J. Naidanow *, L. Minárikova **, G. Barka ***, P. Földi * / ****

Transkript

1 och empffiindlliiche miinosäurenanallyse durrch apiillllar-- ordersäulenderivatisierung mit 66--mi inoquinolyyl l--n--hyydrroxxyyssucccci inimidyyl l--ccaarrbaamaattee (()) J. Naidanow *,. inárikova **,. Barka ***,. öldi * / **** inführung: n den vergangenen Jahren haben sich für die nalyse von minosäuren die ethoden der ordersäulenderivatisierung mit anschließender uftrennungen derselben durch eversed-hase-hromatographie immer mehr gegenüber der klassischen ethode durchgesetzt. Bei letzterer werden sämtliche minosäuren underivatisiert durch onenaustauschchromatographie getrennt und anschließend in einer ixing oil bei erhöhter emperatur mit Ninhydrin umgesetzt [1]. er orteil dieser ethode ist neben ihrer obustheit ihre hohe uflösung. o können z.b. in klinischen roben neben allen 42, sogenannten physiologischen minosäuren auch minozucker analysiert werden. ie ethode ist jedoch relativ unempfindlich, ferner werden für eine einzige nalyse 1 bis 2 tunden benötigt. as deshalb zur teigerung der mpfindlichkeit statt Ninhydrin für die Nachdersäulenderivatisierung verwendete luorescamin konnte dieses jedoch nicht verdrängen [2]. erglichen mit der Nachdersäulenderivatisierung sind die nalysenverfahren der ordersäulenderivatisierung mit anschließender uftrennung der minosäuren durch eversed-hase- in der egel zwar die schnelleren und empfindlicheren echniken, jedoch konnten sich weder die erivatisierung mit 1-imethylamino-naphthalin--sulfonyl-chlorid, N-l [3] oder imethylamino-azobenzol-sulfon-yl-chlorid, B-l [4], noch mit henylisothiocyanat, [] durchsetzen. ründe hierfür sind das ntstehen von Nebenprodukten und die relativ geringe eaktivität von ansyl- und absyl-chlorid, sowie die arbeitsintensive erivatisierung bzw. die Notwendigkeit mehrmals evakuieren zu müssen, um überschüssiges zu entfernen [6]. ie ordersäulenderivatisierung der minosäuren mit ortho-hthaldialdehyd, O, und einem hiol, z.b. 3-ercaptoethanol oder thanthiol, ist eine der modernsten echniken []. ie zeichnet sich vor allem durch hohe mpfindlichkeit, > 1 fol, und kürzeste nalysenzeiten aus [8]. on großem Nachteil ist jedoch, daß ortho-hthaldialdehyd nicht mit sekundären minen wie rolin oder ydroxyprolin reagiert und seine ddukte instabil sind [9]. Besonderes nteresse findet jedoch die hochempfindliche nalyse der enatiomeren - und -minosäuren in Nahrungsmitteln durch vollautomatische ordersäulenderivatisierung mit O und N-sobutyryl-cystein mit anschließender rennung aller iastereomeren durch eversed-hase- [1 / 11]. Um die erwähnten Nachteile bei der nalyse von roteinhydrolysat, zerebrospinaler lüssigkeit, erum, eewasser etc. zu umgehen, beschrieben 1983 B. Josefsson et al. erstmalig die erivatisierung der minosäuren mit 9-luorenylmethoxycarbonyl-chlorid, O [12 / 13]. ie erivate des für die eptidsynthese verwendeten O s zeichnen sich besonders durch ihre niedere Nachweisgrenze, < fol, sowie ihre hohe tabilität, > 24 td., aus. owohl bei manueller, als auch bei automatischer erivatisierung kann das zur völligen Umsetzung der minosäuren notwendige, im Überschuß zugesetzte, jedoch die uswertung der hromatogramme störende O einfach durch Zugabe von 1-mino-adamantan gebunden werden [14]. in weiterer, besonders hervorstechender orteil dieser ethode ist, daß nach rsetzen des O s durch sein chirales nalogon (+)-1-(9- luorenyl)ethylchloroformat, unter ansonsten identischen eaktions- und nahezu gleichen rennbedingungen leicht robengemische enantiomerer minosäuren und mine analysiert werden können [1]. a jede der kurz erwähnten ethoden im ergleich mit jeder anderen nicht nur mehr oder weniger orteile, sondern auch Nachteile hat, ist es bis dato unumgänglich für die jeweilige roblemstellung die jeweils optimale ethode auszusuchen. eil jedoch rforschung und iagnose z.b. der lzheimer schen- und anderer schwerwiegender, vielfach genetisch bedingter rankheiten [16] ebenso wie die nalyse von roteomen immer höhere mpfindlichkeit bei stets nur minimalen zur erfügung stehenden robenmengen erfordern, war es das Ziel der im olgenden beschriebenen xperimente, die für tandard- bzw. analytische bereits beschriebene ordersäulenderivatisierung der minosäuren mit 6-minoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamat () weiter zu entwickeln [1]. ie neue ethode sollte robust, manuel und automatisch einfach zu handhaben und zumindest so empfindlich wie die erivatisierung mit O oder O sein. ies wiederum bedeutet, sie muß Nano- und apillar- tauglich sein und darüber hinaus den rforder- 1

2 nissen einer modernen nalytik von roteomen genügen [18]. aterialien und ethoden: ie nalysen der human lasma-, Biopsi- und efeextraktproben wurden mit einem -ystem bestehend aus folgenden omponenten durchgeführt: elta- hrom 1 (master) + 1s (slave) umpe (ochdruckgradient / (atrex rague, zech epublic), idas utosampler (park olland), 14 luoreszenz-etector (gilent echnologies), and Z-hrom-atastation (cientific oftware, U). ür die ikrobore- und Narrowbore-hromatographie stand ein -ystem von hermo innigan, armstadt, zur erfügung. ies bestand aus einer -umpe odell 4, einem utoinjektor / äulenthermostaten odell 3, einem U-etektor odel pektra ocus (lußzelle 1,3 µ / chichtdicke 3 mm) und einem luoreszenz-etektor odell 2 (lußzelle 3 µ / 2 mm). ie atenerfassung und teuerung der nlage erfolgte mit einem mit thlon/ 1 z ikroprozessor ausgestatteten und oftware ebenfalls von hermo innigan. as für die nano- und apillar-äulen verwendete -ystem der a. unchrom, riedrichsdorf, bestand aus der apillar--umpe odell icroro (pritzenvolumen 2 m), wahlweise einem manuellen ikroinjektionsventil odell Upchurch cientific -43 oder aber für die automatische erivatisierung aus einem utosampler odell ndurance, einem U-etektor odell pectraflow 1 ausgestattet mit einer 4 n lußzelle (chichtdicke 1 cm). esteuert wurde das ystem bzw. die aten erfaßt mit der hromstar oftware 6., ebenfalls von unhrom. - lle luenten wurden stets kontinuierlich mit elium begast. J.. laughter modifizierten ethode von. Ohsurni et al. extrahiert [19 / 2]. olonzellgewebe: 1-3 mg olongewebe wurde 1 minuten lang in 2 µl asser bei inkubiert. ie ischung wurde kurz zentrifugiert, und 1 ul des Überstandes mit 4 µl cetonitril versetzt. ieser xtrat wurde intensiv geschüttelt (ortex) und 1 inuten lang bei 1 x g zentrifugiert. ie als tandards verwendeten minosäuren wurden von erva, eidelberg, bezogen, lutionsbzw. ösungsmittel ( grade), sowie uffersubstanzen (p.a.) hingegen von erck, armstadt. Narrowbore- (1 x 2 mm) und apillarsäulen (1 mm x 3 µm) gepackt mit O aphir 18 bzw. 8-3 µm waren großzügiger eise von O nalytik + zur erfügung gestellt worden, die analytischen - äulen (X 2 x 4 mm mino cid- µm with 2 x 4mm orsäule) und das erivatisierungsreagenz jedoch von X raha s.r.o. lle minosäurenstandards und roben wurden nach einer orschrift ebenfalls von X derivatisiert [21]. iskussion und rgebnisse: a es das erklärte Ziel der im olgenden diskutierten xperimente war, eine einfach and zu habende, zuverlässige ethode zur minosäurenanalyse in der roteomforschung zu entwickeln, wurde besonders nach für diese pplikation speziell geeigneten stationären hasen gesucht, die auch gepackt als apillarsäulen leicht kommerziell erhältlich sind. us diesem runde waren zwar zunächst für tandardanalysen eltahrom - äulen - µm (2 x 4mm) von X verwendet worden (bb. 1 / 2), jedoch wurden um die 2 [m] 1 1 N t [min] N 3 tationäre hase: X mino cid- µm; äule: 2 x 4 mm mit 2 x 4-mm-orsäule; luent : 1 m Na-cetat uffer p 6,4; luent B: % N / asser = 6 / 4 3 %; radient: -18% B (-4 min), 18-19% B (4-1 min), 19-3% B (1-16 min), 3-4% B (16-24 min); 4-6% B (24-31 min); lußrate: 1, m; lin. luss: 1,99 mm/sek; ruck: 2-24 a; emperatur: 3 ; etektion (l): 24 exc.- 39 em; lusszelle: 16µ.; njektion: 2 µ; robe: xtrakt von olonzellgewebe tationäre hase: X mino cid- µm; äule: 2 x 4 mm mit 2 x 4 mm orsäule; luent : 1 m Na-cetat uffer p 6,4; luent B: % N / asser = 6 / 4 3 %; radient: -18% B (-4 min), 18-19% B (4-1 min), 19-3% B (1-16 min), 3-4% B (16-24 min); 4-6% B (24-31 min); lußrate: 1,m/min; lin. luß: 1,99; mm/sek; ruck: 2-24 a; emperatur: 3 ; etektion(l): 24 exc.- 39 em; lußzelle: 16µ.; njektion: 2µ; robe: efezellextrakt, bb. 1 ermentationskontrolle - nalyse eines efeextraktes efezellen: Zwei oder drei efekolonieen wurden in 3 ml asser suspendiert. nschießend wurden die minosäuren nach der durch.. ent und bb. 2 minosäurenanalyse in der Onkologie Biopsie von olonzellgewebe mpfindlichkeit der nalysen zu steigern nach einem creening mehrerer stationärer hasen ausschließlich Narrowbore- und apillarsäulen gepackt mit O aphir 18-3 µm (1 x 2 mm bzw. x 3 µm) verwendet. Obgleich die chromatographischen Bedingungen wie äulenlänge 1 cm, artikelgröße 3 µm, lutionspuffer 2

3 m Na-cetat p, bzw. 6, und emperatur 4 optimiert worden waren, konnten mit der O aphir 18-hase keine zufriedenstellende nalysenzeiten (~ 6 min) erzielt werden (bb. 3). eshalb wurde diese zu gezeigt werden, daß die minosäuren nach ihrer erivatisierung mit, aufbewahrt im arusell eines utoinjektors über 1 td. bei aumtempe- [m] 6 3 pmol eakfläche 6 al le N 4 eu rp Zeit [td.] tationäre hase: O aphir 11 18, 3 µm, 1 x 2 mm; luent : m Na-cetat uffer p,; luent B: % N, 3 % Na-cetat p 6; radient: 2, % B (-2, min), 2,-6 % B (2,- 3 min), 6-18 % B (3- min), % B (- min); % B (-6 min), 28-1 % B(6-6 min), 1 % B (6- min), 1-2, % B (-2 min) ; lussrate: 1,86 mm/sek; ruck: 23, a; emperatur: 4 ; etektion( U ): 24 nm; lusszelle: 1,2 µ / 3 mm; njektion: 1 µ tandard ( 1µ ng je minosäure) bb. 3 Optimierte rennbedingungen auf O-hase (O aphir µm ) guter etzt durch O aphir 8 ersetzt und so die nalysenzeiten um > 2 inuten verkürzt (bb. 4). uf eine weitere erkürzung der nalysenzeit durch rsetzen der 1 cm langen -äulen, durch solche der änge von 12, cm war für die outine verzichtet worden, da die neue ethode robust und sicher sein sollte. 11 eakfläche bb. tabilitätstest bei 21 (chromatographische Bedingungen s. bb. 3) ly hr ro rp sp lu xt [m] pmol +N N 3 t [min] Zeit [age] bb. 6 tabilitätstest bei 4 (chromatographische Bedingungen s. bb. 3) ratur (bb. ) und bei 4 z.b. aufbewahrt in einem utosampler sogar über 14 age (bb. 6) stabil sind. bbildungen und 8 bestätigen wie erwartet, daß luoreszens- etwa bis 1mal empfindlicher ist als U-etektion. ies gilt nicht nur für die minosäurenanalyse und ist jeweils vor allem abhängig von durchstrahltem olumnen und chichtdicke der verwendeten urchflußzellen, nicht aber von den imensionen der für den ergleich eingesetzten -äule. eider sind tationäre hase: O aphir 11 8, 3 µm; äule: 1 x 2 mm; luent : m Na-cetat uffer p,; luent B: % N, 3 % Na-cetat p 6; radient: 4-1% B (-2 min), 1-29% B (2-3 min), 29-1% B (3-4 min), 1% B (4- min); 4% B (- min), 4% B (-6 min); luß (lin. vel.): 2,12 mm/sek; ruck: 23, a; emperatur: 4 ; etektion(u): 24 nm; lusszelle: 1,2 µ/3 mm; njektion: 1 µ; robe: minosäurenstandard ng/µ (1 µ 3 pmol), U [m] 2 + bb. 4 Optimierte rennbedingungen auf Octyl- hase (O aphir µm) Um abors, in denen für die nalyse von minosäuren kein ollautomat zur erfügung steht, den instieg in diese, d.h. manuelles erivatisieren, zu ermöglichen, vor allem aber um die erivatisierung selbst bzw. vollständige urchmischung kleinster olumnia (> 2 µ) von robe, eagenz und uffern optimieren zu können, wurde die tabilität der derivatisierten minosäuren nicht nur bei 4, sondern auch bei aumtemperatur untersucht. s konnte daher 1 1 pmol/µ pmol/µ tationäre hase: O aphir 11 18, 3 µm, 1 x 2 mm; luent : m Na-cetat uffer p,; luent B: % N, 3 % Na-cetat p 6; radient: 2 % B (-2, min), 2-3 % B (2- min), 3-1 % B (- min), 1 % B (-8 min); 2 % B (8-82 min), 2 % B (82-9 min);lussrate: 1,6 mm/sek; ruck: 2 a; emperatur: ; etektion(u): 24 nm; lusszelle: 3 µ / 2 mm; njektion: 1 µ; robe: minosäurenstandard mit,6 ng/µ(1 µ pmol) und 6 pg/µ (1 µ pmol) 3 bb. Nachweisgrenze mit Narrowbore--äule (2 mm ) und U-etektion

4 ,14,12 [m],1,8,6,4,2 1 pmol/µ 1 fmol/µ einem geeigneten utosampler, der kleinste robenmengen vollautomatisch derivatisieren und injizieren kann, können diese orteile voll ausgeschöpft werden (bb. 1). ie enauigkeit dieser modernen ethode, nämlich der automatischen, aber auch der manuellen ordersäulenderivatisierung der minosäuren mit und nschließender rennung der erivate durch Nano- oder apillar-, steht den anderen ethoden somit nicht nach, sondern scheint sogar diesen nicht nur wegen ihrer wesentlich einfacheren andhabung überlegen zu sein. tationäre hase: O aphir 11 18, 3 µm, 1 x 2 mm; luent : m Na-cetat uffer p,; luent B: % N, 3 % Na-cetat p 6; radient: 2 % B (-2, min), 2-3 % B (2- min), 3-1 % B (- min), 1 % B (-8 min); 2 % B (8-82 min), 2 % B (82-9 min);lussrate: 1,6 mm/sek; ruck: 2 a; emperatur: ; etektion(): 2 nm exc, 39 nm em; lusszelle: 3 µ / 2 mm, njektion: 1 µ; robe: minosäurenstandard 1,1 ng/µ (1 µ 1 pmol) und 11 pg/µ(1 µ 1 fmol) bb. 8 Nachweisgrenze mit Narrowbore--äule (2 mm ) und luoreszensdetektion jedoch zur Zeit für diese pplikation noch keine konventionellen luoreszensdetektoren mit entsprechend kleinen, d.h. für die apillar- und Nano- geeigneten, urchflußzellen kommerziell erhältlich. aser-nduzierten-luoreszezdetektoren mit der erforderlichen nregungswellenlänge 2 nm stehen derzeit ebenfalls noch nicht zur erfügung. ennoch ermöglicht die erwendung einer apillarsäule (3 µm ) und eines entsprechenden U-etektors statt einer Narrowbore-äule (2 mm ) und eines luoreszenzdetektors gleich hohe mpfindlichkeit für die nalyse der minosäuren, nämlich ca. 1 fmol (bb. 9). ird jedoch diese apillarsäule nochmals z.b. gegen eine Nano--äule ( µm ) ausgetauscht, so ist eine weitere rniedrigung des etektionslimits um das ca. 4- fache zu erwarten. [m] N pmol 1 pmol bb. 9 etektionslimit der mit derivatisierten minosäuren mit apillar-- äulen und anschließender U-etektion tationary phase: O apphire µm, olumn size: 1 mm x.3 mm luent : m Na-acetate p., B: % N - m Na-acetate p 6. (v/v), radient:.2 1% ( 3 min), 1 6% (3 8 min), low (lin. vel.):.8 mm/s, emperature: 4, etector (U): 24 nm, low cell: 1 mm / 4 n, njection: 1 n, ample: standard micture (~ 1 pol of each amino acid) ür die nalyse von roteomen ist neben der hohen mpfindlichkeit die nur geringe robenmenge bzw. das sehr kleine -olumen, das für die njektion auf eine apillar--säule benötigt wird, ein weiterer außerordentlicher orteil. it 2 m Zusammenfassung: ie beschriebene ethode der ordersäulenderivatisierung mit zur nalyse von minosäuren zeichnet sich besonders vor allen anderen, oben kurz erwähnten echniken durch ihre einfache andhabung aus. ies liegt darin begründet, daß die gebildeten erivate wesentlich stabiler sind als die vergleichbarer ethoden. erner kann bei U- etektion der -erivate die Nachweisgrenze durch insatz von apillarsäulen (3 µm ) statt analytischer äulen (4, bzw. 4,6 mm ) mehr als 2-fach erniedrigt bzw. die mpfindlichkeit der ethode erhöht werden. ieses rgebnis kann jedoch mit Nano--äuen (< 1 µm ) noch wesentlich verbessert werden. ie nach ordersäulenderivatisierung von minosäuren mit mit apillarsäulen und U-etektion erzielte mpfindlichkeit entsprechender nalysen ist also mindestens eben so hoch wie die mit analytischen äulen und luoreszensdetektion erzielte von O- und O-erivaten. ie U-etektion bietet gegenüber der luoreszenzdetektion noch einen weiteren beachtlichen orteil, nämlich daß ryptophan ebenfalls hochempfindlich bestimmt werden kann. ies ist wegen der intramolekularen luoreszenzlöschung ansonsten nicht möglich. ie skizzierten rgebnisse unterlegen wegen der erzielten, hohen mpfindlichkeit und der einfachen andhabung somit den chluß, daß im direkten ergleich mit anderen ethoden die erivatisierung der minosäuren mit mehr orteile als jene hat. 4

5 usblick: s wird nach einem kostengünstigen aser-nduzierten-luoreszenzdetektor gesucht. it nano--äulen (< 1 µm) und diesem könnte dann, zumal entsprechende nano- urchflußzellen bereits zur erfügung stehen, die mpfindlichkeit für die nalyse der minosäüren durch ordersäulenderivatisierung bis in den. unteren ato-olbereich ausgedehnt bzw verbessert werden. iese sehr hohe mpfindlichkeit zu erreichen scheint zwar technisch möglich zu sein, ob dies jedoch auch sinnvoll ist, d.h. wegen ontamination, rbeitsaufwand etc. praktisch handhabbar sein wird, müssen weitere xperimente erst noch unter Beweis stellen. iteratur [1].. packman,.. tein,. oore, nal. hem. 3, (198) [2]. Udenfriend,. tein,. Böhlen,. airman,. eimgruber,. eigele, cience 18, (192) [3]. apuhi,.. chmidt,. indner, B.. arger, nal. Biochem. 11, (1981) [4] J.. hang,. artin,. Bernasconi,.. Braun, B ett. 132, (1981) [].. einrickson,..eredith, nal. Biochem. 136, 6 4 (1983) [6] B. Bidlingmeyer,.. ohen,.. arvin, J. hromatogr. 336, (1984) [].. ill,.. alters,.. ilson, J.. tuart, nal. hem. 1, (199) [8] h. raser,. odel,. öldi,. ürst, nal. Biochem. 11, (198) [9]. odel, h. raser,. öldi,. ürst, J. hromatogr 29, ( 1984) [1]. Brückner,. Jack,. anger,. odel, mino cids 2, (192) [11]. Brückner,. esthauser, hromatographia 39, (1994) [12]. inarsson, B. Josefsson,. agerkvist, J. hromatogr. 282, (1983) [13]. inarsson,. olestad, B. Josefsson,. agerkvist, nal. hem. 8, (1986) [14]. Betnér,. öldi, + agazine 6, (1988) [1]. inarsson, B. Josefsson, nal. hem. 9, (198) [16]. horsén, J. Bergquist,. estlind-abielsson, B. Josefsson, nal. hem 3, (21) [1].. ohen,.. ichaud, nal. Biochem. 211, (1993) [18]. lein,. öldi, aborraxis 2, (22) [19].. ent, and J.. laughter, J, ppl. icrobiol. 84, 2-8 (1998) [2]. Ohsumi,. itamoto and. nraku, 1, (1988) [21] orschrift zur erivatisierung v. minosäuren mit, X raha s.r.o., rag (24) ie utoren danken. rom, O nalytik+ (ottembnburg- ailfingen), für das großzügige Zurvefügungstellen der Narowboreund apillarsäulen, sowie. inarik, X raha s.r.o (rag, ), für das -eagenz. Besonderer ank für experimentelle Unterstützung und anregende iskussionen gilt. antova, atrex raha s.r.o and Z.alkova (epartment of olecular Biology, harles University, rague). erner danken wir. Nickiesch- artfiel, ochschule Niederrhein, z.b. für ihre praktische Unterstützung bei der Beschaffung von nstrumenten und hemikalien. * bt. f. Biotechnologie, ochschule Niederrhein, refeld, ** bt. f. olekulare Biologie, arls-universität, rag, *** unhrom, riedrichsdorf, **** O hromatography (-ON), otenburg-ailfingen,