Chemotherapie zur Behandlung des Peniskarzinoms ist umstritten. Als wirksam haben sich die Zytostatika Cisplatin, Methotrexat und Bleomycin erwiesen, wobei eine Kombinationstherapie überzeugendere Ergebnisse liefert als die Monotherapie. Als adjuvanter Therapieansatz werden bei ausgedehntem Primärtumor ohne Lymphknotenmetastasen eine 5

11 zwölfwöchige Polychemotherapie mit Vincristin, Methotrexat und Bleomycin empfohlen. Bei bereits vorliegender lymphogener Metastasierung kann die Applikation von sechs Zyklen mittels Cisplatin / 5 Fluouracil (5 FU) erfolgen [6, 7]. Bietet das Ausmaß der Therapie des Primärherdes bereits viele Ansatzpunkte zur Diskussion, so gestaltet sich die Festlegung des therapeutischen Konzeptes in Bezug auf die Notwendigkeit der inguinalen und / oder pelvinen Lymphadenektomie noch um einiges schwieriger. Dies umso mehr, als die Prognose des Peniskarzinoms ganz entscheidend vom Lymphknotenstatus und deren Therapie abhängt Lymphknotenmetastasierung Zum Zeitpunkt der Diagnosestellung liegen in % palpable inguinale Lymphknoten vor. In circa 50 % sind diese infolge einer Sekundärinfektion des Tumors reaktiv entzündlich verändert. Andererseits finden sich bei 20 % der klinisch unauffälligen Lymphknoten histologisch okkulte Metastasen [1] (Tabelle 2 und 3). TNM LK Metastasierung (%) 5 Jahres Überlebensrate T1 N0 M % T 2 3 N 0 M % T 1 3 N1 M ,3 % T 1-4 N0 M 1 < 5 % Tabelle 2: Tumorstadien, Wahrscheinlichkeiten für das Vorliegen von Lymphknoten - metastasen und 5 Jahres - Überlebensraten [1]. Tumorgrading N positiv (%) G ,5 G 2 38,5 79,0 G 3 66,7 100 Tabelle 3: Zusammenhang von Tumorgrading und Lymphknotenfiliae. Mit keinem derzeitigen bildgebenden Verfahren ist eine sichere Differenzierung zwischen tumorbefallenen und reaktiv entzündlichen Lymphknoten möglich. Hierzu ist eine operative Exploration der Lymphknoten erforderlich. Die klassische inguinale Lymphknotendissektion 6

12 wurde erstmals 1948 von Dassler beschrieben. Diese ist mit einer hohen postoperativen Morbidität behaftet. In bis zu 90 % kommen Wundheilungsstörungen mit Seromen und Hautlappennekrosen, chronischen Lymphödemen und Thrombosen in den tiefen Becken- /Beinvenen mit entsprechender Rate an Lungenarterienthrombembolien vor [1, 7, 8, 9] (Tabelle 4). Komplikationen bei inguinaler Häufigkeitsangabe ( % ) Lymphknotendissektion Wundinfektion 26 Hautnekrosen / Wunddehiszenzen 41 Serom / Lymphocele 21 Lymphödem 55 Tabelle 4: Komplikationsraten nach inguinaler Lymphknotendissektion. Modifiziert nach Horenblas, 2001 [10, 11]. Um die Morbidität der Lymphadenektomie zu senken, wurde versucht die Dissektion von Lymphknoten einzuschränken, ohne das Progressionsrisiko für den Patienten zu erhöhen. In den Frühstadien T is und T a treten inguinale Metastasen mit einer sehr geringen Wahrscheinlichkeit auf. Eine operative Intervention kann hier unterbleiben. Bei allen anderen T Stadien sollte auch bei klinisch negativen Lymphknoten zumindest eine Sentinel Lymphknotenexstirpation erfolgen. Diese von Cabanas (1977) erstmals beschriebene Methode wird in der Literatur kontrovers diskutiert, weil es trotz dieses Vorgehens zu einer Tumorprogression kommen kann. Denn von anderen onkologischen Erkrankungen ist bekannt, daß Lymphknotenstationen übersprungen werden können. Deshalb bietet ein negativer Sentinellymphknoten keine absolute Sicherheit bezüglich der tatsächlichen Freiheit von Lymphknotenmetastasen. Eine weitere Möglichkeit stellt die modifizierte Lymphadenektomie von Catalona [12] dar, bei welcher das inguinale Dissektionsgebiet auf die medialen tiefen und oberflächlichen inguinalen Lymphknoten beschränkt bleibt und damit bei hoher diagnostischer Sicherheit die postoperative Morbidität gesenkt wird. Aufbauend auf dieser Operationstechnik wurden weitere Modifikationen zur Senkung der Komplikationsraten bei gleich hoher diagnostischer Sicherheit beschrieben [13]. Bei Nachweis von tumorbefallenen Lymphknoten sollte eine Erweiterung zur radikalen Lymphadenektomie inguinal und pelvin beidseits erfolgen. Eine neue Möglichkeit der 7

13 Lymphknotendetektion wurde von Horenblas [10, 11] vorgeschlagen. Dabei werden nach radioaktiver Markierung die Sentinellymphknoten intraoperativ identifiziert und entfernt. Langzeitergebnisse hierzu stehen noch aus. Die Lymphadenektomie erfüllt primär ein diagnostisches Erfordernis und ist bei Vorliegen von Metastasen gleichzeitig Therapie. Patienten mit einer frühzeitigen Lymphadenektomie, auch im Falle von klinisch unauffälligen Lymphknoten zeigten einen deutlichen Überlebensvorteil verglichen mit der verzögert erfolgenden Lymphknotenentfernung [1]. Andererseits besteht im Falle einer generellen Lymphadenektomie eine Übertherapie für % der Patienten mit einem T 1 Tumor. Diese Tatsachen machen vor dem Hintergrund der beschriebenen hohen Morbidität der Lymphadenektomie prognostische Marker für eine Lymphknotenmetastasierung sehr erstrebenswert. Abbildung 1: Dissektionsgrenzen der radikalen bzw. ausgedehnten und der modifizierten Lymphadenektomie [14]. 8

14 Abb. 2: Darstellung der klassischen und modifizierten inguinalen Lymphadenektomie mit oberflächlichen und tiefen Lymphknoten; die klassische Lymphadenektomie entspricht der größeren, die modifizierte der kleineren Feldfläche [14]. 1 Arteria femoralis, 2 Vena femoralis, 3 Ligamentum inguinale, 4 Fossa ovalis, 5 Vena saphena magna Prognostische Marker für Lymphknotenfiliae Bei der klinischen Relevanz des Lymphknotenstatus einerseits und der hohen postoperativen Morbidität der Lymphknotendissektion andererseits wurden für das Peniskarzinom diverse pathomorphologische wie histochemische Parameter und Marker untersucht. So konnten Slaton et al [15] zeigen, dass das Tumorstadium, die vaskuläre Invasion der Tumorzellen und ein Vorhandensein von über 50 % undifferenzierter Zellen unabhängige prognostische Faktoren für das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen sind. Dieses bestätigten Ficcara und Mitarbeiter für das histologische Grading und den Einbruch der Tumoren in das Lymphabflusssystem [16]. Emerson et al. untersuchten 2001 die genaue Invasionstiefe von Peniskarzinomen in Korrelation zum Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen und zeigten, daß bei einer Tumorinvasionstiefe über 6 mm und entsprechender vaskulärer Invasion der Tumorzellen Lymphknotenmetastasen signifikant häufiger auftraten als bei einer Invasionstiefe unter 6 mm [17]. Die Inzidenz von HPV Viren bei vorhandenem Peniskarzinom stellt keinen Prognoseparameter bezüglich Überlebenszeit oder lymphogener Metastasierung dar, wie Bezerra et al. in einer Studie von 82 Patienten belegen konnten [18, 19]. 9

15 Es wurden ebenfalls die histopathologischen Subtypen des Peniskarzinoms unter diesem Gesichtspunkt untersucht. Eine intermediäre Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung fand sich beim klassischen Plattenepithelkarzinom des Penis, während bei der basaloiden und sarkomatoiden Variante des Peniskarzinoms eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit besteht [3, 19]. Als anerkannter sogenannter Tumormarker gilt beim Peniskarzinom, wie auch beim Zervixkarzinom, das Squamous Cell Carcinoma Antigen (SCC). Dessen Serumspiegel korreliert mit dem Tumorvolumen, dem Stadium und der Metastasierung. SCC hat beim Peniskarzinom eine Sensitivität von % und eine Spezifität von 95 %. Gerade als Kontrollparameter nach der Primärtherapie empfiehlt sich dieses Antigen [18]. Martin et al. zeigten 2002 eine Korrelation zwischen PCNA und der Lymphknotenmetastasierung sowie einen Zusammenhang von p 53 Überexpression und Tumorstadium, Grading, Lymphknotenstatus und tumorspezifischem Überleben auf [20]. Diese Ergebnisse stehen jedoch im Gegensatz zu einer Untersuchung von Walts et. al. im Jahre 1993, welche keinen Zusammenhang zwischen der von Ihnen untersuchten p 53 Expression und anogenitalen Epithelläsionen verschiedenen Malignitätsgrades fanden [21]. Des Weiteren liegen erste Ergebnisse zur prognostischen Relevanz von Zelladhäsionsproteinen wie Tenascin und Fibronectin vor. Protzel et al. (Publikation in Vorbereitung) konnten Zusammenhänge zwischen verstärkter Expression von Tenascin und Fibronectin und dem gehäuften Auftreten von Metastasen beim Peniskarzinom nachweisen. Daher erscheint auch die Expression der Zelladhäsionsproteine Annexine I, II, und IV als prognostischer Parameter für Lymphknotenmetastasen beim Peniskarzinom des Menschen interessant. 10

16 1.6. Annexine Annexine sind Proteine, die mit Ausnahme der Erythrozyten in allen eukaryotischen Zellen und bei Pflanzen vorkommen. Nach der Entdeckung im Jahre 1977 umfasst nach derzeitigem Kenntnisstand die multigenetische Familie der Annexine über 200 spezies und gewebsspezifische Isoformen. Der Name Annexin, früher auch Lipocortin, Calpactin oder Endonexin, kommt aus dem Lateinischen annex und bezieht sich auf die Fähigkeit dieser Gruppe von Eiweißen, sich an biologische Strukturen anzubinden bzw. biologische Elemente zu verbinden. Annexine besitzen, wie alle Proteine ein C terminales und ein N terminales Ende. Das C terminale Ende, auch core (Kern) genannt, definiert die Zugehörigkeit zur Annexin Familie. Mit Ausnahme von Annexin VI besteht dieses aus vier jeweils circa 70 Aminosäuren enthaltenden Sequenzen [22, 23, 24]. Das N terminale Ende, tail, ist die Regulatorregion, über welche die Phosphorylierung, Proteolyse oder andere Interaktionen mit Proteinen stattfinden bzw. ablaufen. Die Größe dieser Proteine variiert von einem Molekulargewicht von kda bis zu kda [25]. Die verschiedenen Annexine des Menschen stimmen in % in ihrer Proteinstruktur überein. Annexine von Mensch, Rind und der Maus sind in ihrer Proteinstruktur zu 98 % identisch. Funktionen und Aufgaben von Annexinen Beteiligung am Aufbau von Membranen und deren Interaktionen Signaltransduktion durch Modulation der Mitogen aktivierten Proteinkinase Zelldifferenzierung und proliferation Beteiligung am Entzündungsprozess durch Hemmung der Phospholipase A 2 Verminderung der Regeneration und Migration von Granulozyten Intrazellulärer Calciumhaushalt Aufbau von Ionenkanälen (Annexin II Chloridkanäle, Annexin VII Calciumkanäle) Mögliche Antikoagulantien (Annexinerhöhung - > Plasminspiegelerhöhung) Physiologischer Stress ist mit Annexin I und II Erhöhung verbunden Tabelle 5 : Funktionen und Aufgaben von Annexinen [22]. 11

17 Annexine besitzen vielfältige Aufgaben (Tabelle 5): So binden sie calciumabhängig Phospholipide und sind an der Aggregation, Fusion und / oder Organisation von Membranen während exo und endocytotischer Prozesse beteiligt. Annexine sind Substrate des Rezeptors der Tyrosinkinase. Gerade aufgrund dieser Tatsache sind Annexine im medizinischen Bereich von Interesse, da Abnormitäten derselben zur Karzinogenese und Tumorprogression beitragen können. Im Rahmen der oben erwähnten Membranbeteiligung wird von einem Einfluß auf invasives Wachstum und auf das Metastasierungsverhalten von malignen Tumoren ausgegangen [23, 24, 26-49] Funktionen der Annexine und deren Expression in malignen Tumoren Die am häufigsten in malignen Tumoren untersuchten Annexine sind die Annexine I, II und IV. Annexin I hat verschiedene biologische Funktionen. Es ist an interzellulären, membran - vermittelnden Prozessen wie zum Beispiel der Endozytose beteiligt. Ebenso spielt es offensichtlich eine Rolle bei der Apoptose. Annexin I scheint eine Signalwirkung auf verschiedene Zelltypen zu besitzen und ist dabei an der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung beteiligt. Des Weiteren hat Annexin I immunsuppressive Eigenschaften, indem es die Funktion der neutrophilen Granulozyten und das Monozyten Makrophagensystem hemmt. Auch besitzt Annexin I die Fähigkeit, die Aktivierung der zytosolischen Phospholipase A2 durch Wachstumsfaktoren zu hemmen und ist am Auf und Umbau des Zytoskeletts durch Interaktion mit sogenannten Mikrofilamenten (z.b. Aktin, Spektrin) beteiligt. Der Genlocus für Annexin I findet sich auf dem Chromosom 9 q11 q22. Der Nachweis einer veränderten Annexin I Expression wurde für diverse Karzinome erbracht. So wird Annexin I im regelhaften Ösophagusepithel stark und beim Ösophaguskarzinom gering exprimiert. Im Verhältnis war Annexin I in den differenzierten Karzinomen intensiver ausgeprägt als bei schlecht differenzierten Karzinomen [50, 51, 52]. Konträr wird seine Expression dagegen im Mammakarzinom beschrieben. Annexin I kommt kaum in gesundem Drüsengewebe und auch nicht bei benignen Tumoren vor, ist jedoch bei allen Karzinomstufen vom Carcinoma in situ über invasive Karzinome und deren Lymphknotenmetastasen bis zu Fernmetastasen vermehrt nachweisbar [53]. 12

18 Beim hepatozellulären Karzinom war Annexin I bei schlecht differenzierten Malignomen deutlich vermehrt vorhanden und zwar vor allem im Cytoplasma, dagegen nicht in normalem Leberparenchym oder in chronisch nicht onkologisch erkranktem Gewebe. Interessant ist, dass Annexin I bei Patienten mit einem hepatozellulären Karzinom nicht nur in den Tumorzellen selbst, sondern auch im benachbarten nicht tumorerkranktem Leberparenchym überexprimiert war [54]. Bei benignen und malignen Tumoren der Prostata scheint sich ein Widerspruch zu ergeben. Während Annexin I in der benignen Prostatahyperplasie und dem hormonrefraktären Prostatakarzinom exprimiert wird, ist ein vollständiger Verlust von Annexin I bei hormonsensiblen Prostatakarzinomen zu verzeichnen [55, 56]. Experimentielle Untersuchungen in vitro zeigten, daß Tumorzellen mit höherem Metastasierungspotential auch eine höhere Annexinexpression aufwiesen [57]. Während Annexin I und II in den ekkrinen Schweißdrüsen des normalen Gewebes gering exprimiert werden, zeigte sich jedoch eine vermehrte Annexinexpression in Keratinozyten bei entzündlichen Erkrankungen wie zum Beispiel der Psoriasis vulgaris. Eine erhöhte Annexin I Expression kommt bei differenzierten Plattenepithelkarzinomen der Haut, nicht aber beim Basalzellkarzinom oder undifferenzierten Karzinomen vor [58, 59]. Beim Magenkarzinom und dort bei zytostatikaresistenten Zellreihen fand sich eine deutliche Annexinanhäufung [60]. Annexin II ist ein Substrat für verschiedene Proteinkinasen einschließlich des EGF - Rezeptors. Außerdem reguliert Annexin II die Aktivität der Phosphorylase C, welche ein ubiquitär exprimiertes Enzym ist und eine zentrale Rolle bei vielen verschiedenen zellulären Funktionen spielt. Annexin II ist in der Lage, calciumabhängig Aktin und Spektrin zu binden und ist dadurch am Auf und Umbau des Zytoskeletts beteiligt. Der Ort der genetischen Kodierung für Annexin II ist auf dem Chromosom 15 q21-q22. Vishwanatha et al. fanden in den Epithelzellen der Pankreasgänge Annexin II, nicht aber in den Drüsen oder Inselzellen. Beim Pankreaskarzinom zeigte sich Annexin II zwei bis achtmal mehr exprimiert und zwar beim Adenokarzinom und dort auf die proliferierenden, duktalen Zellen beschränkt [61]. 13

19 Bei Hirntumoren nimmt die Ausprägung von Annexin II vom Glioblastoma multiforme, der als Tumor mit dem höchsten Malignitätsgrad anzusehenden Entität über das anaplastische Astrozytom zum Astrozytom ab. Es war vor allem im Bereich des Zellkerns und weniger im Zytoplasma selbst zu finden. In gesunden Astrozyten fand sich kein Annexin II [62]. Für das Nierenzellkarzinom berichteten Zimmermann et al über eine Korrelation zwischen der Annexin II Expression und dem sogenannten Fuhrman Grade sowie dem klinischen Verlauf bei 33 Patienten mit Nierenzellkarzinomen [63]. Annexin IV Über die biologischen Funktionen von Annexin IV ist weitaus weniger bekannt als über die von Annexin I und II. Sicher ist, dass es den Chlorid Ionen Austausch reguliert, indem es als Mediator der Calmodulin Kinase II fungiert. Ort der genetischen Codierung für Annexin IV liegt auf dem Chromosom Nummer 2. Über eine Zunahme der Annexin IV-Expression bei chemotherapieresistenten Tumorzellen berichteten Han und Mitarbeiter, während dies für Annexin II nicht zutraf [64]. Beim menschlichen Adenokarzinom und bei Hirntumoren in Ratten konnte ebenfalls eine erhöhte Expression von Annexin IV nachgewiesen werden; interessanterweise in vitro umso höher bei Zugabe von Ethanol. Änderung der Expressionsquantität für Annexin I und V ergaben sich nicht [65]. In den Tumorzellen von 12 Patienten mit hellzelligem Nierenzellkarzinom fanden Zimmermann et al. erhöhtes Vorkommen von Annexin IV mrna [66]. Für das Peniskarzinom liegen bisher keine Untersuchungen zur Annexinexpression vor. Bei der vorliegenden Datenlage erscheinen Untersuchungen zur Annexinexpression in Peniskarzinomen als prognostische Faktoren für Tumorprogression und Metastasierung Erfolg versprechend. 14

20 Ziele der Arbeit sind daher: 1. Die Untersuchung der Expression von Annexin I, II und IV in nicht neoplastischem und Tumorgewebe des Peniskarzinoms. 2. Die Veränderungen der Expression von Annexinen in Abhängigkeit von Klassifikation und Differenzierungsgrad des Peniskarzinoms. 3. Die Korrelation der Annexin Expression mit Lymphknotenmetastasen und dem klinischen Outcome.. 15

21 2.Material und Methode 2.1 Patienten und Präparate Patientenkollektiv In der vorliegenden Arbeit wurden die Präparate von Patienten der Klinik und Poliklinik für Urologie der Ernst Moritz Arndt Universität Greifswald, der Klinik für Urologie des Medizinischen Zentrums der Landeshauptstadt Schwerin, der Klinik für Urologie des Städtischen Klinikums Pforzheim sowie der Klinik für Urologie des Sankt Trudpert Krankenhauses in Pforzheim und des Krankenhauses in Demmin ausgewertet. Insgesamt konnten die Präparate von 35 Patienten ausgewertet werden, 8 Patienten stammten aus der Klinik für Urologie Greifswald ( ), 19 Patienten aus der urologischen Klinik Schwerin ( ), 4 Patienten aus der Klinik für Urologie des Städtischen Klinikums Pforzheim ( ), 2 Patienten aus der urologischen Klinik des Sankt Trudpert Krankenhauses in Pforzheim ( ) und 2 Patienten aus dem Kreiskrankenhaus in Demmin. Das Alter der Patienten lag zum Zeitpunkt der Diagnosestellung zwischen 40 und 89 Jahren, im Mittel bei 65,7 Jahren Diagnose und Therapie Die Diagnose konnte bei 3 Patienten mittels Probeexzision und bei 10 Patienten durch Circumcision gestellt werden. In 22 Fällen wurde die Indikation zu einer operativen Therapie aufgrund des makroskopischen Befundes gesehen. Das operative Vorgehen mittels Lasertherapie fand bei 2 Patienten Anwendung. 6 Patienten wurden durch die Circumcision ausreichend behandelt. Bei 4 Patienten erfolgte lediglich eine Probeexzision, eine Circumcision mit Exzision oder eine Circumcision mit einer ein oder beidseitigen Lymphadenektomie. Eine Penisteilamputation erfolgte bei 15 Patienten und eine klassische Penisamputation mit Anlage einer Boutonniere erfolgte in 8 Fällen. Bei insgesamt 14 Patienten wurden inguinale Lymphknoten metachron exstirpiert. Bei 10 Patienten erfolgte die Lymphadenektomie explorativ, 2 Lymphadenektomien wurden aufgrund palpatorisch vergrößerter Lymphknoten durchgeführt. In zwei Fällen wurden die sogenannten Sentinel Lymphknoten nach radioaktiver Markierung entfernt. Bei Vorliegen 16

22 eines progredienten Tumorleidens wurden bei 3 Patienten Metastasen im Bereich der Haut exzidiert. Als adjuvante Therapieverfahren kamen bei metastasiertem Tumor die Strahlentherapie sowie die Polychemotherapie zur Anwendung. 5 Patienten wurden palliativ beidseits inguinal und iliakal bestrahlt, 5 Patienten wurden einer Chemotherapie unterzogen. Letzteres erfolgte 2 mal mittels des BMP Schemas (Bleomycin, Methotrexat, Cisplatin), 1 Patient wurde mit Paclitaxel und Carboplatin behandelt. In zwei Fällen kam eine Bleomycin Monotherapie zur Anwendung TNM - Klassifikation Sämtliche Peniskarzinome wurden nach den Vorgaben der WHO im TNM Schema von 1997 klassifiziert, wobei das T Stadium in allen Fällen histopathologisch festgelegt werden konnte, während das N bzw. M Stadium pathologisch oder klinisch durch Palpation, Sonographie, konventionelle Röntgenuntersuchung sowie durch Computertomographie festgelegt worden ist. Histopathologisch ergab sich bei 3 Patienten ein Carcinoma in situ, 3 Patienten wiesen ein verruköses Karzinom auf. Im Stadium T 1 wurden 12 Patienten angetroffen. Eine tiefe Invasion ließ sich bei 7 Karzinomen im Stadium pt 2 sichern, bei 9 Patienten lag ein T 3 Karzinom vor und 1 Patient hatte ein T 4 Karzinom. Von den 14 Lymphadenektomiepatienten waren 3 ohne Metastasen (pn0), 4 Patienten wiesen eine solitäre Metastase auf (pn1), 4 Patienten zeigten Filiae in mehreren oberflächlichen Leistenlymphknoten (pn2) und bei 3 Erkrankten wurde ein pn 3 Stadium diagnostiziert. Die Ausbreitungsdiagnostik bezüglich Fernmetastasen (M) erfolgte bei 32 Patienten, die übrigen 5 wurden somit als Mx klassifiziert. 32 Personen waren klinisch ohne fassbare Metastasen. Im Rahmen des Stagings konnte bei 5 Fällen röntgenologisch bzw. computertomographisch eine ossäre beziehungsweise pulmonale Filialisierung nachgewiesen werden. 17

23 Nr. Alter / TNM Grading Therapie Jahre Carcinoma in situ Laser Carcinoma in situ 4 x Laser, PE Carcinoma in situ Circumcision, verruköses Carcinom, Buschke-Löwenstein Circumcision verruköses Carcinom Probeexzison verruköses Carcinom CC, LA bds pt1pn1m1 G 2 Teilamp., LA re, 6xBMP pt1pn3m1 G 3 CC, TmExst., LA bds, 8 x BMP pt1pn3m0 G 2 CC, Teilamp., LA links pt1n0m0 G 1 Exzision pt1n0m0 G 2 Circumcision pt1n0m0 G 2 Circumcision pt1n0m0 G 2 Circumcison pt1n0m0 G 2 Teilamp pt1pn0m0 G 2 Teilamp., ing.la pt1pn1m0 G 2 Teilamp., ing.la, RTX, 3 x Bleo pt1n0m0 G 3 CC, Exzision pt2n0m0 G 2 Teilamp pt1pn1m0 G 2 Teilamp., LA rechts, RTX pt2pn1m1 G 2 Teilamp., ing.la, Exc. BD- Metastase, 4 x Taxol / Carboplatin pt2pn2m1 G 2 Teilamp, LA, RTX pt2pn2m0 G 2 Amputation, LA bds, Ing. + pelvin pt2pn2m0 G 2 Amputation, ing LA links pt2pn3m0 G 2 Teilamp., ing.la, 6 x Bleomycin pt2n0m0 G 1 Teilamp pt3n0m0 G 2 Amputation pt3pn2m0 G 2 Boutonniere, LK bds pt3n3m1 G 2 Teilamp, RTX, Pulmo, Os pt3n2m0 G 2 Boutonniere pt3pn0m0 G 1 Boutonniere, LA rechts pt3n2m0 G 1 Teilamp, RTX pt3n2m0 G 3 Teilamputation pt3n0m0 G 2 Teilamputation pt3pn0m0 G 2 Amputation, ing. Sentinel LA pt4n2m0 G 2 Boutonniere Tabelle 6: Daten der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten, LA = Lymphadenektomie, CC = Circumcision, RTX = Radiatio, BD Metastase = Bauchdeckenmetastase, PE = Probexzision, ing. = inguinal, os = ossäre Metastasen, pulmo = pulmonale Metastasen. 18

24 Histologie und Grading Sämtliche histologischen Präparate wurden nach repräsentativen Kriterien ausgesucht, so daß eine Beurteilung des Tumors selbst, der Carcinomgrenzen sowie des umliegenden gesunden Gewebes möglich war. Alle so ausgewählten Schnittpräparate untersuchte ein Referenzpathologe nochmals mikroskopisch, um die oben genannten qualitativen Merkmale sicherzustellen. Insgesamt fanden sich 3 Carcinomata in situ und 3 verruköse Karzinome. Bei den 29 invasiven Peniskarzinomen handelte es sich ausnahmslos um Plattenepithelkarzinome. Mit insgesamt 22 G 2 Karzinomen stellten die mäßig differenzierten Karzinome die größte Gruppe dar, gefolgt von 5 hoch differenzierten und 3 schlecht differenzierten Karzinomen Klinisches Follow up Das klinische Follow up lag zwischen 2 und 128 Monaten Die Nachbeobachtung erfolgte durch die Kliniken selbst bzw. durch eine urologisch - onkologische Spezialambulanz oder durch ambulant tätige Urologen. Für die vorliegende Arbeit wurde zum einen Einsicht in die Krankenakten der jeweiligen Patienten in den Kliniken für Urologie genommen, zum anderen wurden die nachsorgenden Einrichtungen sowie ggf. die Hausärzte telefonisch interviewt. Außerdem standen die Ambulanzunterlagen dieser Ärzte zur Einsicht zur Verfügung Primäre Aufarbeitung der Präparate Die primäre Aufarbeitung der Präparate begann noch im Operationssaal, wo nach Entnahme des jeweiligen Gewebes eine Fixierung in 4 % gepuffertem Formaldehyd erfolgte. Nach Transport in das jeweilige Institut für Pathologie wurden die Gewebeproben in Paraffin eingebettet. Nach Aufbringen der Paraffinschnitte auf Objektträger mit anschließender Hämatoxylin Eosin - Färbung erfolgte die mikroskopische Begutachtung. 19

25 2.2 Material Chemikalien HE Färbung Eosin Ethanol Hämalaun ( n. Meyer ) Baker Roth Baker Detektionssystem für die Immunhistochemie Biocare 4 plus Universal Immunoperoxidase Detection System Biocarta Antikörper Annexin I polyklonal Zymed Laboratories Inc. Annexin II monoklonal Bio Trend Annexin IV polyklonal Santa Cruz Biotechnology, Inc Kunststoff und Glasmaterialien Objektträger, Deckträger Greiner Objektträgerständer Reaktionsträger ( 1,5 ml; 2,0 ml ) Reaktionsgefäße ( 10 ml; 20 ml ) Falcon Pipettenspitzen Häufig verwendete Lösungen und Chemikalien Aqua dest. Neoclear Neomount Xylene Merck Merck Baker PBS Puffer (1000 ml Aqua dest.; 8,0 g NaCl 0,2 g KH 2 PO 4 ; 2,9 g Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O; 0,2 g KCl ) Citrat Puffer ( 225 ml Aqua dest.; 4,5 ml 0,1 M Zitronensäure; 20,5 ml 0,1 M Natriumcitrat) 20

26 2.2.6 Geräte und Apparaturen Mikrotom Leica / Jung Histoslide 2000 Mikroskop Jenamed 2 Digitales Fotoverarbeitungssytem Minolta Pipetten (1 mikrol bis 2 ml) feuchte Platte PAP Pen Verwendete Software Bei der Erstellung dieser Arbeit kamen folgende Programme zur Anwendung: Word für Windows ( Microsoft ), Excel für Windows ( Microsoft ), Power Point für Windows ( Microsoft ), SPSS - Statistikprogramm. 2.3 Methoden Präparation der Paraffinschnitte Die in den genannten Instituten für Pathologie nach oben genannten Kriterien ausgewählten Paraffinblöcke wurden mit einem Histiotom bei Raumtemperatur geschnitten und auf Objektträger der Firma Greiner aufgebracht. Abschließend erfolgte eine Trocknung der Präparate ebenfalls bei Raumtemperatur für 24 Stunden, um eine optimale Fixierung der Schnitte auf dem Objektträger zu gewährleisten Entparaffinierung Bei der Entparaffinierung der Schnitte wurde nach allgemein gültigem Standard verfahren. Zunächst wurden hierzu die Objektträger für jeweils 10 Minuten in 2 Xylol Bäder (Baker) eingebracht, dann erfolgte ein Umschichten der Objekte für 2 mal 5 Minuten in 100 % Ethanol. Im weiteren Verlauf konnten die Präparate für je 5 Minuten in Ethanollösungen mit absteigender Konzentration (90 %, 80 %, 70 %, 50 %) eingebracht werden. Abschließend erfolgte eine zweimalige Spülung mit Aqua destillata. 21

27 2.3.3 HE Färbung Nach abgeschlossener Entparaffinierung der Schnitte konnte die Färbung zunächst für 5 Minuten in Hämalaun (nach Meyer) beginnen. Anschließend erfolgten eine ausgiebige Spülung der Objektträger mit Aqua destillata und die Inkubation mit Eosin (Baker) für 5 Minuten. Nach zweimaligem Einbringen in 96 % Ethanol sowie einmal in 100 % Ethanol wurden die Proben mit zweimal Neoclear (Merck) für jeweils 10 Minuten fixiert werden. Abschließend wurden die Präparate mit Neomount (Merck) eingedeckelt Antikörperverdünnungen Um eine möglichst optimale Färbung und damit Auswertbarkeit der immunhistochemischen Schnitte zu erzielen, wurden Vorversuche mit unterschiedlichen Antikörperkonzentrationen durchgeführt. Bei diesen wurde vom Procedere identisch wie folgt beschrieben verfahren. Für die Antikörper Annexin I, II und IV erwiesen sich Verdünnungen von 1 : 50, 1 : 100 sowie 1 : 50 als optimal Färbung mit Antikörpern monoklonal / polyklonal Bei dem verwendeten Kit (Biocarta) handelt es sich um ein für monoklonale und polyklonale Antikörper universell einsetzbares Reaktionssystem. Deshalb wurden alle verwendeten Antikörper mit demselben Kit untersucht. Vor Beginn der eigentlichen immunhistochemischen Färbung wurden die aufgezogenen Schnittpräparate, wie bereits oben beschrieben, entparaffiniert. Das weitere Procedere fand auf einer feuchten Platte statt, um ein Austrocknen der Schnitte zu vermeiden. 1. Spülung des Untersuchungsmaterials zweimal für jeweils 5 Minuten mit Aqua destillata, dann Auflegen der Objektträger auf die feuchte Platte und Markierung der Schnitte mit einem PAP Pen. 2. Pro Objekt werden je 4 Tropfen Peroxidazed I aufgebracht und für 5 Minuten inkubiert, um die endogene Peroxidaseaktivität zu hemmen. 3. Waschen der Schnitte je 5 Minuten in Leitungswasser und Aqua destillata. 4. Kochen der Präparate für 20 Minuten in Boarddecloaker, wobei darauf geachtet wurde, ein Austrocknen durch Nachgeben von Boarddecloaker zu vermeiden. 22

28 5. Waschen der Objektträger zweimal jeweils 5 Minuten mit Leitungswasser und Aqua dest. sowie Stabilisierung des Reaktionsmilieus durch PBS Puffer für 5 Minuten. 6. Zur Verringerung von störenden Hintergrundverunreinigungen wurden nun für 5 Minuten Backgroundsniper bzw. Backgrounderaser auf die Präparate aufgebracht. 7. Herstellen der Antikörperverdünnungen und Pipettieren auf die Objektträger und Inkubation im Kühlschrank bei 4 Celsius für 24 Stunden. 8. Entfernen der Antikörperverdünnungen durch zweimalige Spülung mit PBS Puffer für je 10 Minuten. Ein sekundärer Antikörper wurde als Universal Link für ebenfalls 10 Minuten aufgebracht. 9. Zweimalige Spülung mit PBS Puffer, Applikation der Reaktionsperoxidase Streptavidin HRP in Form von je 4 Tropfen auf die Objektträger, 10 minütige Einwirkzeit. 10. Nochmalige Waschung mit PBS Puffer für jeweils 10 Minuten. 11. Farbstoffverdünnung nach der Vorschrift des Herstellers. Je 1 Tropfen DAB Chromogen Substrat pro ml Substratpuffer. Die Lösung wurde auf die Präparate pipettiert (5 Minuten Einwirkzeit). 12. Zehnminütige Spülung mit destilliertem Wasser, jeweils 1 Minute in Hämalaun (nach Meyer) zur Kerngegenfärbung. 13. Abschließend erfolgte eine ausgiebige Spülung mit Leitungswasser und einmalig mit Aqua dest. für 10 Minuten. 14. Dehydratation der Schnitte mittels 100 % Ethanol zweimal für jeweils 10 Minuten, anschließend wiederum zweimaliges Einbringen in Neoclear (Merck) jeweils 5 Minuten und Eindeckeln der histologischen Schnitte mit Neomount (Merck). Bei allen Färbevorgängen wurde simultan eine Negativkontrolle ohne Antikörper angefertigt, um falsch positive Präparationen zu vermeiden. 23

29 Annexin - Expression Die Annexinexpression wurde mikroskopisch nach der Gesamtstärke im Tumorgewebe beurteilt unter Berücksichtigung der Invasionsfront der Karzinome. Die Lokalisation der Expression wurde dabei in jedem Einzelfall zytologisch nach Zellmembran, Zytoplasma und Zellkern bestimmt und sofern vorhanden - mit dem nicht neoplastischen Plattenepithel innerhalb des jeweiligen Präparates verglichen und ausgewertet. Die Stärke der Annexinexpression wurde in folgende 4 Grade unterteilt: +++ sehr starke Expression ++ starke Expression + mäßige Expression - keine Expression vorhanden Als so genannter Annexinscore wurde folgende Einteilung vorgenommen: A 1 schwache Annexinexpression im Bereich der Zellmembran A 2 starke Expression in der Zellmembran bei schwacher Expression im Bereich des Plasmas A 3 starke Annexinexpression von Zellmembran und Zytoplasma Lichtmikroskopische Untersuchung Die lichtmikroskopische Auswertung zur Feststellung der Annexinexpression erfolgte ohne vorherige Kenntnis der TNM Klassifikation. Zusätzlich wurden sämtliche Präparate von zwei unabhängigen Untersuchern nachbegutachtet. Besondere Beachtung wurde auf spezielle Bereiche in den jeweiligen Schnitten gelegt: Färbung im Tumor selbst, Darstellung des dem Tumor angrenzenden Bereiches sowie Färbung von Normalgewebe. Präparate ohne aussagekräftiges, nicht neoplastisches Gewebeareal wurden von der Arbeit ausgenommen. Repräsentative immunhistologische Färbungen wurden photografisch dokumentiert. 24

30 3. Ergebnisse 3.1. Klinische Daten Patienten und Tumorstadien In 6 Fällen handelte es sich um oberflächliche Karzinome, die in 3 Carcinomata in situ und 3 verruköse Karzinome (Buschke - Löwenstein Tumor) unterschieden wurden. 12 Karzinome entsprachen dem Stadium pt1, 7 dem Stadium pt2, 9 dem Stadium pt3 und 1 Karzinom dem Stadium pt4. Bei 1 pt1 - Karzinom lag simultan ein Carcinoma in situ vor. Unter den untersuchten Präparaten fanden sich neben den 3 Carcinomata in situ und den 3 verrukösen Karzinomen 22 G 2, 4 G 1 - und 3 G 3 Karzinome. 16 Patienten hatten Lymphknotenmetastasen, 3 Patienten wurden nach Lymphadenektomie im Stadium pn0 klassifiziert und 16 Patienten wurden im Stadium N 0 diagnostiziert. Darunter befanden sich 6 Patienten mit einem Carcinoma in situ oder einem verrukösen Karzinom, 6 Patienten mit einem Peniskarzinom im Stadium pt1 und jeweils 2 Patienten mit einem pt2 beziehungsweise pt3 Karzinom (siehe Tabelle 7) Überlebensdaten Bezüglich der Überlebensdaten des untersuchten Patientenkollektivs wurde unterschieden zwischen Überlebenszeit mit und ohne Tumorprogression und Tod in Folge der Tumorerkrankung oder aufgrund anderer Ursachen. Bei 10 Patienten konnte aufgrund fehlender Daten keine Aussage zur Überlebenszeit gemacht werden (lost to follow up). 12 Patienten erreichten bis zur Datenerhebung eine tumorfreie Überlebenszeit zwischen 28 und 128 Monaten. Ein Patient lebte in Tumorprogression noch 36 Monate. Tumorbedingte Todesfälle traten bei 10 Patienten nach 2 bis 43 Monaten auf. 2 Patienten verstarben nach 16 und 30 Monaten unabhängig vom Krebsleiden. 25

31 Nr. Alter TNM Grading Überleben (Monate) (Jahre) Carcinoma in situ Carcinoma in situ Carcinoma in situ LTF verruköses Carcinom, Buschke-Löwenstein LTF verruköses Carcinom verruköses Carcinom G pt1pn1m1 G 2 23 DOD pt1pn3m1 G 3 8 DOD pt1pn3m0 G 2 36 AWD pt1n0m0 G 1 LTF pt1n0m0 G pt1n0m0 G 2 LTF pt1n0m0 G 2 LTF pt1n0m0 G 2 LTF pt1pn0m0 G 2 17 DOD pt1pn1m0 G 2 13 DOD pt1n0m0 G pt2n0m0 G pt1pn1m0 G pt2pn1m1 G pt2pn2m1 G 2 10 DOD pt2pn2m0 G 2 LTF pt2pn2m0 G 2 LTF pt2pn3m0 G pt2n0m0 G 1 LTF pt3n0m0 G 2 LTF pt3pn2m0 G pt3n3m1 G 2 6 DOD pt3n2m0 G 2 2 DOD pt3pn0m0 G pt3n2m0 G 1 31 DOD pt3n2m0 G 3 43 DOD pt3n0m0 G pt3pn0m0 G pt4n2m0 G 2 12 DOD Tabelle 7: Daten der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Patienten, LA = Lymphadenektomie, CC = Circumcision, RTX = Radiatio, BD Metastase = Bauchdeckenmetastase, PE = Probexszision, ing. = inguinal, os = ossäre Metastasen, pulmo = pulmonale Metastasen, LTF = Lost to follow up, DOD = Dead of disease, AWD = Alive with disease. 26

32 3.2. Annexin - Expression Annexin I Annexin I Expression in nicht neoplastischem Plattenepithel Die Annexin I Expression im nicht neoplastischen Plattenepithel war bei 14 Patienten stark ausgeprägt (48 %), vier mal mäßig (Annexin score 2) und einmal sehr stark (Annexin score 3). Lediglich geringgradig oder gar nicht wurde dieses Protein bei 10 Patienten angetroffen (34%). Bei 6 Patienten lag in den Präparaten ausschließlich Tumorgewebe vor ohne Anteile von gesundem Plattenepithel. Eine positive Immunreaktion fand sich in basalen und parabasalen Zellen. Bei Hyperplasie des Plattenepithels auch in mittleren und höheren Schichten. Hier waren auch Zellkerne positiv (siehe Abbildung 3 und 4). Darüber hinaus waren die Interzellularbrücken im stratum spinosum häufig positiv, das Zytoplasma sehr schwach positiv oder negativ Expression von Annexin I bei Carcinoma in situ und verrukösem Karzinom Eine starke Annexin I Expression (Annexin Score 3) fand sich bei 1 Patienten, eine mittlere Expression (Annexin Score 2) bei 3 Patienten und eine schwache Expression (Annexin Score 1) bei 2 Patienten. 4 der 6 Patienten mit einem oberflächlichen Karzinom zeigten eine insgesamt starke Annexin I Expression in den Zellkernen. 3 Patienten zeigten eine starke Expression im Zytoplasma. Davon war bei einem Carcinoma in situ die Annexin I Expression im Zellkern sehr stark. In einem verrukösen Karzinom waren die Interzellularbrücken besonders dezidiert dargestellt bei einer insgesamt mäßig starken Expression. Die Zellmembranen waren fast immer Annexin I negativ (Annexin score 3). Ein Carcinoma in situ reagierte bei insgesamt mäßig starker Expression lediglich in den basalen und parabasalen Schichten, während die beiden anderen Carcinomata in situ auch in den Zellkernen der oberflächlichen Epithelschichten Annexin I positiv waren (siehe Abbildung 5 und 6). Bei den 6 Patienten mit oberflächlichem Karzinom fand sich bei 5 Patienten korrespondierendes gesundes Plattenepithel neben dem Tumorgewebe. Davon war das gesunde Plattenepithel insgesamt schwach Annexin I positiv. Dennoch war bei einem Patienten eine sehr starke Annexin I Expression in den Zellkernen zu verifizieren, bei einem weiteren Patienten eine starke Expression des Zytoplasmas in den mittleren Epithelschichten. Ein weiterer Patient hatte eine mittlere bis starke Annexin I Expression im Zytoplasma des Stratum basale (Tabelle 8). 27