Mechanismen und On-line Dosimetrie bei selektiver RPE Therapie

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1 Aus der Medizinischen Laserzentrum GmbH Wissenschaftliche Einrichtung der Medizinischen Universität zu Lübeck Forschungsleiter und Geschäftsführer Prof. Dr. phil. nat. Reginald Birngruber Mechanismen und On-line Dosimetrie bei selektiver RPE Therapie Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Universität zu Lübeck Aus der Technisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät vorgelegt von Georg Schüle aus Pforzheim Lübeck 2002

2 Schüle, Georg: Mechanismen und On-line Dosimetrie bei selektiver RPE Therapie / Georg Schüle. Als Ms. gedr.. Berlin : dissertation.de Verlag im Internet GmbH, 2003 Zugl.: Lübeck, Univ., Diss., 2003 ISBN X 1. Berichterstatter: Prof. Dr. R. Birngruber 2. Berichterstatter: Prof. Dr. J. Roider Tag der mündlichen Prüfung: Zum Druck genehmigt, Lübeck den Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über < abrufbar. Copyright dissertation.de Verlag im Internet GmbH 2003 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, auf Datenträgern oder im Internet und der Übersetzung, vorbehalten. Es wird ausschließlich chlorfrei gebleichtes Papier (TCF) nach DIN-ISO 9706 verwendet. Printed in Germany. dissertation.de - Verlag im Internet GmbH Pestalozzistraße Berlin URL:

3 Inhaltsverzeichnis 1 1 Einleitung Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus Die Retina Das retinale Pigmentepithel (RPE) Melanosomen des RPE Lipofuszin und Melanolipofuszin des RPE Retinale Autofluoreszenz (AF) Krankheitsbilder der Makula Laserbestrahlung des Fundus Wechselwirkung okularer Medien mit Laserlicht Die Photokoagulation Die selektive RPE Therapie (SRT) Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung Thermische RPE Schädigung Autofluoreszenz basierter Nachweis von RPE-Schädigung Thermomechanische RPE Schädigung Optoakustischer Nachweis von RPE-Schädigung Reflexbasierter Nachweis von RPE-Schädigung Material und Methoden Laser Frequenzverdoppelter Nd:YLF-Laser Frequenzverdoppelter klinischer Nd:YAG-Laser Frequenzverdoppelter experimenteller Nd:YAG-Laser Argon-Laser Spekle-Werte bei verschiedenen Lasersystemen Optoakustik Piezoelektrischer Effekt Schallwandler in vitro (PIN-Transducer) Schallwandler in vivo (OA-Kontaktglas) Kalibrierung der Schallwandler Schallfeldsimulationen zur Empfangscharakteristik des OA- Kontaktglases Organmodell Schweine-RPE Probenpräparation Vitalitätsassay CalceinAM... 42

4 2 Inhaltsverzeichnis 5.4 Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie Thermische Denaturierungsmessung an A2E On-line Fluoreszenzdetektion an der Spaltlampe Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver RPE Behandlung Optoakustische On-line Dosimetrie Optoakustische Dosimetrie an der Spaltlampe in vitro Optoakustische Dosimetrie bei Patientenbehandlung Reflexbasierte On-line Dosimetrie Reflexdetektion an der Spaltlampe in vitro Reflexdetektion bei der Bestrahlung von Kaninchen Mikroblasenbildungs- und Zellschadensschwellen bei Lichtexposition von RPE-Proben im µs- bis ms-zeitbereich Parameterstudien in vivo am Kaninchen Tiere Laserbestrahlung Datenauswertung der Parameterstudie Schadensschwellenbestimmung mit Probit Morphologische Untersuchungsmethoden Patientenbehandlungen Temperaturbestimmung mit optoakustischen Methoden Grundlagen zur OA-Temperaturbestimmung Bestimmung der Materialkonstante für RPE Umsetzung bei selektiver RPE Behandlung Modellrechnungen Wärmeleitung lichtabsorbierender Strukturen Temperatur- und thermische Denaturierungsberechnungen im µs bis ms-zeitbereich Berechnungen der Grundtemperaturerhöhung im RPE bei gepulster Bestrahlung Ergebnisse und Diskussion Spekle-Werte der Lasersysteme Empfindlichkeit der Schallwandler Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases Temperaturmessung mit Optoakustik Temperaturabhängigkeit der Druckamplitude für Schweine RPE Temperaturmessungen an Schweine-RPE bei gepulster Bestrahlung Temperaturbestimmung bei Patientenbehandlungen Temperaturgenauigkeit der OA-Temperaturmessung Grundtemperaturerhöhung bei repetitiver Bestrahlung in Abhängigkeit des Bestrahlungsdurchmessers 88

5 Inhaltsverzeichnis Retinale Schadensmechanismen und -schwellen Mikroblasenbildungs- und RPE-Zellschadensschwellen bei Lichtexposition im µs- bis ms-zeitbereich Temperatur- und Arrheniusberechnungen im Melanosomenfeld Schadensschwellen in vivo am Kaninchenauge Histologische Ergebnisse Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie A2E Fluoreszenz und thermische Stabilität AF-Messung bei Bestrahlung von Schweine-RPE AF-Messung bei Bestrahlung von Kaninchen AF-Messung bei Patientenbehandlung Spektral aufgelöste AF-Messungen bei Patientenbehandlung Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver Patientenbehandlung Optoakustische On-line Dosimetrie Optoakustische Transienten bei Bestrahlung von Schweine RPE Datenauswertung der optoakustischen Transienten Ergebnisse der OA-Dosimetrie bei in vitro Bestrahlungen OA-Dosimetrie bei Patientenbehandlung Vergleich zwischen Fluoreszenzangiographie und OA-Wert Vergleich ICG-Angiographie Intensität und OA-Wert Transienten verschiedener OA-Werte Vergleichbarkeit der OA-Ergebnisse Fehlerquellen bei der OA On-line Dosimetrie Reflexbasierte On-line Dosimetrie im Tiermodell Reflexmessungen bei Kaninchen-Bestrahlung Folgerungen und Ausblick RPE-Schadensmechanismus Behandlungsparameter On-line Dosimetrie Zusammenfassung Literatur Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung

6 4 Inhaltsverzeichnis

7 Kapitel:1 Einleitung 5 1 Einleitung Die selektive Behandlung des retinalen Pigmentepithels (RPE) ist eine neue Therapiemethode für verschiedene Erkrankungen des Augenhintergrunds. Im Gegensatz zu der konventionell verwendeten Photokoagulation der Retina mit kontinuierlichen (~50 ms) Lasern kann durch Applikation einer Serie von µs-laserpulsen das RPE selektiv geschädigt, die Photorezeptoren aber gleichzeitig geschont werden. Dies wurde in den grundlegenden Arbeiten von Roider und Birngruber am Kaninchenmodell [1, 2] und bei der Behandlung von Patienten [3, 4] gezeigt. Da die am RPE gesetzten Schäden für den behandelnden Ophthalmologen nicht sichtbar sind, muß die Behandlung quasi blind durchgeführt werden. Erst nach der Bestrahlung kann durch eine Fluoreszenzangiographie der Schaden des RPE invasiv nachgewiesen werden. Obwohl die selektive RPE Therapie (SRT) schon seit nunmehr fünf Jahren klinisch erprobt wird, ist der genaue RPE-Schadensmechanismus bei repetitiver µs-bestrahlung noch unklar. Die grundlegende Idee basiert auf der Annahme eines rein thermischen Schadenmodells, bei dem eine Reduzierung der RPE-Schadensschwelle durch die Additivität der gesetzten thermischen Schäden mittels multipler Pulse gegeben ist. Die Laserpulsdauer wird so gewählt, dass man eine selektive Erwärmung des RPEs erreicht, wobei die direkt angrenzenden Photorezeptorschichten nur gering erwärmt werden. Mit einem thermischen Modell des RPEs, das die Granularität der absorbierenden Melaningranula berücksichtigt, ließ sich eine selektive Erwärmung mittels µs-laserpulsen nachweisen [2]. Eine mechanische Disruption, wie sie mit ns-laserpulsen beschrieben war [5], galt es zu vermeiden. Die ersten experimentellen Ergebnisse am Kaninchen zeigten den Effekt der Additivität der applizierten 5 µs Laserpulse [2]. Bei der Bestrahlung von Kaninchen mit repetitierenden 200 ns Nd:YAG-Laserpulsen wurden oberhalb der ophthalmologischen Schwelle auch kleine, stationäre und intraretinal lokalisierte Blasen entdeckt [6, 7], und ein möglicher thermomechanischer Schadensmechanismus diskutiert. Die Entstehung von Mikroblasen durch Verdampfung an den stark lichtabsorbierenden Melanosomen und der damit verbundene thermomechanische RPE-Schaden wurde von Kelly für die Bestrahlung mit ns- bis ps-laserpulsen beschrieben [8, 9, 10]. In der Arbeit von Rögener zeigte sich, dass einerseits die Schwelle für Mikroblasenbildung um Einzelmelanosomen und für RPE-Zellschaden für 8 ns Laserpulse übereinstimmen, andererseits bei 3 µs Laserpulsen die Schwelle für Mikroblasenbildung 40 % höher lag als die RPE-Schadensschwelle [11, 12]. Der Unterschied der Schwellen bei 3 µs Laserpulsen konnte durch Wärmediffusion benachbarter Melanosomen innerhalb einer RPE-Zelle erklärt werden. Ein experimenteller Nachweis wurde nicht gegeben [11]. Der Übergang von der bekannten rein thermischen RPE-Denaturierung mit ms-laserpulsen [13] zu

8 6 Kapitel:1 Einleitung einem thermomechanischen Schaden durch Mikroblasenbildung bei ns-laserpulsen [11] kann aus den Daten zur Lasersicherheit [16] bei 50 µs vermutet werden. Bei dieser Pulsdauer ergibt sich eine Änderung der Steigung der Schadensschwellenkurve. Ziele der vorliegenden Arbeit waren: I.) Untersuchungen zum RPE-Schadensmechanismus bei SRT: Für den Nachweis Mikroblasenbildung bei SRT wurden zwei physikalisch voneinander getrennte Detektionsmechanismen eingesetzt. Einerseits wurde gezeigt, dass bei der Entstehung und Kollaps von Kavitationsblasen akustische Transienten emittiert werden [17], andererseits läßt sich die bei Blasenbildung entstehe Rückreflexion von Licht an der Blasenoberfläche nachweisen [18]. Beide Nachweismethoden wurden in dieser Arbeit sowohl in vitro als auch in vivo eingesetzt. Den Schwerpunkt bildete dabei der akustische Nachweis der Mikroblasen. Um den bisher undefinierten Übergang von einem thermischen Schaden im ms-zeitbereich zu einem Schaden mit Mikroblasenbildung bei kürzeren Laserpulsen zu untersuchen, wurde ein Schweine-RPE Organmodell mit Einzelpulsen von 5 µs, 50 µs, 500 µs und 3 ms Pulslänge bestrahlt und die akustischen Transienten und die Reflexionssignale gemessen. Der RPE-Zellschaden kann durch den Vitalitätsmarker CalceinAM nachgewiesen werden. Es wurden die RPE-Schadensschwellen und die Schwellen für Mikroblasenbildung gemessen und statistisch ausgewertet. Die experimentellen Ergebnisse wurden an einem mathematischen Modell nach Arrhenius zur thermischen Denaturierung innerhalb eines Melanosomenfeldes mit den gemessenen Schwellenparametern analysiert. II.) Analyse weiterer Behandlungsparameter: Vergleichend zu den ersten tierexperimentellen Untersuchungen zur SRT [1, 2, 6, 7], bei denen eine rein thermische RPE-Schädigung angenommen wurde, konnten basierend auf dem gemessenen RPE-Schadensmechanismus in tierexperimentellen Untersuchungen verschiedene Laserparameter analysiert werden. Im Vergleich zu anderen Arbeiten [1, 2, 6, 7] sind vor allem kürzere Pulslängen von 8 ns, 200 ns, 1.7 µs in Abhängigkeit von der Anzahl der Pulse und der Pulswiederholrate untersucht worden. Diese ermöglichen einen fundierten Überblick über den gegebenen Parameterraum, führen zu Verbesserungen und einem erweitertem Verständnis dieser Methode. III.) Entwicklung eines On-line Dosimetriesystems zum nichtinvasiven Nachweis der RPE-Schädigung bei SRT: Zwei voneinander unabhängige On-line Dosimetriesysteme wurden entwickelt, die auf den beiden möglichen Schadensmechanismen beruhen. Beide Systeme wurden sowohl am RPE-Organmodell als auch bei Patientenbehandlungen eingesetzt. Somit bestand die Möglichkeit die am Organmodell entwickelten Methoden, in der Praxis bei Patientenbehandlungen zu testen und zu verifizieren. Als eine nichtinvasive Methode zum Nachweis des RPE-Schadens bei einer thermischen Denaturierung wurde die retinale Autofluoreszenzänderung bei Bestrahlung untersucht. Die retinale Autofluoreszenz geht von dem im RPE enthaltenen Lipofuszin aus [19].

9 Kapitel:1 Einleitung 7 Natürliche Fluorophore sind meistens thermisch instabil und ändern ihre Fluoreszenzeigenschaften bei Erwärmung. Da Lipofuszin in der RPE-Zelle vorliegt [20], kann somit auch räumlich aufgelöst untersucht werden, ob sich aus einer thermischer Denaturierung und der damit verbundenen Änderung der retinalen Autofluoreszenz auf eine Schadensschwelle geschlossen werden kann. Es wurde sowohl die Änderung der Fluoreszenzlichtleistung als auch die spektrale Verteilung der Fluoreszenz während der Bestrahlung gemessen und analysiert. Als zweiter nichtinvasiver Ansatz zum Nachweis von thermomechanischer RPE-Schädigung wurden die akustischen Signale, die bei der Mikroblasenbildung entstehen gemessen. Dafür wurde ein Schallempfänger entwickelt, der in ein ophthalmologisches Kontaktglas integriert war. Seine Empfindlichkeit von 5 V/bar erlaubt es, die schwachen Transienten direkt während der Patientenbehandlung zu messen. Schallfeldsimulationen zur Empfangscharakteristik des Kontaktglases zeigten eine hohe Variabilität der akustischen Transienten in Abhängigkeit von der jeweiligen Lokalisation im Auge. Zur Auswertung der akustischen Transienten wurde deshalb ein stabiler Algorithmus entwickelt, der es erlaubte die Daten On-line zu analysieren und ein klares Schwellenkriterium zu liefern. Beide Systeme wurden mit den klinischen Ergebnissen der RPE-Effekte verglichen und zuletzt ein kompaktes, rechnergestütztes On-line Dosimetriesystem aufgebaut, das erlaubt, den RPE-Schaden bei der SRT nichtinvasiv nachzuweisen.

10 8 Kapitel:1 Einleitung

11 Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus 9 2 Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus In diesem einleitenden Kapitel sollen die anatomischen Strukturen des Augenhintergrundes und die im Rahmen dieser Arbeit vorkommenden Krankheitsbilder erklärt werden. 2.1 Die Retina Die Retina enthält die Sinneszellen, die den Lichtreiz aufnehmen. Durch Weiterverarbeitung entstehen Signale, welche die Sehinformation an das Sehzentrum des Gehirns weiterleiten. Die Netzhaut besteht aus drei hintereinander geschalteten Neuronen, den Photorezeptoren, den Bipolarzellen und den Ganglienzellen (Abb. 2.1). Das erste Neuron sind die Kerne der Photorezeptoren. Sie setzen sich aus 6 Mio. Zapfen und 120 Mio. Stäbchen zusammen. Diese tauchen mit ihren Außensegmenten in das dahinterliegende retinale Pigmentepithel (RPE) ein. Zapfen und Stäbchen unterscheiden sich in Aufbau und Funktion. Die Stäbchen liegen in der Peripherie und sind für das Dämmerungssehen und bei Helligkeit für die Wahrnehmung von Bewegungen in der Peripherie verantwortlich, während sich die Zapfen in der Netzhautmitte befinden und für das Sehen bei Tage und das Farbsehen zuständig sind. Im Zentrum befindet sich die Stelle des schärfsten Sehens, die als Makula lutea, "gelber Fleck", bezeichnet wird. Die Fovea centralis, die sich im Zentrum der Makula befindet, besteht nur aus Zapfen. Im Zentrum der Fovea centralis, der Foveola, mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern ist die Sehschärfe am größten. Zwischen dem ersten und dem zweiten Neuron liegen die Horizontalzellen, die mit ihren Enden quer zu den übrigen Zellschichten liegen, sowie die Amakrinzellen. Das zweite Neuron bilden die bipolaren Zellen. Ihre Fortsätze sind mit dem dritten Neuron verbunden, der Ganglienzellschicht. Die Neuriten der Ganglienzellschicht bündeln sich in der Papille, dem Sehnervenkopf ("blinden Fleck"), und verlaufen in Sehnerven weiter bis in die Sehrinde im Gehirn. Zum strukturellen und funktionellen Zusammenhalt der Zellschichten dienen die Gliazellen bzw. Müller-Stützzellen.

12 10 Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus Abbildung 2.1 :Schnitt durch die Netzhaut (1 innere Gliagrenzmembran, 2 Optikusnervenfaserschicht, 3 drittes Neuron, 4 innere plexiforme Schicht, 5 zweites Neuron, 6 äußere plexiforme Schicht, 7 erstes Neuron, 8 Innensegmente der Photorezeptoren, 9 retinales Pigmentepithel, 10 Bruchsche Membran, 11 Chorioidea); aus [24] 2.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine 10 µm dicke einzellige Schicht. Die Tight junctions zwischen den Zellen stellen die äußere Blut-Netzhaut-Schranke zwischen der Aderhaut und der neuronalen Netzhaut dar. Das RPE regelt den Transport von Nährstoffen aus dem Blut zur Retina und Stoffwechselabbauprodukte von der Retina zum Blut. Es sorgt außerdem für den Transport von Flüssigkeit und Elektrolyten zwischen den Blutgefäßen und der Retina. Ferner phagozytiert das RPE Abbauprodukte, neben Membranfragmente vor allem alte Membranscheiben die sich im Photorezeptoraußensegment befinden und abgeschilfert werden. Die lichtempfindlichen Außenglieder der Photorezeptoren bestehen aus dicht aufeinander gestapelten Lipoproteinmembranen. Die Photorezeptoren minimieren den Effekt der Zellalterung und der Lichteinstrahlung durch konstante Erneuerung ihrer Membranscheibchen [25]. Eine menschliche RPE-Zelle phagozytiert täglich % der vorhandenen Außensegmente der Photorezeptoren die an eine RPE-Zelle anschließen [26]. Es gibt drei verschiedene Pigmente die in der RPE-Zelle eingelagert sind. Die Melanosomen werden nur während der embryonalen Entwicklung gebildet und bleiben das ganze Leben erhalten. Das Lipofuszin entsteht durch unvollständige Phagozytose der Photorezeptoraußensegmenten. Die Melanolipofuszine sind eine Verschmelzung von Melanosomen und Lipofuszinen.

13 Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus Melanosomen des RPE Die Melanosomen dienen einerseits als Radikalfänger und vermindern so eine zellschädigende Lipidperoxidation [20]. Andererseits verhindern sie, dass das von den Photorezeptoren transmittierte Licht wieder diffus von der Chorioidea und der Sklera zurückgestreut wird. Die Melanosomen sind leicht elliptisch geformt und haben beim Menschen einen Durchmesser von ungefähr 1 µm. In einer einzelnen RPE-Zelle sind ca. 100 Melanosomen oberhalb des Zellkernes eingelagert (Abb. 2.2). Das einfallende Licht durchdringt alle Retinaschichten, bis es die Photorezeptoren erreicht. Dort werden nur 5 % des Lichtes absorbiert und zu Sehinformationen umgewandelt. Das transmittierte Licht wird beim Menschen zu % von den Melanosomen des RPE absorbiert [28,29] und in Wärme umgewandelt [30]. Abbildung 2.2 :Schnitt durch die RPE-Zelle: (PAußensegmente der Photorezeptoren, M Melanosom, ZK RPE-Zellkern, B Bruchsche Membran, C Chorioidea); aus [28] Lipofuszin und Melanolipofuszin des RPE Im RPE entspricht Lipofuszin hauptsächlich einem Endprodukt der Phagozytose, der von den Photorezeptoraußensegmenten abgegebenen Membranscheibchen und, in geringerem Maß, der Autophagie zelleigener Organellen. In den RPE-Zellen wird das von den Membranscheibchen stammende Material von einer Grenzmembran umgeben, es entsteht ein Phagosom. Die anschließende Verbindung von Lysosomen und Phagosomen führt zur Bildung von Phagolysosomen, die über die hydrolytischen Enzyme zum Abbau des aufgenommenen Zellmaterials verfügen [31]. Dieser Abbauprozeß der Membranscheibchen der Außensegmente führt zu verschiedenen Pro-

14 12 Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus dukten, die einerseits zur Weiterverwertung an die Photorezeptoren zurückgeführt werden. Andere nicht abbaubare Substanzen werden andererseits an der basalen Zellseite ausgeschieden und nach der Diffusion durch die Bruchsche Membran durch das Gefäßsystem der Aderhaut abtransportiert. Die verbleibenden Abbauprodukte wie Lipofuszin werden im RPE eingelagert. Dabei bildet das intrazelluläre Lipofuszin selbst Granula (Lipofuszingranula) mit Größen bis zu 1 µm, oder es lagert sich direkt um die Melanosomen (Melanolipofuszingranula) der RPE Zelle an (Abb. 2.3) [20]. Abbildung 2.3 :Lipofuszingranula (L) und Melanolipofuszin (Dreieck) im RPE einer 70- jährigen Frau; aus [20]. 2.3 Retinale Autofluoreszenz (AF) In der Retina des menschlichen Auges ist eine Vielzahl natürlicher Fluorophore vorhanden. Durch die optischen Transmissionseigenschaften des Auges ist die Anregung der Fluorophore auf den Spektralbereich zwischen 400 nm und 1200 nm beschränkt. Dadurch lassen sich nur noch zwei Klassen von Farbstoffen durch das Auge hindurch anregen. Es sind Flavine und Lipofuszin. Die Flavine kommen in den Mitochondrien der Zellen vor und sind somit Indikatoren für den zellulären Metabolismus [35]. Deren Fluoreszenz ist deutlich kleiner als die des Lipofuszins [35]. Deshalb sind im Folgenden nur die Fluoreszenzeigenschaften des Lipofuszins genauer dargestellt. Die Fluoreszenzeigenschaften von Lipofuszin wurden bereits in vitro [36] und in vivo [19] untersucht. Lipofuszin selbst besteht aus 10 einzelnen autofluoreszierenden Komponenten [33] dessen Hauptbestandteil A2E, ein Pyridium bis-retenoid, ist [34]. Die Fluoreszenzeigenschaften der 10 autofluoreszenten Einzelkomponenten sind breitbandig und reichten bei der Exzitation von nm und bei der Emission von nm [33]. Ähnlich breitbandige Spektren ergeben sich auch bei spektral aufgelösten Fluoreszenzuntersuchungen am gesunden Menschenauge [19]. Die Emission reicht, abhängig von der Exzitation, von 500 nm bis 780 nm (Abb. 2.1).

15 Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus 13 Abbildung 2.4 :Exzitationsspektrum und dazugehörige Emissionsspektren des Augenhintergrundes in vivo; aus [19]. In zeitaufgelösten Autofluoreszenzmessungen an extrahiertem humanen Lipofuszin zeigen sich in vitro vier wesentliche Abklingzeiten von ns [36]. Am gesunden Menschenauge kann eine resultierende Abklingzeit von 2 ns gemessen werden [35], wobei diese Messungen systembedingt nur auf ein Zeitbereich von ns beschränkt waren. Auch konnte aufgrund der geringen Photonenausbeute nur eine Abklingzeit bestimmt werden. Da Lipofuszin ein Produkt unvollständiger Phagozytose ist, erhöht sich dessen Konzentration im RPE mit dem Alter. Untersuchungen zeigen, dass die Lipofuszindichte nahezu linear mit dem Alter ansteigt (Abb. 2.5) [32]. Um das 40. Lebensjahr sind etwa 8-10 % des zytoplastischen Zellvolumens damit ausgefüllt, um das 80. Lebensjahr nimmt Lipofuszin ca. 20 % des Zellvolumens ein [25]. Interpoliert man diese Daten zurück auf die Fluoreszenzintensität bei Geburt, so ergibt sich selbst da eine Intensität von ca. 3% der maximal erreichbaren Fluoreszenz. Abbildung 2.5 :Retinale Autofluoreszenzintensität in Abhängigkeit des Alters; aus [32].

16 14 Kapitel 2: Anatomie und Autofluoreszenz des Fundus 2.4 Krankheitsbilder der Makula Bei mehreren Krankheitsbildern der Makula ist bekannt, dass pathologische Veränderungen des RPEs eine Rolle bei der Pathogenese spielen. Hierzu gehören unter anderen die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und die Retinopathia centralis serosa (RCS). Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache einer Erblindung in der westlichen Welt bei Patienten älter 50 Jahre [38]. Die Pathogenese der AMD ist komplex. Ein Faktor ist eine Überbelastung des RPEs im fortgeschrittenen Alter. Häufig entsteht zunächst durch unvollständige Phagozytose durch das RPE eine Ansammlung hyalinen Materials im Bereich der Bruchschen Membran[27]. Diese Materialansammlungen werden auch Drusen genannt. Diese sogenannte Drusenmakulopathie ist ein Vorstadium der AMD [27]. Von der aus können sich zwei Formen der AMD entwickeln [26]: 1. Die trockene AMD, die sich durch einen schleichend verlaufende RPE Atrophie mit langsamen Visusverlust gekennzeichnet ist, und 2. Die feuchte, neovaskuläre AMD: Durch Lücken in der Bruchschen Membran können chorioidale Gefäße unter das RPE und später auch in die Netzhaut einwachsen. Derartige Neovaskularisationen können innerhalb von Monaten zu einem Verlust des zentralen Sehvermögens führen. Die Retinopathia centralis serosa (RCS) ist eine Erkrankung, die vor allem junge Erwachsene zwischen 20. und 45. Lebensjahr betrifft und sich mit Metamorphopsien, Visusverschlechterung, Zentralskotom oder Mikropsie bemerkbar macht. Dabei treten eine oder mehrere fokale Leckagen im RPE auf. Durch die durchbrochene Blut-Retina Schranke des RPE kann somit mehr Flüssigkeit in den subretinalen Raum einströmen, als in Richtung Choriokapillaris herausgepumpt wird [40]. Es kommt zum Netzhautödem und damit verbunden zu den oben genannten funktionellen Veränderungen. Die diabethische Makulopathie (DMP) entsteht primär durch eine Pathogenese des retinalen Gefäßsystems. Es kommt zu einer Mikroangiopathie, die vor allem die präkapillaren Ateriolen, die Kapillaren und die Venolen betrifft. Die Verdickung der Basalmembran des Gefäßendothels führt zu einer frühzeitigen Gefäßsklerose mit Kapillarverschlüssen und Ischämie. Durch den Versuch einer Revaskularisation der minderversorgten Netzhaut kommt es zu Gefäßneubildungen. Die erhöhte Gefäßpermeabilität führt zu Netzhautödemen und exsudativer Parenchymzerstörung. Bei der diffusen diabetischen Makulopathie kommt es zu einer Leckage aus den delateralen retinalen Kapillaren am hinteren Augenpol. Die verringerte Wirkung schadhaften RPEs auf die subretinale Flüssigkeitsresorption scheint zusätzlich ein wesentliches Element bei der Entstehung des diffusen diabetischen Makulaödems zu sein [39]. Eine Anregung des Transportsystems des RPEs ist somit ein wesentlicher therapeutischer Faktor, da man die Mikroangiopathie bisher nicht beeinflussen kann.

17 Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus 15 3 Laserbestrahlung des Fundus 3.1 Wechselwirkung okularer Medien mit Laserlicht Die in den absorbierenden Strukturen des Fundus deponierte Energie wird je nach Leistungsdichte, Expositionszeit und Absorber in photochemische, mechanische oder thermische Energie umgewandelt. Zu verschiedenen physikalischen Wirkmechanismen der primären Schädigungsmechanismen bei minimaler Schädigungsleistungsdichte lassen sich unterschiedliche Bestrahlungszeiten zuordnen. Bei extrem langen Bestrahlungszeiten von Stunden bis zu mehreren Minuten, und vor allem im blauen Spektralbereich lassen sich photochemische Effekte an der Netzhaut erzeugen. In diesem Zeitbereich wird die im RPE durch Absorption entstandene Wärme sehr effektiv durch Wärmekonvektion aufgrund der starken retinalen Durchblutung abgebaut [42]. Es stellt sich ein thermischer Gleichgewichtsprozeß ein. Bei Reduzierung der Expositionszeit in den Sekundenbereich ist ein Abtransport der Wärme durch Konvektion nicht mehr gegeben. Die induzierte Wärme wird während der Bestrahlungszeit akkumuliert und nur durch Wärmediffusion lokal reduziert [42]. In diesem Zeitbereich entsteht zuerst ein rein thermischer Schaden, die Koagulation, dessen Zeit-Schadensabhängigkeit sich durch einen Arrheniusprozeß beschreiben läßt [13]. Bei Bestrahlung im Nanosekunden (ns) Zeitbereich wurde die Bildung von Mikrodampfblasen um die stark absorbierenden Melanosomen im RPE als primärer Fundusschaden nachgewiesen [8]. Aufgrund der kurzen Bestrahlungszeit kommt es durch einen thermischen Einschluß der absorbierten Energie innerhalb des Melanosoms zur effektiven Erwärmung und Bildung von Mikroblasen. Die Mikroblasen haben einen minimalen Durchmesser unterhalb eines Mikrometers, und sind somit noch klein gegenüber der RPE-Zelle und auch kleiner als Kavitationsblasen bei denen der akustische Einschluß maßgebend für deren Entstehung ist. Durch die Mikroblasenbildung kommt es zu einer Volumenvergrößerung innerhalb der RPE-Zelle, was wahrscheinlich zu einer Überdehnung und Schädigung der Zellmembran, und somit auch einer RPE-Zellschädigung führt. Der genaue Zellschädigungsmechanismus bei Mikroblasenbildung ist nicht eindeutig geklärt. Bei Pikosekunden (ps) ist neben dem thermischen auch ein akustischer Einschluß der absorbierten Energie innerhalb des Melanosoms gegeben. Hierbei kommt es zur Bildung von druckinduzierten Kavitationsblasen [8]. Bei kürzeren Bestrahlungszeiten in Femtosekunden (fs) Bereich kommt es in der Netzhaut zu einem optischen Durchbruch [43, 44, 45]. In diesem Fall spielt die Absorption des RPE eine untergeordnete Rolle [46]. Für den sichtbaren Spektralbereich ist in der Norm ANSIZ die maximal zulässige corneale Bestrahlung für alle Bestrahlungszeiten zusammengefaßt dargestellt [16]. Die zu den jeweiligen biophysikalischen Effekten bei Laserbestrahlung entstehenden histologischen Befunde sind nicht immer genau einem Schadensmechanismus zuzuordnen. In den ersten Stunden nach Exposition kommt es in Abhängigkeit der retinalen Gewebezerstörung zu einer biologischen Verstärkung des Gewebedefekts durch Bil-

18 16 Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus dung eines unspezifischen retinalen Ödems. Dadurch ist es nicht möglich, aus histologischen Befunden zu schließen, ob der primäre Schadensmechanismus rein thermisch ist, oder ob noch zusätzliche Faktoren wie mechanische oder photochemische Mechanismen beteiligt sind. Ein histologischer Nachweis des primären Schadensmechanismuses ist aber auch wegen des transienten Charakters der Primäreffekte, wie z.b. ein Aufschwingen von Mikroblasen im ns-zeitbereich, nicht möglich. In Abhängigkeit von der eingestrahlten Lichtwellenlänge kommt es durch unterschiedliche spektrale Absorption der einzelnen Fundusschichten zu verschiedenen Energieverteilungen. Die maßgebenden Chromophore des Fundus sind Wasser, Hämoglobin und Oxyhämoglobin in den Gefäßen, Melanin im RPE und tieferliegenden Schichten der Chorioidea und Xanthophyll, was nur im Bereich der Fovea in der neuralen Netzhaut eingelagert ist (Abb. 3.1). Abbildung 3.1 :Absorptionskoeffizienten verschiedener im Fundus vorkommenden Chromophore in Abhängigkeit der Wellenlänge; aus [30] 3.2 Die Photokoagulation Die Photokoagulation stellt heute bei zahlreichen Netzhauterkrankungen ein Behandlungsverfahren dar, das aus der täglichen ophthalmologischen Praxis nicht mehr wegzudenken ist. Die Ursprünge gehen auf Meyer-Schwickerath zurück [47]. Dabei wurde in den ersten Arbeiten Sonnenlicht als Energiequelle verwendet. Diese Energiequelle stellte aber wegen der komplizierten Handhabung als ungeeignet heraus. Deswegen wurden zunächst Hochintensitätskohlebogen, Anfang der 50er Jahre dann Xenonhochdrucklampen verwendet, die eine hinreichend hohe Leistungsdichte am Fundus zur Erzeugung einer Koagulation erreichten. Zahlreiche Arbeiten wurden veröffentlicht, die die therapeutische Anwendbarkeit und Wirkung zeigten [48]. Mit der Erfindung des Lasers durch

19 Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus 17 Mainman stand eine neue, vielversprechende Lichtquelle zur Verfügung, die durch die geringe Strahldivergenz sehr einfach durch Fokussierung eine hohe Leistungsdichte erreichte, die zur Koagulation verwendet werden konnte [49]. Histologische Untersuchungen zeigten, dass die Effekte des Laserlichts an der Netzhaut durch die Absorption an unterschiedlichen Strukturen erklärt werden können. Mit der Einführung des Argonlasers stand Anfang der 70er Jahre ein Laser zur Verfügung, der aufgrund seiner wählbaren Wellenlänge (514 nm, 488 nm) und bis zu einigen Watt cw-leistung (cw = continous wave) einen breiten klinischen Einsatz ermöglichte. Die Durchführung der Diabetic Retinopathy Study, einer groß angelegten prospektiven, randomisierten und multizentrischen klinischen Studie zeigte klar, dass die Behandlung der diabetischen Retinopathie durch Laserkoagulation deutliche Vorteile bringt und so das Risiko eines massiven Visusverlustes halbiert werden kann [50]. Mit der Weiterentwicklung der Lasertechnik kamen neue Lasertypen hinzu, die sich generell nur in ihrer emittierten Wellenlänge unterschieden. Wegen der unterschiedlichen Wellenlänge der Lasertypen sind aufgrund der unterschiedlichen Absorptionsverhältnisse theoretisch zunächst geringe Unterschiede bezüglich des histologischen Effektes zu erwarten. Bei längeren Wellenlängen nimmt die Absorption von Blut zu, gleichzeitig sinkt die Absorption des RPE (Abb. 3.1). Bei 800 nm kommt es zu einer effektiven Erwärmung chorioidealer Gefäße, was zu einer ungewollten Schädigung dieser Strukturen führt [30]. Deshalb wird heutzutage hauptsächlich der grüne Spektralbereich mit maximaler Absorption im RPE für die Laserphotokoagulation verwendet. Bei der Photokoagulation wird die Laserleistung oder die Expositionszeit so variiert, dass eine ophthalmoskopisch sichtbare, weiß-gräuliche Läsion entsteht. Der Durchmesser des Bestrahlungsareals wird dabei je nach Anwendung zwischen µm eingestellt. Die Expositionszeiten sind länger als 50 ms, typischerweise ms. Histologisch zeigt sich nach einer Laserkoagulation ein irreversibler Gewebeschaden, wobei bei milden ophthalmoskopisch sichtbaren Läsionen die Choriokapillaris, das RPE und die Photorezeptoren einschließlich der äußeren Körnerschicht zerstört werden [51]. Bei stärkeren Läsionen, wie sie klinisch üblicherweise verwendet werden, zeigen sich zusätzliche Schäden in den inneren Netzhautanteilen. Unabhängig von der verwendeten Wellenlänge ergibt sich bei allen histologischen Untersuchungen, dass bei der Photokoagulation die Schädigung des RPEs auch immer mit einer Destruktion der Photorezeptoren einhergeht. Die damit verbundenen Gesichtsfelddefekte sind nicht erwünscht, lassen sich aber bei Bestrahlung im Millisekunden (ms) Bereich nicht verhindern. Die cw-photokoagulation geht immer einher mit massiven Nebeneffekten wie lokale Skotome durch die Zerstörung der Photorezeptoren. 3.3 Die selektive RPE Therapie (SRT) Bei der Drusenmakulopathie und der RCS wird, wie in Kap. 2.4 näher dargelegt, davon ausgegangen, dass ihnen eine pathologischen Veränderung des RPE zugrunde liegt. Eine selektive Schädigung der RPE-Zellen und der damit verbundene Proliferation neuer RPE-

20 18 Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus Zellen erscheint hinreichend für die Induzierung einer Heilreaktion sowohl bei der DMP, RCS und Drusenmakulopathie zu sein [3, 1]. Gleichzeitig kann der massive Nebeneffekt der lokalen Skotome vermieden werden [3]. Vor diesem Hintergrund wurde von Roider und Birngruber die selektive RPE Behandlung mit repetierenden µs-laserpulsen entwikkelt. Die grundlegende Idee der SRT basiert auf der Annahme eines rein thermischen Schädigungsmodells, bei dem eine Reduzierung der RPE-Schadensschwelle durch die Additivität der gesetzten Schäden mittels multipler Pulse gegeben ist. Die Laserpulsdauer wurde so gewählt, dass man eine selektive Erwärmung des RPEs erreicht, wobei die direkt angrenzenden Photorezeptorschichten nur gering erwärmt werden. Eine mechanische Disruption wie sie mit ns-laserpulsen beschrieben war galt es zu vermeiden [5]. Mit einem thermischen Modell des RPE, welches die Granularität der absorbierenden Melaningranula berücksichtigt lies sich eine selektive Erwärmung mittels µs-laserpulsen nachweisen [2]. In Abb. 3.2 ist die axiale Temperatur-Ortsverteilung im RPE und der angrenzenden Netzhaut zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applikation eines 1 µs Laserpulses (5.5 µj, gausscher Spot mit 1/e² = 110 µm, 63 % Absorption, 95 % optische Transimission des Auges) dargestellt. Es kommt zu einer selektiven Erwärmung des RPEs während des Laserpulses mit Temperaturspitzen bis zu 80 C, wobei gleichzeitig schon 2 µm entfernt, in der Netzhaut, nur 2-3 C Erwärmung erreicht werden. Abbildung 3.2 :Axiale Temperatur-Ortsverteilung im RPE und der angrenzenden Netzhaut zu verschiedenen Zeitpunkten nach Applizierung eines 1 µs Laserpulses; aus [2]. In tierexperimentellen Untersuchungen an Kaninchen wurde histologisch gezeigt, dass mit repetitierenden µs-laserpulsen das RPE selektiv geschädigt werden kann und gleichzeitig die Photorezeptoren geschont werden [1, 2]. Es ergab sich auch eine Additivität der Lasereffekte, was als Hinweis auf einen thermischen RPE-Schadensmechanismus gewertet wurde [2]. Die angiographischen ED 50 Schadensschwellen bei 500 Hz Pulswiederhol-

21 Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus 19 rate und 5 µs Laserpulse lagen für 1 / 25 / 500 Pulse bei bei 57 / 27 / 16 mj/cm² und die opthalmoskopischen ED 50 Schwellen (> 100mJ/cm²) konnten aufgrund der begrenzten Laserleistung nicht bestimmt werden. Die angiographische ED 50 Schadensschwelle bei ebenfalls 500 Hz Pulswiederholrate und 200 ns Pulslänge wurde bei 10 und 500 Pulsen auf 43 mj/cm² und 26 mj/cm², die ophthalmoskopische ED 50 Schadensschwellen mit 110 mj/cm² und 105 mj/cm² bestimmt. Wichtig ist zu beachten, dass die gemessenen Schwellen die mittlere Bestrahlung im Spot wieder geben, und nicht auf die maximale Bestrahlung durch Spekelbildung bei der fasergeführte Applikation normiert wurden. Bei dem ersten klinischen Einsatz an Patienten konnte mit Hilfe der Mikroperimetrie gezeigt werden, dass die Photorezeptoren im Laserareal intakt und funktionsfähig sind [3]. In einer klinischen Pilotstudie wurden in den Augenkliniken Lübeck und Regensburg bereits über 160 Patienten mit DMP, RCS und die Drusenmakulopathie behandelt. Abschließende Ergebnisse konnten bisher von 70 Patienten dokumentiert werden, die alle eine Nachbeobachtungszeit von mehr als einem halben Jahr, in Einzelfällen bis zu zwei Jahren besaßen. Die angiographische ED 50 Schadensschelle bei den Patientenbehandlungen mit 1.7 µs Nd:YLF (527 nm) Laserpulsen bei 500 Hz Pulswiederholrate und 100 applizierten Pulsen lag bei 450 mj/cm². Die ophthalmoskopische ED 50 Schwelle wurde nicht erreicht und lag somit oberhalb der maximal applizierten Bestrahlung von 650 mj/cm². Die angiographische ED 50 Schadensschwelle lag beim Menschen somit um den Faktor 10 höher wie in den Kaninchenversuchen. Der Grund für diese Differenz ist unklar, da die Absorptionseigenschaften des menschlichen und Kaninchen-RPEs sich nur um 10 % bei den verwendeten Wellenlängen unterscheidet [28]. Die primären Zielkriterien beim diabetischem Makulaödem waren die Veränderung von harten Exsudaten und Veränderungen des Flüssigkeitsaustrittes in die Netzhaut. Das Zielkriterium bei AMD war eine Änderung der Zahl der Drusen und bei RCS eine Reduktion des Flüssigkeitsaustritts aus dem retinalen Pigmentepithel. Klinisch zeigte sich bei ca. einem Drittel der Patienten (38 %) mit Drusenmakulopathie ein Rückgang der Drusen, was deutlich geringer ist als nach konventioneller Bestrahlung. Die Ursache mag in der geringen Anzahl der applizierten Laserläsionen liegen. Weiterhin ist auch nicht klar, ob ein Rückgang der Drusen mit einem verringerten Risiko der Ausbildung von chorioidealen Neovaskularisationsmembranen - also den Übergang in eine feuchte Form der AMD mit schwerwiegenden schnellen Visusverlust - einhergeht. Dies kann aber nur durch eine langfristig angelegte Placebo kontrollierte Studie geklärt werden. Bei der diabetischen Makulopathie konnten Verbesserungsraten von über 57 % erzielt werden, die derjenigen mit konventioneller Bestrahlung nahezu gleich kommt. Bei Patienten mit RCS konnte meistens ein therapeutischer Effekt erzielt werden. Die punktuelle Leckage war in der Regel nach spätestens 2 Wochen geschlossen und der Visus stieg schnell wieder auf 1.0. Dieses ist insbesondere deshalb wichtig, da es sich bei diesem Krankheitsbild meistens um junge männliche Erwachsene handelt, die im Arbeitsleben stehen und auf gutes beidäugiges Sehen angewiesen sind, und daher in besonderem Maße vom Ausbleiben der Laserskotome profitieren.

22 20 Kapitel 3: Laserbestrahlung des Fundus Insgesamt konnten für die SRT therapeutische Effekte bei der Behandlung von makulären Erkrankungen bei gleichzeitiger Schonung der Photorezeptoren und Vermeidung von Laserskotomen gezeigt werden.

23 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung 21 4 Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung Bei ophthalmologischer cw-laserphotokoagulation der Retina wird eine Dosimetrie bei jedem Patienten individuell durchgeführt. Es wird schrittweise die Leistung erhöht bis sich eine weißlich-graue Färbung der Netzhaut durch eine thermische Denaturierung ergibt (Abb. 4.1). Mit dieser Leistung wird dann die zu behandelnde Stelle bestrahlt. Es wird eine Dosimetrie gemacht, bei der das Kriterium eine ophthalmologische Sichtbarkeit der Läsionen ist. Dadurch werden interindividuelle Unterschiede wie optische Transmission der Augenmedien und vor allem Absorption im RPE berücksichtigt. Der behandelnde Arzt hat zusätzlich noch einen guten Überblick über die bereits behandelten Areale, da sie sichtbar sind. Abbildung 4.1 :Sichtbare, durch thermische Denaturierung der Netzhaut entstandene Läsionen einer panretinalen cw-photokoagulation, aus [26]. Bei der selektiven RPE Behandlung ist aufgrund der auf das RPE begrenzten Schäden ein erfolgreich gesetzter RPE-Schaden ophthalmoskopisch nicht sichtbar (Abb. 4.2 A). Daraus ergibt sich direkt das Problem einer individuellen Dosimetrie für den behandelnden Arzt. Um den Erfolg der Behandlung verifizieren zu können, muß derzeit postoperativ immer eine Fluoreszenz-Angiographie durchgeführt werden. Ein Schaden auf RPE- Ebene führt zu einem Durchtritt von Fluoreszein aus der Choriokapillaris in den subretinalen Raum und damit zu einer Leckage im bestrahlten Areal, wodurch der Schaden angiographisch sichtbar wird (Abb. 4.2 B). Bei Patienten mit diabetischer Makulopathie, die erfahrungsgemäß mit zahlreichen krankheitsbedingten Leckage-Arealen, Makulaödem und verdickter Netzhaut einhergeht, ist ein Nachweis der Laserherde mit der Fluoreszenzangiographie nicht möglich. Hier wird die, durch die Laserkoagulation induzierte Leckage, von der pathologische Leckage überdeckt. In diesen Fällen muß auf die Indiocyanidgreen-Angiographie (ICG) zurückgegriffen werden, die im Gegensatz zur konventionellen Angiographie mit Fluoreszein, die Laserläsionen eindeutig nachweisen läßt, da ICG nicht an den pathologisch erkrankten Stellen durchtreten kann (Abb. 4.2 C).

24 22 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung Abbildung 4.2 :Fundusbild (A), FLA- (B) und ICG-Angiogramm (C) nach einer selektiven RPE Behandlung. Im Fundusbild sind die am RPE gesetzten Schäden nicht sichtbar. Erst in der FLA und im ICG zeigen sich die Läsionen durch poolen des jeweiligen Kontrastmittels durch die in dem bestrahlten Spot geschädigte Blut-Retina Schranke. Der Nachteil der Angiographie allgemein besteht in ihrem invasivem Charakter. Mit der angiographischen Nachweismethode ist die selektive RPE Behandlung auf den Einsatz in einem klinischen Umfeld beschränkt, da in einer normalen augenärztlichen Praxis ein Angiograph nicht zur Verfügung steht. Eine On-line Dosimetrie, die direkt während der Bestrahlung eine Dosimetrie zuläßt, ist für den Praxiseinsatz sehr wünschenswert. Dabei ist eine nichtinvasive Methode von großem Vorteil, da sie die oben beschriebenen Nebenwirkungen der Angiographie vermeidet, und somit eine breite Akzeptanz des neuen Therapieverfahrens unterstützt. Zu Beginn dieser Arbeit war der RPE-Schadensmechanismus bei der SRT noch nicht eindeutig geklärt. Bei der Fundusbestrahlung mit µs-laserpulsen liegt man zwischen den schon vielfach untersuchten Mechanismen einer rein thermischen RPE Schädigung bei langer Bestrahlungszeit im ms-bereich [13] und einer thermomechanischer Schädigung durch Mikroblasenbildung im ns-zeitbereich [8]. Deshalb wurde für beide retinalen Schädigungsmechanismen ein dazu passender On-line Dosimetrieansatz verfolgt und sowohl in in vitro Experimenten als auch bei Patientenbehandlungen angewandt. Die jeweiligen Ansätze sind zusammengefaßt in Abb. 4.3 prizipiell dargestellt, und im Folgenden nach den Schadensmechanismen getrennt beschrieben. Ist eine Detektion des Schadensmechanismus möglich, ergibt sich daraus auch die Möglichkeit einer On-line Dosimetrie.

25 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung 23 Laserpuls RPE-Zellschädigung thermische Denaturierung Mikroblase Autofluoreszenz: spektrale oder Intensitätänderung Schallsignal: thermoelastische Transiente Reflexsignal: konstante diffuse Rückstreuung Schallsignal: thermoelastische Transiente Abbildung 4.3 :Prinzipskizze der in dieser Arbeit verwendeten Methoden zur On-line Dosimetrie und zum Nachweis des RPE-Schadensmechanismus bei Laserbestrahlung. + Mikroblasentransiente Reflexsignal: konstante diffuse Rückstreuung + transiente Rückstreuung durch Mikroblasen 4.1 Thermische RPE Schädigung Für thermische Schäden ist die Temperatur im Gewebe von entscheidender Bedeutung. Für thermisch induzierte Netzhautschäden war deshalb zuerst die Hypothese einer kritischen Temperatur vorgeschlagen worden [52]. Es zeigte sich schon sehr schnell, dass gerade für kurze Bestrahlungszeiten diese Hypothese nicht zu halten war [21]. Vassiliadis griff dann als erster die von Arrhenius quantitativ beschriebene thermisch induzierte Reaktionskinetik für die Anwendung bei Netzhautschäden auf [21]. Dieser Ansatz wurde durch ein Wärmeleitungs- und thermisches Schädigungsmodell erweitert, womit Schadenschwellen im Zeitbereich 1 ms bis 300 ms erklärt werden konnten [13]. Bei thermisch induzierten Schäden ergibt sich eine Additivität multipler einzelner Schäden. Erste Tierversuche an Kaninchen mit repetierenden µs-laserpulsen stützten die Hypothese der thermischen Denaturierung, da sich auch hier ein additiver Effekt multipler Pulse zeigte [1]. So verringerte sich die ED 50 Schwellenenergie um den Faktor 3.6 von 5.5 µj bei Einzelpulsen zu 1.5 µj bei 500 applizierten Pulsen (514 nm, 5 µs Puls, 500 Hz, 116 µm Spot) [1]. Eine auf der thermischen Denaturierung beruhende nichtinvasive On-line Dosimetriemöglichkeit basiert auf der retinalen Autofluoreszenz Autofluoreszenz basierter Nachweis von RPE-Schädigung Eine nichtinvasive Methode zur Verifikation des Behandlungserfolges bei einer thermischen Denaturierung könnte die Erfassung der Fundus-Autofluoreszenz darstellen. Die retinale Autofluoreszenz geht von dem im RPE enthaltenen Lipofuszin aus. Die genaue Lokalisation und Zusammensetzung wurden bereits in Kapitel 2.3 detailliert dargestellt. Natürliche Fluorophore sind meistens thermisch instabil und ändern ihre Fluoreszenzeigenschaften bei Erwärmung. Da Lipofuszin direkt im RPE liegt ist, kann auch räumlich

26 24 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung gut aufgelöst untersucht werden, ob sich aus einer thermischer Denaturierung und der damit verbundenen Änderung der retinalen Autofluoreszenz auf eine Schadensschwelle des RPE schließen läßt. Abbildung 4.4 :Verdeutlichung der Temperaturverteilung um die lichtabsorbierenden Melanosomen bei Laserbestrahlung im RPE. Die Lipofuszin- und Melanolipofuszingranula werden hohen Temperaturen ausgesetzt und möglicherweise auch das Lipofuszin thermisch denaturiert. (ursprüngliches Bild Abb. 2.3). Dabei kommen zwei technische Möglichkeiten in Frage. Einerseits wird versucht die Änderung der Autofluoreszenz direkt während der Bestrahlung nachzuweisen und somit ein wirkliches On-line System zu entwickeln, andererseits wurde in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. H. Roider und Dr. C. Framme von der Augenklinik Regensburg die Möglichkeit untersucht, den selektiven RPE-Schaden über retinale Autofluoreszenzbilder mit einem Laser-Scanning Retina-Angiographen nach erfolgter SRT-Behandlung nachzuweisen. In diesem Fall wird die Änderung der Autofluoreszenz erst nach der Behandlung ebenfalls nichtinvasiv nachgewiesen. Jedoch limitiert der Einsatz eines Laser Scanning Retina-Angiographen zum Nachweis des RPE-Schadens die selektive RPE Behandlung wiederum auf ein universitäres Umfeld mit den entsprechenden technischen Geräten. 4.2 Thermomechanische RPE Schädigung Bei der selektiven Schädigung von RPE-Zellen, oder auch weiter gefaßt, stark pigmentierter Zellen, ist bei einer Bestrahlungszeit im ns-bereich eine thermomechanische Schädigung durch die Bildung nur einiger µm großer Mikroblasen bereits in mehreren Arbeiten dargestellt. Bei der Anwendung am RPE wurde in der Arbeit von Kelly die Bestrahlung von ns bis ps-laserpulsen untersucht [8]. Als primärer Schadensmechanismus wird darin die um die Melanosomen gebildeten Mikroblasen nachgewiesen. Wie in Abb. 4.5 dargestellt, zeigte sich Mikroblasenbildung an Einzelmelanosomen bei 55 mj/ cm² für 20 ns und 30 ps (523 nm) [8]. RPE-Schaden trat bei ebenfalls 55 mj/cm² für 20 ns und 50 mj/cm² für 30 ps auf [8]. Ob eine Zerreißung der RPE-Zellmembran, oder andere

27 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung 25 Effekte wie eine Schädigung der Zellorganellen zum Zellschaden führt, konnte nicht geklärt werden. Die Bildung von Schockwellen konnte nur bei ps-laserpulsen und einer vierfachen Bestrahlung der Mikroblasenbildungsschwelle nachgewiesen werden. Die Arbeiten wurden mit Hilfe von fast-flash Photographie und transmittierter Lichtstreuung durchgeführt. Bereits Roider wies auf die mögliche Bildung von Mikroblasen bei der selektiven Bestrahlung von Kaninchen mit 200 ns Nd:YAG-Laserpulsen hin [6]. Dabei wurde nur die ophthalmoskopisch sichtbare Blasenbildung ab 250 mj/cm² (532 nm, 200 ns, 500 Pulse 500 Hz) beschrieben, was schon zweifach über der Schwelle von 120 mj/cm² für ophthalmoskopische Sichtbarkeit und beinahe ein zehnfaches über der angiographischen Schwelle von 30 mj/cm² für diesen Parameter lag [7]. Diese Makroblasen mit minimalen Durchmesser von 20 µm waren intraretinal lokalisiert und nicht transient, bleiben also über einen längeren Zeitraum erhalten. Abbildung 4.5 :Mikroblasenbildung um Melaningranula bei Bestrahlung mit 20 ns Laserpulsen; A: Aufnahme vor Bestrahlung / B: 125ns nach Laserpuls mit 55mJ/cm² / C: 125ns nach Laserpuls mit 77 mj/cm² / D: 125ns nach Laserpuls mit 121 mj/cm² ; Strich 10 µm, aus [8]. Im µs-zeitbereich wurde in der Arbeit von Rögener gezeigt, dass die RPE-Schadensschwelle von 140 mj/cm² für Schweine-RPE für einzelne 1 µs Laserpulse unterhalb der Schwelle von 285 mj/cm² für Mikroblasenbildung um einzelne isolierte Melanosomen ist [11,12]. Dieser Unterschied konnte aber durch die Wärmeleitung der nahe aneinander liegenden Melanosomen im RPE während des Laserpulses erklärt werden. In der selben Versuchsreihe mit ns-laserpulsen, bei denen ein thermischer Einschluß der Melanosomen vorliegt, ergaben sich gleiche Schwellen von 95 mj/cm² für Zellschaden wie für Blasenbildung an isolierten einzelnen Melanosomen. Ein direkter Beweis für einen thermomechanischen Zellschaden durch Mikroblasen bei Bestrahlung von µs-laserpulsen wurde der Arbeit von Rögener [11] nicht erbracht. Der Begriff der Kavitation wird klassisch zur Beschreibung kurzlebiger, durch Unterdruck erzeugter Gasblasen verwendet [53]. Durch die Bestrahlungszeiten im µs-bereich und dem dadurch fehlenden akustischen Einschluß ist es nur möglich, Drücke im mbar- Bereich zu erzeugen [12]. Eine Blasenentstehung durch Kavitation ist somit ausgeschlossen. Deshalb wurde für die durch Verdampfung an der Melanosomenoberfläche entstehenden Blasen der Begriff der Mikroblasen eingeführt, auch um sich von den mit Kavitationsblasen assoziierten Effekten abzugrenzen [8].

28 26 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung Im Folgenden werden nun zwei in dieser Arbeit eingesetzten Techniken zum nichtinvasiven Nachweis einer mechanischen RPE-Schädigung vorgestellt. Den Schwerpunkt bildete der optoakustische Nachweis der Mikroblasen. Der optisch basierte Reflexnachweis wurde nur als zweite, von der Optoakustik physikalisch unabhängige Nachweismethode bei in vitro Messungen und am Tiermodell eingesetzt Optoakustischer Nachweis von RPE-Schädigung Verdampft an der Oberfläche eines Melanosoms durch die Laserbestrahlung das umschließende Wasser, so wird eine Mikroblase anwachsen, solange der Druck im Innern der Blase größer ist als der Umgebungsdruck. Die umgebende Flüßigkeit wird radial beschleunigt, und es entsteht eine akustische Transiente. Dies ist analog zur Emission akustischer Transienten bei der Entstehung von Kavitationsblasen [17]. Wenn keine Druckdifferenz mehr vorliegt, schwingt die Blase aufgrund der Massenträgheit der beschleunigten Flüßigkeit noch über. Sobald der Umgebungsdruck größer als der Blaseninnendruck ist, wird das Aufschwingen verlangsamt und die Blase beginnt schließlich zu kollabieren. Die beim Kollaps frei werdende kinetische Energie wird mit bis zu 70 % in eine akustische Transiente umgesetzt [54]. Es sollte somit auch prinzipiell möglich sein, die Entstehung von Mikroblasen mit optoakustischen Techniken zu verifizieren. Bei gepulster Bestrahlung von absorbierendem Gewebe wird immer eine thermoelastische Transiente gebildet. Kommt es zusätzlich zur Mikroblasenbildung, so überlagert sich die thermoelastische Transiente mit der optoakustischen Transiente der Mikroblase (Abb. 4.3). Eine Veränderung der Transiente sollte meßbar sein. Wie in der Prinzipskizze Abb. 4.6 dargestellt, ist bei der Entstehung der optoakustischen Schallwellen davon auszugehen, dass die von den Mikroblasen emittierten Schallwellen jedes einzelnen Melanosoms nur als Superposition aller Schallwellen am Wandler gemessen werden. Einerseits werden in den Experimenten bei den verwendeten Spotgrößen bis zu 100 RPE-Zellen, also ca Melanosomen gleichzeitig bestrahlt, andererseits ist der Schallwandlerabstand als auch die Wandlerausdehnung experimentell bedingt immer zwei bis drei Größenordnungen größer ist als der Abstand der einzelnen Melanosomen.

29 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung 27 Schallwelle Mikroblase rein thermoelstische Transiente thermoelstische und Blasentransiente RPE Zellwand Melanosomen Abbildung 4.6 :Prinzipskizze der Schallentstehung bei Laserbestrahlung von Melanosomen im RPE. Mit einem Schallwandler kann nur die Superposition aller Schallwellen gemessen werden, da seine Detektionsfläche um das 1000-fache größer ist als der Durchmesser des einzelnen Melanosoms Reflexbasierter Nachweis von RPE-Schädigung Der Nachweis von Mikroblasen um Melaningranula während der Bestrahlung mit einem Laser ist auch optisch möglich. So wurde von Kelly einerseits an einzelnen isolierten Melanosomen Mikroblasen durch die Ablenkung eines Probelasers in Transmission detektiert [8]. Damit konnte der zeitliche Verlauf der Mikroblasen gemessen werden. Andererseits wurden Mikroblasen auch direkt bei Bestrahlung von Kälber-RPE-Zellen mit Fast-Flash Fotografie nachgewiesen [8]. Damit konnte nur die Blasenverteilung und -größe zum Zeitpunkt der Belichtung aufgenommen werden. Eine Aussage über die zeitliche Dynamik der Blasen war nicht möglich. Es ist auch möglich die Entstehung der Mikroblasen in Reflexion nachzuweisen [22, 23]. Dabei wird zusätzlich zu dem Bestrahlungslaser ein Probelaser eingekoppelt der vor dem Bestrahlungspuls eingeschaltet, und mehrere µs nach dem Puls wieder ausgeschaltet wird. Somit ist es möglich eine Änderung der Reflektivität der RPE-Probe durch die Entstehung einer Grenzfläche der Mikroblasen um die Melaningranula nachzuweisen (Abb. 4.3). Mit einem Aufbau für den reflexbasierten Nachweis von Mikroblasen, bei dem die hohe numerische Apertur von 0.42 verwendet wurde, konnte in Schweine-RPE Proben für 12 ns Laserpulse (1 Puls, 532 nm) die gleiche Blasenbildungs- und RPE-Schadensschwelle von 71 µj/cm² gemessen werden [22]. Für längere 6 µs Einzelpulse lag die Blasenbildungsschwelle mit 456 mj/cm² 10 % über der Schadensschwelle von 412 mj/cm². In den Experimenten gilt es, zwischen der konstanten diffusen Rückstreuung durch das RPE und einer Rückstreuung mit transientenhalften Blasenrückstreuung zu unterscheiden (Abb. 4.3). Ein Überblick über die angiographischen, ophthalmoskopischen Schwellen im Tierversuch und über Blasenbildungsschwellen, sowie mit Vitalitätsmarkern nachgewiesen RPE- Schaden bei Laserbestrahlung ist in Tab. 1 gegeben.

30 28 Kapitel 4: Mechanismen und Detektion selektiver RPE-Schädigung Zitat [2] [2] [2] [2] [2] [2] [2] [2] [2] [2] [3] [3] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [11] [8] [8] [8] [8] [8] [8] Probe Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Kaninchen in vivo Mensch Mensch Schweine-RPE in virto Schweine-RPE in virto Schweine-RPE in virto Schweine-RPE in virto Schweine-RPE in virto Schweine-RPE in virto Schweine-RPE in virto Schweinemelanosomen Schweinemelanosomen Schweinemelanosomen Schweinemelanosomen humane Melanosomen humane Melanosomen humane Melanosomen humane Melanosomen Rindermelanosomen Rindermelanosomen Graphit Graphit Schweien-RPE Schweine-RPE Wellenlänge [nm] Pulslänge [s] 5µ 5µ 5µ 5µ 200n 200n 50m 100m 500m 1 1.7µ 1.7µ 8n 200n 1µ 3µ 200n 1µ 3µ 8n 200n 1µ 3µ 8n 8n 200n 1µ 20n 30p 20n 30p 20n 30p Pulszahl Pulswiederholrate [Hz] ED 50 ang ED 50 opht 16mJ/cm² 21mJ/cm² 27mJ/cm² 59mJ/cm² 26mJ/cm² 42mJ/cm² 253W/cm² 165W/cm² 126W/cm² 116W/cm² 298mJ/cm² 348mJ/cm² 105mJ/cm² 110mJ/cm² 421W/cm² 358W/cm² 284W/cm² 210W/cm² ED 50 bubble 83mJ/cm² 175mJ/cm² 260mJ/cm² 520mJ/cm² 210mJ/cm² 210mJ/cm² 360mJ/cm² 520mJ/cm² 55mJ/cm² 55mJ/cm² 25mJ/cm² 26mJ/cm² ED 50 calcein 84mJ/cm² 131mJ/cm² 140mJ/cm² 223mJ/cm² 83mJ/cm² 99mJ/cm² 114mJ/cm² 55mJ/cm² 50mJ/cm² spot]µm] Tabelle 1: Überblick über die angiographischen, ophthalmoskopischen Schwellen im Tierversuch und über Blasenbildungsschwellen, sowie mit Vitalitätsmarkern nachgewiesen RPE-Schaden bei Laserbestrahlung.

31 Kapitel 5: Material und Methoden 29 5 Material und Methoden 5.1 Laser Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier verschiedene Laser verwendet. Dieser Abschnitt soll eine zusammenfassende Charakterisierung der Systeme geben. In der jeweiligen Verwendung bei verschiedenen Aufbauten werden sie nur noch als geschlossenes System dargestellt. Die Bestimmung der maximalen Bestrahlung ist bei den Experimenten von großer Bedeutung. So wurde auch für die verschiedenen Lasertypen die Speklebildung nach einer fasergeführten Abbildung gemessen. Mit Hilfe dieser Werte können die gemessenen mittleren Bestrahlungen in die maximale Bestrahlung umgerechnet werden Frequenzverdoppelter Nd:YLF-Laser Ein bogenlampengepumpter, intrakavitär frequenzverdoppelter Nd:YLF-Laser (Quantronix Inc., model 527DP-H) wurde mit einer aktiven Pulsverlängerung erweitert (Abb. 5.1) [58]. Dies erlaubt eine Variation der Pulslänge von 200 ns bis zu 5 µs (Abb. 5.2). Um den im normalen Q-switch Mode emittierten 250 ns Laserpuls zu verlängern, wird während der Pulsemission die Güte des Laserresonators verändert. Dies erreicht man durch eine dynamische Änderung der Pockels-Zellenspannung [59]. Wenn die Verluste des Resonators gleich der Verstärkung des Laserstrahls durch das Lasermedium sind, so wird ein Puls konstanter Leistung emittiert, solange eine Inversion des Lasermediums gegeben ist. Die am Medizinischen Laserzentrum entwickelte elektronische Rückkopplung der Pockelszelle wird einerseits mit einer einstellbaren Hochspannungsrampe und einer dynamischen Steuerung über eine schnelle Photodiode mit nachfolgender schneller Verstärkung in den Hochspannungsbereich betrieben. Die Photodiode erlaubt es während der Emission des Laserpulses einzelne Pulsfluktuationen, die gerade am Ende des Laserpulses auftreten auszugleichen. Durch die aktive Rückkopplung sind die Schwankungen der Pulsenergie bei aktiver Verlängerung gering. Sie schwankt um 8 % vom Minimum zu Maximum (Peak to Peak).

32 30 Kapitel 5: Material und Methoden Abbildung 5.1 :Skizze des Nd:YLF Lasers und der Behandlungssteuerung. A B C Abbildung 5.2 :Typische Pulsformen des Nd:YLF Lasers und der entsprechenden Pulsenergie bei 500 Hz Wiederholrate und 25A Lampenstrom; A: 250 ns, B: 1.7 µs, C: 4.5 µs. Die Frequenzverdopplung wird mit einem LBO-Kristall umgesetzt. Dabei wird die Phasenanpassung zur Frequenzverdoppelung über die LBO-Kristalltemperatur eingestellt. Da durch die Variation der Temperatur eine Änderung der Verdopplungseffizienz gegeben ist, kann darüber die unverlängerte Pulsdauer im Bereich 200 ns bis 1 µs (bei 20A Lampenstrom) eingestellt werden. Eine typische Messung ist in Abb. 5.3 dargestellt. Die Pulslänge reduziert sich wenn man den Laser bei höheren Strömen betreibt (Abb. 5.4).

33 Kapitel 5: Material und Methoden 31 Pulsdauer [ns] 1000 Nd:YLF mit 20 mm LBO 20A, 100Hz Pulsenergie [µj] Temperatur [ C] Abbildung 5.3 :Pulsdauern (HWFM) und Pulsenergien in Abhängigkeit der LBO-Kristalltemperatur bei 20A und 100 Hz Wiederholrate Pulsenergie Pulslänge Pulslänge [ns] Pulsenergie [µj] Lampenstrom [A] Abbildung 5.4 :Pulsdauern (HWFM) und Pulsenergien in Abhängigkeit des Lampenstroms bei C LBO-Kristalltemperatur und 100 Hz Wiederholrate. Der Laser kann sowohl für Einzelpulse als auch bei konstanten Pulswiederholraten bis 10 khz betrieben werden. Die Anzahl der gewünschten Laserpulse wird über die Öffnungszeiten der externen Lasershutter gesteuert. Durch Rotation eines λ/2 Plättchens mit anschließendem Polarisationswürfel als Analysator kann die Pulsenergie beliebig eingestellt und mit einer kalibrierten Photodiode vor dem Lasershutter gemessen werden. Die Lasershutter und das λ/2 Plättchen können vom räumlich getrennten Behandlungsraum aus durch den behandelnden Arzt angesteuert werden (Abb. 5.1).

34 32 Kapitel 5: Material und Methoden Frequenzverdoppelter klinischer Nd:YAG-Laser Bei Behandlungen in der Augenklinik Regensburg kam ein longitudinal diodengepumpter, frequenzverdoppelter Nd:YAG-Laser der Fa. Carl Zeiss Jena zum Einsatz [60]. Die Laserparameter des klinischen Nd:YAG-Prototypen sind 800 ns FWHM Pulsdauer, 500 Hz Laserwiederholrate und bis 200 µj Pulsenergie. Der Nd:YAG-Laser wird durch Diodenlaser cw gepumpt. Die Anzahl der applizierten Pulse kann zwischen 25 und 100 eingestellt werden. Das Prinzip der Pulsverlängerung ist ähnlich dem des Nd:YLF Lasers (Kap ). Wenn die Verluste des Resonators gleich der Verstärkung des Laserstrahls durch das Lasermedium sind, so wird ein Puls konstanter Leistung emittiert, solange eine Inversion des Lasermediums gegeben ist. Die transiente Änderung der Resonatorgüte wird durch den akusto-optischen Modulator (AOM) realisiert [60]. Abbildung 5.5 :Prinzipskizze des klinischen Zeiss Nd:YAG-Laser, nach [60] Frequenzverdoppelter experimenteller Nd:YAG-Laser Zur Erzeugung von Laserpulsen im ns-bereich wurde ein gütegeschalteter, frequenzverdoppelter Nd:YAG der Firma MBB Medizintechnik verwendet. Der blitzlampengepumpte Laser hat 75 cm Resonatorlänge und wird mit einer Pockelszelle geschaltet. Der Laser kann mit maximal 20 Hz Wiederholrate betrieben werden. Der emittierte 8 ns Laserpuls der Grundwellenlänge wird extern mit einem KTP-Kristall frequenzverdoppelt und anschließend mit einem Quarzprismenensemble durch die Dispersion in 1064 nm und 532 nm getrennt (Abb. 5.6). Die Effizienz der Frequenzverdoppelung liegt bei 15 % der eingestrahlten Laserenergie. Die Pulsschwankungen liegen bei 20 % Paek-to-Peak. Bei 532 nm werden bis zu 1.5 mj emittiert. Über einen dichroitischer Strahlteiler wird ein Ziellaser (633 nm, 0.5 mw) mit in dem Nd:YAG-Laser zusammengeführt und über eine Linse in eine Glasfaser (Ceram Optec, UV50/125P, 50 µm Kern, NA 0.2, 50 m) eingekoppelt.

35 Kapitel 5: Material und Methoden 33 Abbildung 5.6 :Prinipskizze des experimentellen Nd:YAG-Laser Aufbaus Argon-Laser Der Argon-Laser der Firma Spectra Physics (model s) kann mit einem Dispersionsprisma innerhalb des Resonators auf die Wellenlänge 514,5 nm festgelegt werden. Bei dieser Wellenlänge emittiert er 7 Watt linear polarisiert und annähernd TEM 00. Mit einem AOM (OEM-Produkt ohne Kennung) werden aus dem kontinuierlichen Laserstrahl Pulse herausgeschnitten. Die erste Ordnung des AOM wird nach einer Blende mit einer Linse in eine Faser (Coherent, 50 µm, NA 0.1, 2 m) eingekoppelt (Abb. 5.7). Zur zeitlichen Verringerung des Streulichtanteils des AOM von 0.01 % in der ersten Ordnung ist vor dem AOM ein Shutter eingebaut, dessen minimale Öffnungszeit bei 20ms liegt. Der AOM schaltet seinen Puls 20 µs nach Öffnen des Shutters durch. Somit kann eine Erwärmung des Bestrahlungsareals durch Streulicht zeitlich auf 20 ms minimiert werden. Es lassen sich Pulsdauern von 5 µs bis cw-bestrahlung realisieren. Die Schaltzeit des AOM beträgt 40 ns. Es kommt bei Bestrahlungszeiten >100 ms zu Leistungsschwankungen. Aufgrund der langen Schallwandlerbeanspruchung bildet sich eine thermische Linse im AOM-Kristall mit einer damit einhergehenden Drift des Laserspots bei der Fasereinkopplung aus. Die maximale Transmission des gesamten Aufbaus lag bei 15 %.

36 34 Kapitel 5: Material und Methoden Argon Laser Shutter AOM AOM-Treiber 0. Ordnung 1. Ordung Strahlfalle Blende Abbildung 5.7 :Argon-Laser mit AOM. Es können Pulsdauern von 5 µs bis 100 ms realisiert werden Spekle-Werte bei verschiedenen Lasersystemen Bei der Lichtleitung durch Multimode-Fasern kommt es durch die Weglängendifferenz der verschiedenen Moden bei Einkopplung kohärenter Strahlung zu Interferenz (Abb. 5.8). Um ein möglichst homogenes Intensitätsprofil am Faserende zu erhalten, muß der Weglängenunterschied L der miteinander interferierenden Moden über der Kohärenzlänge des Lasers liegen. Der maximale Weglängenunterschied kann durch L = L cos( β) L (1) abgeschätzt werden, wobei L der Faserlänge entspricht. Für den Winkel der Totalreflexion β gilt das Brechungsgesetz: sin( β) = NA n (2) NA = numerische Apertur der Faser n = Brechungsindex des Faserkernmaterials L L(NA) NA β Kern Abbildung 5.8 :Weglängenunterschied bei einer Multimodefaser. Cladding

37 Kapitel 5: Material und Methoden 35 Die Intensitätsmuster am Faserende mit statistisch verteilten Phasen bezeichnet man als Spekle. Der Kontrast K und der Speklefaktor F des Speklefeldes ist definiert als [61]: K = H max H min H max H min (3) H max H min = maximale Bestrahlung im Speklefeld = minimale Bestrahlung im Speklefeld F = H max H mean (4) H mean = mittlere Bestrahlung im Speklefeld Mit Hilfe der Speklefaktoren lassen sich die gemessenen ED 50 Werte, also die mittlere Bestrahlungen H mean bei denen mit 50 % Wahrscheinlichkeit das Schwellenkriterium erfüllt ist, auf ihre maximale Bestrahlung Hmax korrigieren. Dies ist für einen genauen Vergleich der Schwellenwerte, und für eine grundlegende Diskussion der Werte miteinander notwendig. Die korrigierte maximale Bestrahlung H max errechnet sich aus Gl. (4) durch: H max = H mean F (5) Für die in den verschiedenen Aufbauten dieser Arbeit verwendeten Lasersysteme wurden der Speklekontrast und der Speklefaktor bestimmt. Dazu wurde das durch die Spaltlampe erzeugte Abbild des Faserendes über ein Mikroskopobjektiv auf eine CCD-Kamera vergrößert. Es wurde darauf geachtet, dass die CCD ihre Intensitätsauflösung von 8 bit ausschöpft aber nicht übersteuert wird. Auch war die Größe der Speklegranula größer als die CCD-Einzelelemente. Die Laser wurden mit ihren Arbeitsleistungen betrieben. Das Speklefeld wurde mit einem Laser Beam Analyzer (Spiricon Inc.) gespeichert. Die maximale, minimale und die mittlere Bestrahlung wurden mit der Spiricon-LBA-300PC Software (Spiricon Inc.) bestimmt. Für alle Parameter wurde über 25 Messungen gemittelt. 5.2 Optoakustik In diesem Abschnitt sollen die Detektion und die grundlegenden Möglichkeiten der Optoakustik und deren Anwendung am Auge geklärt werden. Die theoretische Herleitung der thermoelastischen Druckentstehung aus Grundlagen der Akustik, der Hydrodynamik, der Elastizitäts- und der Thermodynamik wird ausführlich in Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung dargestellt. Die dort abgeleiteten Ergebnisse werden im folgenden Kapitel verwendet.

38 36 Kapitel 5: Material und Methoden Piezoelektrischer Effekt Zur Detektion von Drucktransienten wird in den meisten Wandlern der piezoelektrische Effekt ausgenützt. Eine Asymmetrie im Kristallaufbau führt dazu, dass bei einer elastischen Deformation des Kristalls positiv geladene Ionen derart gegenüber den negativ Geladenen verschoben werden, dass ein elektrisches Dipolmoment entsteht. Verschiedene wichtige Piezomaterialien sind polykristallin. Das bedeutet, dass sie oberhalb einer bestimmten Temperatur, der Curie-Temperatur (bei PTZ 328 C [62]), ein hohes Maß an Symmetrie aufweisen. Bei Unterschreiten der Curie-Temperatur verzerrt sich das Kristallgitter spontan und es bilden sich Domänen dielektrisch gleichsinniger Polarisation. Die wichtigsten Werkstoffe sind dabei Bariumtitanat (BaTiO 2 ) und Bleizirkonattitanat (PbNb 2 O 6, oder auch PZT genannt). Allerdings lassen sich diese Stoffe nicht in Form von Einkristallen, sondern nur als Pulver herstellen. Es werden aus ihnen piezoelektrische Keramiken hergestellt, deren Form dem Verwendungszweck angepaßt werden kann. Da die einzelnen Kristalle in so einem Verbund regellos polarisiert sind, hebt sich deren Piezoelektrizität nach außen hin auf. Der Wandler entsteht durch einen zusätzlichen Polarisationsvorgang. Dabei wird die Keramik über die Curie-Temperatur erwärmt, und unter Anlegung eines äußeren elektrischen Feldes von der Größenordnung mehrerer 10 kv/cm allmählich abgekühlt. Durch das äußere Feld werden die elektrischen Momente ausgerichtet. Unterhalb der Curie-Temperatur bleibt dieser Zustand erhalten. Die Eigenschaften dieser anisotropen, piezoelektrischen Materialien werden durch verschiedene polarisations- und deformationsabhängige Parameter beschrieben. Es wird konventionsgemäß das in Abb. 5.9 angegebene Koordinatensystem verwendet. 3 Piezokeramik Elektroden 1 Polarisation Deformationsrichtung h 2 Abbildung 5.9 :Definition von Polarisation und Deformationsrichtung einer piezoelektrischen Ringkeramik Die Materialkonstante, die den Zusammenhang zwischen der senkrecht zur Oberfläche wirkenden Druck pzt (, ) und erzeugter elektrischer Flußdichte φz (, t) bei den hier vorliegenden Geometrie beschreibt, ist die piezoelektrische Konstante g 33 [63]: φ( z, t) = g 33 pzt (, ) (6)

39 Kapitel 5: Material und Methoden 37 Die durch diese Flußdichte auf den Elektrodenoberflächen induzierte Ladung qt () ergibt sich durch eine Mittelung des Drucks über die Höhe h des Wandlers sowie über eine Multiplikation mit der Wandlerfläche A Wandler zu [64]: h qt () = g 33 A Wandler ( 1 h) pzt (, ) dz = g 33 A Wandler pt () 0 (7) Die Ladung ist somit dem auf den Wandler wirkenden räumlich gemittelten Druck proportional Schallwandler in vitro (PIN-Transducer) Die optoakustischen Messungen bei den in vitro Experimenten wurden mit einem PIN-Transducer der Firma Valpey-Fisher (VP-1093, 0-10 MHz) durchgeführt. Der Piezokristall hat einen Durchmesser von 1.3 mm, der gesamte Wandler 2.4 mm. Auf der Vorderseite des Piezokristalls ist eine akustische Anpassunggsschicht gegenüber Wasser aufgeklebt (Abb. 5.10). Durch die für einen Schallwandler kleinen Abmessungen kann er bei den Versuchen bis auf wenige Millimeter an die bestrahlte Probe herangeführt werden. Durch die kleinen Bestrahlungsareale die hier als Schallquelle fungieren befindet man sich aber auch bei diesen Abständen immer im akustischen Fernfeld. Der Druck p(r) fällt mit dem Abstand r nach pr () = 1 -- p0 ( ) r (8) ab [65]. Aufgrund des geringen Abstandes können sehr empfindlich Druckamplituden gemessen werden. Goldbedampfung Piezzokristall λ/4 Anpassung Backing Kontakt seitliches Backing Edelstahlrohr Abbildung 5.10 :Prinzipieller Aufbau und Bild des PIN-Transducer von Valpey-Fisher.

40 38 Kapitel 5: Material und Methoden Schallwandler in vivo (OA-Kontaktglas) Um während der Behandlungen am Menschen optoakustischen Signale zu detektieren, wurde ein in ein Kontaktglas (Haag-Streit, 903L) eingebetteter piezoelektrischer Ringwandler entwickelt (Abb. 5.11,5.12). Da das Kontaktglas mit einem optischen Kontaktgel (Novartis, Methocel 2 %) direkt auf dem Auge aufgesetzt wird, ist ein guter akustischer Kontakt an das Auge sichergestellt. Die Verwendung einer Ringgeometrie erlaubt relativ große Wandlerflächen bei gleichzeitig uneingeschränktem Blickfeld durch das Kontaktglas. Der Ringwandlerkristall hat die Resonanzfrequenz 1MHz (Innendurchm. 16 mm, Außendurchm. 20 mm). Die aktiven Kristallflächen sind beidseitig mit Aluminium als elektrischer Leiter bedampft. Kontaktglas Haag-Streit laser-lens 903L piezoelektrischer Ringwandler Abbildung 5.11 :Aufbau des OA-Kontaktglases: Der Ringwandler wird in das Kontaktglas eingebettet. Abbildung 5.12 :Bild des OA-Kontaktglases (Haag-Streit, 903L) in verschiedenen Ansichten. Der Kontaktbereich mit dem Patientenauge bleibt bei der Erweiterung unverändert.

41 Kapitel 5: Material und Methoden Kalibrierung der Schallwandler Das OA-Kontaktglas und der ebenfalls verwendete PIN-Transducer (Valpey-Fisher, VP 1093) wurden mit einem kalibrierten Hydrophon (Ceram, Modell No. 118, 15 mv/bar) abgeglichen. Das Hydrophon weist den Kalibrierungsdaten zufolge einen konstanten Frequenzgang von 50 khz bis 50 MHz auf. Zur Erzeugung der Schallwellen wurde schwarz eloxiertes Aluminium mit 150 ns Nd:YLF Laserpulsen ( µj), die über eine Spaltlampe appliziert wurden, in einem Wasserbad bestrahlt. Die Wandler wurden zur Schallquelle ideal ausgerichtet. Das kalibrierte Hydrophon wurde mit dem Vorverstärker (Panametrics, Model 5663, 54 db), die beiden anderen Wandler mit dem Vorverstärker (Panametrics, Model 5676, 40 db) verstärkt. Die Schallsignale wurden und mit einem Oszilloskop (Tek, TDS 224) aufgenommen und auf einen PC zu weiteren Auswertung übertragen. Der Aufbau ist in Abb dargestellt. Absorber Hydrophon Valpey Fisher VP-1093 Hydrophon Ceram No.118 Vorverstärker Panametrics 5663 Vorverstärker Panametrics 5676 Vorverstärker Panametrics 5676 Oszilloskop Tek TDS 224 Wasserbad Spaltlampe OA- Kontaktglas Abbildung 5.13 :Versuchsaufbau zur Schallwandlerkalibrierung. Da das Frequenzmaximum der generierten Schallwellen (Abb. 6.2) bei 0.5 MHz lag, ist eine lineare Schallausbreitung gegeben [65]. Die Verringerung der Druckamplitude über den Abstand r ist durch Gl. (8) gegeben. Die Abstände r der Schallwandler zur Schallquelle wurden durch die Schallaufzeiten bestimmt. Mit Hilfe der Gleichung (8) kann die absolute Durckamplitude errechnet werden Schallfeldsimulationen zur Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases Trifft die zu detektierende Drucktransiente in schrägem Einfall auf den Ringwandler, so kommt es in dem Wandler zu jedem Zeitpunkt zu einer Integration über unterschiedliche Phasenflächen der einzelnen Frequenzkomponenten [66]. Dies hat den Effekt einer Mittelung, wodurch es zu einer Verzerrung des zu detektierenden optoakustischen Signals kommt. Dieser Effekt tritt bei der Verwendung des OA-Kontaktglases bei Patientenbehandlung auf, da der behandelnde Arzt das Glas nach seinen Anforderungen ausrichtet.

42 40 Kapitel 5: Material und Methoden Einerseits verkippt er das Glas um sich selbst mit dem an der Kontaktglasoberfläche reflektiertem Licht des Beleuchtungsspaltes nicht zu blenden, andererseits werden auch verschiedene Areale des Augenhintergrundes bestrahlt. Eine zusätzliche akustische Ausrichtung auf die ausgezeichnete Mittelachse des Kontaktglases ist unpraktikabel. Es wurde mit einer numerischen Simulation untersucht, in wieweit sich die Verkippung des Kontaktglases oder eine Änderung der Bestrahlungssituation wie in Abbildung 5.14 auf die Signalform auswirkt. Abbildung 5.14 :Mögliche Entstehungsorte der optoakustischen Transiente. Durch die Laufzeitunterschiede auf dem Ringwandler kommt es zur Signalverzerrung. Eine besonders einfache Art einer Schallquelle ist die Punktschallquelle. Diese führt zur Abstrahlung einer Kugelwelle. Zur Bestimmung von Schallfeldern stehen prinzipiell zwei Möglichkeiten zur Verfügung. Einerseits die Lösung des Greenschen Integrals durch Integration über die Schallabstrahlungsfläche [67]: prt (, ) = S u n ρ ( r0, t r c) t ds 2πr, (9) u n ( rt, ) c r = Geschwindigkeitspotential, = Schallgeschwindigkeit, = Aufpunkt.

43 Kapitel 5: Material und Methoden 41 oder andererseits die Summation nach dem Hygenschen Prinzip. Dabei wird die Schallabstrahlungsfläche, in unserem Fall die bestrahlte Fläche im Auge, in mehrere Punktwandler unterteilt die Kugelwellen aussenden. Es muß darauf geachtet werden, dass der Abstand der einzelnen Punktwandler auf der Wandlerfläche klein gegenüber der abzustrahlenden Wellenlänge ist. Am Aufpunkt der Schallfeldbestimmung werden dann die Amplitude und Phase der Einzelwandler numerisch addiert. Mit dem Computer ist sowohl die numerische Integration der Gleichung (9)[68], als auch die Parametrisierung der Wandlerfläche in viele Punktwandler mit anschließender Summation möglich [69]. Die Simulationen wurden mit dem Softwarepaket ULTRASIM durchgeführt. Es ist ein GUI-Projekt der Universität Oslo zur Simulation von Schallfeldern medizinischer Ultraschallwandler [70]. Es basiert auf dem Programm MATLAB [72] und wurde in Unterroutinen mit Bedienoberfläche umgesetzt. Es simuliert nach dem Hygenschen Prinzip die Schallabstrahlung beliebiger Schall abstrahlender Flächen. 5.3 Organmodell Schweine-RPE Die in vitro Experimente wurden an Schweine RPE-Präparaten durchgeführt: Die Schweineaugen wurden vom Schlachthof der Norddeutschen Fleischzentrale Lübeck (NFZ) zur Verfügung gestellt. Die vorwiegende Rasse war Deutsche Pig die beim Schlachten in etwa 24 Monate alt war. Die Tiere werden mit CO 2 narkotisiert und per Bolzenschuß getötet. Die Augen werden direkt nach dem Schlachten vom Personal des Schlachthofes entnommen und in feuchter Umgebung zum Transport gelagert. Innerhalb von 4 Stunden wurden die Experimente mit Präparation, Bestrahlung und Färbung abgeschlossen. Da die RPE-Pigmentierung der Mastschweine teilweise sehr gering war, bis hin zu Albinismus, wurden für die Experimente ausschließlich stark pigmentierte Schweineaugen verwendet. Diese zeigten bei Beleuchtung des Auges von hinten kein, oder nur wenig Lichttransmission durch die Pupille Probenpräparation Für die Präparation werden die Augen äquatorial eröffnet und der Glaskörper entfernt. Aus dem hinteren Augensegment wird ein etwa 1 cm² großes Präparat ausgeschnitten. Die Netzhaut kann leicht abgezogen werden, so dass das Präparat nur noch aus RPE, Bruchscher Membran und Chorioidea auf der Sklera besteht. Die Präparate werden in einen Probenhalter gelegt, mit PBS (Phosphate Buffered Solution) benetzt und mit einem verschraubbaren Deckel gesichert (Abb. 5.15). Um eine Lichttransmission in optischer Qualität zu erreichen und um das Präparat vor dem austrocknen zu sichern wird das Probenvolumen mit einem Deckglas, welches durch Adhäsion selbst haftet, verschlossen.

44 42 Kapitel 5: Material und Methoden CalceinAM Metallring Deckglas Deckel Probe Petrischale Schrauben Abbildung 5.15 :Probenhalter mit Präparat. Der Metallring dichtet den Probenraum ab und begrenzt das Probenvolumen (aus [73]) Vitalitätsassay CalceinAM Zum Nachweis des RPE-Zelltodes wird der Farbstoff CalceinAM verwendet [74]. Er besteht aus einer mit Calcein veresterten Acetoxymethylgruppe (AM) (Abb. 5.16). Abbildung 5.16 :Strukturformel von CalceinAM, (aus [74]). CalceinAM fluoresziert nicht und ist unpolar. Es kann aufgrund dieser Unpolarität gut in die Zellen des RPE diffundieren und wird dort durch Enzyme aus der Gruppe der Esterasen in Calcein umgesetzt. Calcein ist ein Derivat von Fluoreszein und stellt den eigentlichen Fluoreszenzmarker dar. Calcein ist im Milieu der Zellen 4-fach negativ geladen. Als polares Molekül verliert es die Fähigkeit, die Zellmembran zu passieren. Calcein wird nur in Zellen gebildet die durch Esterasen die Acetoxymethyl-Gruppe (AM) von CalzeinAM abspalten können. CalzeinAM weist also sowohl Enzymaktivität der Esterasen nach, die notwendig ist, um die Fluoreszenz zu aktivieren, als auch die Integrität der Membran, die notwendig ist damit sich der Farbstoff akkumuliert. In einem Zeitraum von 30 Minuten ist genügend Calcein in vitalen Zellen akkumuliert, um vitale und abgetötete Zellen durch Fluoreszenz voneinander unterscheiden zu können. Bei der Auswertung der Fluoreszenz erscheinen lebende Zellen fluoreszierend, tote Zellen dunkel (Abb. 5.17). Calcein besitzt ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 490 nm und hat eine maximale Fluoreszenz bei 520 nm (Abb. 5.18).

45 Kapitel 5: Material und Methoden 43 Abbildung 5.17 :Mit CalceinAM angefärbte RPE-Probe mit geschädigten Zellen im Bestrahlungsareal Absorption [a.u.] Absorption Emission Fluoreszenzintensität [a.u.] Wellenlänge [nm] Abbildung 5.18 :Absorptions- und Emissionsspektrum von Calcein; aus [74]. Wird das CalceinAM vor der Bestrahlung aufgetragen, wird lediglich eine Beschädigung der Zellmembran nachgewiesen. Das in der Zelle akkumulierte Calcein strömt nach der Zerstörung der Zellmembran durch die Bestrahlung in den interzellulären Raum und die Zellen erscheinen unter dem Fluoreszenzmikroskop dunkel. Ist die Zellmembran durch die Bestrahlung nicht geschädigt worden, verbleibt das akkumulierte, fluoreszierende Calcein aufgrund seiner Polarität in den Zellen. Der Nachweis einer Schädigung des Stoffwechselhaushaltes der Zelle kann so nicht erbracht werden. Die Folge hieraus kann sein, dass Zellen, die zwar tot sind, aber noch eine intakte Zellmembran besitzen, nicht als tot erkannt werden. Darum wurden die RPE-Proben erst nach der Bestrahlung mit CalceinAM inkubiert. Dann erscheinen alle geschädigten Zellen dunkel, unabhängig davon, ob der Zelltod durch eine Beschädigung der Zellmembran oder fehlende Esterasen hervorgerufen wurde.

46 44 Kapitel 5: Material und Methoden Die Auswertung der inkubierten RPE-Präparate erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroskop (Aristoplan, Leitz) über den Filterblock I3 der Firma Leitz. Es konnten die Präparate nur betrachtet, und mit einer Slow-Scan-Kamera (Scientific Instruments) aufgenommen werden. 5.4 Fluoreszenzbasierte On-line Dosimetrie Thermische Denaturierungsmessung an A2E Eines der Fluorophore des Lipofuszin wurde als A2E identifiziert. Es ist ein Pyridium bis-retenoid das durch eine Schiff-Basen Reaktion entsteht [37]. Da es ein Hauptbestandteil des Lipofuszin ist und synthetisch hergestellt werden kann, wurde untersucht ob sich dieser Teil des Lipofuszin thermisch denaturieren läßt. Für diese Untersuchungen wurde A2E freundlicherweise von PD Dr. Holz (Augenklinik Heidelberg) für Messungen zur Verfügung gestellt. A2E wird durch die Anbindung von all-trans-retinal und Ethanolamin im Verhältnis 2:1 gebildet [37]. Danach wird es durch Vakuum konzentriert und mit einer sequentielle Dünnschicht-Chromatographie aufgereinigt [34]. Das in Methanol gelöste A2E (1.22 mm) wurde in DMSO auf 1 µm verdünnt. Eine weitere Verdünnung in Methanol hätte nur Temperaturen bis zum Verdampfungspunkt von 64 C zugelassen. Der Verdampfungspunkt von DMSO liegt bei 189 C. Somit konnten auch Versuche bei höheren Temperaturen gemacht werden. Die Messungen wurden mit einem Fluoreszenzspektrometer SPEX 2 (Jobin Yvon Instruments) durchgeführt. In der Probenkammer wurde ein temperierbarer Küvettenhalter eingesetzt. Damit ließen sich Temperaturen im Bereich 2 C bis 80 C realisieren. Die Probentemperatur wurde mit einem Thermoelement Typ J in der Küvette gemessen und der zeitliche Verlauf mit einem PC aufgenommen. Die Probentemperatur konnte auf 0.01 C Genauigkeit gemessen werden. Während der Messungen wurde die Probe laufend mit einem Mikrorührer umgewälzt On-line Fluoreszenzdetektion an der Spaltlampe Die zur Bestrahlung verwendete Wellenlänge des Nd:YLF-Laser von 527 nm liegt im Fluoreszenzanregungsmaximum des Augenhintergrundes (Abb. 2.4). Das ermöglicht, den Bestrahlungslaserpuls bereits als Exzitationspuls zur Fluoreszenzdetektion zu nützen. Während des Bestrahlungspulses wird eine Pulsleistung von ca. 60 W, was bei dem verwendeten Spotdurchmesser 246 kw/cm² entspricht, für 1,7 µs eingestrahlt. Das sind 6 Größenordnungen mehr, als für eine diagnostische cw-fluoreszenzanregung üblich ist. Das Faserende der Spaltlampenfaser mit den Kerndurchmesser von 160 µm wird mit der Spaltlampe 1:1 auf den Augenhintergrund abgebildet. Das Fluoreszenzlicht der RPE-Probe, das in den Laserstrahlengang der Spaltlampe (NA = 0.1) zurückfällt wird

47 Kapitel 5: Material und Methoden 45 durch einen dichroitischen Strahlteiler ausgekoppelt. Der Strahlteiler wurde so dimensioniert, dass das Fluoreszenzlicht zu nahezu 100 % von 570 nm bis 750 nm ausgekoppelt, das Laserlicht zu 80 % transmittiert wird (Abb. 5.19) nm 80 Transmission [%] Wellenlänge [nm] Abbildung 5.19 :Transmissionsspektrum der dichroitischen Strahlteilers zur AF-Detektion. Der Strahlteiler ist in einem Zusatzmodul, das zwischen dem Pankrat (Faserauskopplung) und Spaltlampe eingesetzt werden kann, untergebracht (Abb. 5.20). Über eine Linse (f = 25) und einen Farbglasfilter (Schott, KV550) wird das Fluoreszenzlicht in eine Glasfaser (600 µm, NA 0.22) eingekoppelt und auf einen Photomultiplier (Heidelberg Instruments/Hamamatsu, Typ R1463) geführt. Mit dem Farbglasfilter direkt vor der Fasereinkopplung wird das Laserlicht, das an den optischen Bauteilen der Spaltlampe reflektiert wird herausgefiltert. Am Pankrat wird auf eine Photodiode (Laser Components, FND 100) ein Teil des Laserlichtes ausgekoppelt. Die Messdaten des PMT und der Photodiode werden mit einem Transientenrekorder (Sony/Tek, RTD710) gespeichert und mit einem PC weiterverarbeitet. Zusammengefaßt dargestellt ist der Aufbau in Abb

48 46 Kapitel 5: Material und Methoden Bestrahlungslaser Nd:YLF Fluoreszenzlicht der RPE-Probe RPE-Probe Photomultiplier Spaltlampe SL 30, Zeiss dichroidischer Strahlteiler Transientenrekorder Fluoreszenzauskopplung Pankrat Photodiode PC Abbildung 5.20 :Meßaufbau zur Detektion der RPE-Autofluoreszenz bei Bestrahlung; (siehe auch Erweiterung mit optoakustischer Detektion in Abb. 5.22). Da bei Patientenbehandlung genügend Fluoreszenzlicht zur Verfügung stand, wurde auch statt des Photomultiplier mit einem OMA (optical multichannel analyzer, S2000, Ocean-Optics) das AF-Spektrum bei Behandlung gemessen werden. In dem OMA wird das einfallende Fluoreszenzlicht über eine Spiegelanordnung und ein Reflexionsgitter spektral aufgelöst auf eine CCD-Zeile projiziert. Dadurch erhält man die Möglichkeit, zu einem Zeitpunkt das gesamte Spektrum zu erfassen. Die spektrale Auflösung ist dabei durch die Anzahl der CCD-Zeilenelemente (2048), der spektralen Breite des Spektrometers ( nm) und der Glasfaserdicke (100 µm) bestimmt. Für den Aufbau ergab sich eine spektrale Auflösung von 5 nm, was für das Emissionsspektrumsbreite von 250 nm ausreichend war. Die minimale Integrationszeit der CCD-Zeile lag bei 4.4 ms. Damit konnte sichergestellt werden, dass nur das Fluoreszenzlicht eines Laserpulses aufgenommen wurde die bei 100 Hz Laserwiederholrate alle 10 ms folgen. Jedoch benötigte die Ausleseelektronik 27 ms um die Daten vom Spektrometer auf den PC zu übertragen. Dadurch konnte nur jeder dritte Fluoreszenzpuls gemessen werden. Der ganze Aufbau wurde spektral mit einer Kalibrationslampe (Oriel) kalibriert, so dass Aussagen über absolute spektrale Fluoreszenzleistungen möglich sind Postoperative Autofluoreszenz nach selektiver RPE Behandlung Wie in Kap näher beschrieben, wurde in Kooperation mit Herrn Prof. Dr. H. Roider und Dr. C. Framme von der Augenklinik Regensburg die Möglichkeit untersucht, den selektiven RPE-Schaden über retinale AF-Bilder mit einem Laser Scanning Retina-Angiographen postoperativ nachzuweisen. Bei thermischer Denaturierung kann es nach selektiver Bestrahlung zur Verringerung der retinalen Autofluoreszenz kommen. Dieser Effekt sollte mit der bildgebenden Darstellung der retinalen Autofluoreszenz nachweisbar sein. Auch bei einer thermomechanischen Zerstörung der RPE-Zellen durch Mikroblasen kann es zu einer Abnahme der

49 Kapitel 5: Material und Methoden 47 Lipofuszin-Konzentration am Ort der Bestrahlung durch Abtransport der geschädigten RPE-Zellen und deren Fragmente kommen. Dieser Prozeß sollte wie eine Oedembildung einen Zeitraum von mindestens 30 Minuten haben. Auch hierbei kommt es zu einer Intensitätsreduktion der Autofluoreszenz. Insgesamt wurden 26 Patienten in Regensburg mit verschiedenen makulären Erkrankungen behandelt. Die Behandlung wurde mit einem Zug von repetitiven Laserpulsen des klinischen Zeiss Nd:YAG-Lasers (Kap , Spotgröße: 200 µm; Repetitionsrate: 500 und 100 Hz, Anzahl der Pulse: 100 und 30) durchgeführt. Die Autofluoreszenz wurde mit einem Retina-Angiographen postoperativ bei 488 nm angeregt und über einen Filter (Transmission > 500 nm) detektiert (Heidelberg Engineering, HRA II). Es wird eine Serie von 20 Autofluoreszenzbilder aufgenommen, und nachträglich zueinander ausgerichtet und gemittelt. Die Patienten wurden zu verschiedenen Zeitpunkten postoperativ untersucht (10 Minuten, 1 Stunde, 1 Woche). Zusätzlich wurde eine Stunde nach Behandlung ebenfalls eine Fluoreszenz- gegebenenfalls eine ICG-Angiographie zur Verifikation des Lasererfolges durchgeführt. 5.5 Optoakustische On-line Dosimetrie Optoakustische Dosimetrie an der Spaltlampe in vitro Für die optoakustische Dosimetrie bei RPE-Präparatbestrahlung wurden die RPE-Probenhalter (Kap ) in der mit isotonischer Kochsalzlösung gefüllte Probenküvette befestigt. Der Schallwandler (PIN-Transducer, Kap ) wurde auf 1-2 mm an das Bestrahlungsareal herangeführt, ohne den Laserstrahl abzuschatten oder die Probe zu berühren. Die mit einem Laserpuls induzierte Transiente wird mit dem Schallwandler gemessen. Die Wandlersignale wurden mit einem Vorverstärker (Panametrics, Model 5676, 40 db, 50 k - 20 MHz) verstärkt und mit einem Transientenrekorder (Sony/Tek, RTD710, 100 MHz sampelrate) gespeichert. Am Pankrat wird ein Teil des Laserlichtes ausgekoppelt und auf eine Photodiode gegeben. Somit können alle applizierten Laserpulse auch mit dem Transientenrekorder gespeichert werden. Die Daten wurden auf einen PC übertragen und ausgewertet. Für die Experimente zur optoakustischen Temperaturbestimmung wird noch zusätzlich ein Thermoelement (Typ J) nahe der Probe plaziert um die langsamen Temperaturänderungen Probenküvette durch das Wasserbad bestimmen zu können. Das Signal des Thermoelement wird verstärkt (Greisinger, GTH 1200) und mit ein Oszilloskop (Tektronics, Tek 220) ausgelesen.

50 48 Kapitel 5: Material und Methoden Spaltlampe Zeiss 30 SL/L Photodiode Schallwandler Probenküvette Wasserbad Thermoelement RPE-Probe Vorverstärker Transientenrekorder PC Nd:YLF Laser Abbildung 5.21 :Meßaufbau zur optoakustischen Detektion bei Bestrahlung von Schweine-RPE Optoakustische Dosimetrie bei Patientenbehandlung Um während den Patientenbehandlungen OA-Messungen durchführen zu können, wurde ein Aufbau konzipiert, der es ermöglichte die OA-Transienten zu erfassen, abzuspeichern und in Echtzeit zu analysieren. Die OA-Transienten wurden mit dem in Kap beschrieben OA-Kontaktglas gemessen und mit einem Vorverstärker (Panametrics, Model 5676, 40 db) verstärkt. Für eine schnelle Datenerfassung wurde ein PC mit einer 4 Kanal PCI Transientenrekorderkarte mit integriertem digitalem Signalprozessor (DSP on board) der Firma Datel verwendet (Datel PCI 431, 10 MHz sample rate). Diese Karte erlaubt es, durch die Anbindung an das Rechnersystem über eine PCI Schnittstelle, die Daten zwischen den einzelnen Laserpulsen auf den Arbeitsspeicher des Rechners zu transferieren. Somit war gewährleistet, dass die Datenauswertung wirklich On-line erfolgte. Als weitere Signale wurden noch die Fluoreszenzintensität als auch die Laserpulsleistung mit dieser Karte erfaßt. Die Kontrolle der Karte, als auch die komplette Auswertung wurde unter LabView [75] realisiert. Zur Dokumentation wurde eine Farb-CCD Kamera (Imaging Source, DHC 1003, autogain im zentralen Bildbereich) mit SVHS Ausgang verwendet. Diese wurde über einen teildurchläßigen Spiegel an das Spaltlampenmikroskop angekoppelt. Die Behandlung wurde mit einem SVHS Videorecorder aufgenommen, um so später den Fluoreszenzangiographien einzelne Läsionen zuordnen zu können. Zusammengefaßt ist der Aufbau in Abb dargestellt.

51 Kapitel 5: Material und Methoden 49 Bestrahlungslaser Nd:YLF Fluoreszenzlicht der RPE-Probe Spaltlampenmikroskop mit CCD Kamera OA Kontaktglas Photodiode SVHS Videorekorder dichroidischer Strahlteiler PC mit PCI- Messkarte Spaltlampe SL 30, Zeiss Fluoreszenzauskopplung Pankrat Photodiode Faser Behandlungssteuerung Nd:YLF Laser Abbildung 5.22 :Kombinierter Meßaufbau für optoakustische und AF-Detektion (siehe Abb. 5.20) bei Patientenbehandlung. 5.6 Reflexbasierte On-line Dosimetrie Reflexdetektion an der Spaltlampe in vitro Eine weitere Möglichkeit zur Detektion von Mikroblasen ist die Reflexion und Brechung von Licht an der entstehenden Wasser-Blasen Grenzfläche in der RPE-Zelle (Kap ). In mehreren Arbeiten wurde diese Methode zur Untersuchung der Blasendynamik von Kavitationsblasen verwendet [76, 10]. Dabei wurde die Blase in Transmission betrachtet, was zu einer Abschwächung des Detektionsstrahles führt. Zum Nachweis von Mikroblasen bei der Bestrahlung von RPE-Proben ist nur eine Anordnung in Reflexion, also die Rückstreuung des Lichtes, denkbar, da die Chorioidea und vor allem die Sclera stark streuende Medien sind. Der optisch basierte Reflexnachweis wurde nur als zweite, von der Optoakustik physikalisch unabhängige Nachweismethode eingesetzt. Der zeitliche Rahmen zur Ausarbeitung des Aufbaus war daher beschränkt. Bei der Bestrahlung von RPE-Proben mit Einzelpulsen von 5 µs bis 3 ms Pulsdauer des Argonlasers (Kap ) wurden Reflexmessungen durchgeführt. Der Aufbau wurde mit in eine Spaltlampe integriert. Dadurch kommt es zu einer Begrenzung der numerischen Apertur auf 0,1. Dies ist eine wesentlicher Verringerung im Vergleich zu den Aufbau von Rögener [22]. Ein teilweise reflektierend bedampfter Spiegel wurde in den kollimierten Strahl des Spaltlampenmikroskopes integriert (Abb. 5.23). Reflektiertes Licht der RPE-Probe wird über eine Linse konfokal auf einen Photomultiplier (Heidelberg Instru-

52 50 Kapitel 5: Material und Methoden ments/hamamatsu, Typ R1463) geleitet. Die zeitliche Auflösung des Photomultiplier wurde auf 250ns bestimmt [77]. Durch die konfokale Anordnung wird erreicht, dass reflektiertes Licht außerhalb der Bestrahlungsebene, wie z.b. die Vorderfläche der Probenküvette, ausgeblendet wird. RPE-Probe reflektiertes Licht Bestrahlungslaser Linsen Photomultiplier Im Rahmen der Tierversuchsstudie wurde bei der Bestrahlung mit verschiedenen Laserparametern die Reflexion eines Probe-Lasers während des Bestrahlungspulses gemessen. Dafür wurde in die Laserfaser noch das Licht einer gepulst betriebenen Laserdiode (Coherent, f , 690 nm) eingekoppelt. Die Laserdiode wurde in einem Zeitfenster von 20µs betrieben und emittierte dabei maximal 20 mw. Da der Diodentreiber (SLD, SLD-820) eine Anstiegsflanke von 15 µs hatte mußte ein Teil des Laserdiodenlichtes mit einer Photodiode (Laser Components, FND 100, 50 Ohm Abschluß) als Referenzsignal gemessen werden. Das Licht der fasergekoppelten Laserdiode wurde über einen dichroitischen Strahlteiler mit dem Bestrahlungslicht in die Spaltlampenfaser eingekop- Transientenrekorder PC Blende Filter teilbedampfter Spiegel Spaltlampenmikroskop Spaltlampe Zeiss Visulas Argon Laser Pancrat PD Abbildung 5.23 :Meßaufbau für Reflexionsmessungen an der Spaltlampe. Bei der Bestrahlungen von Schweine-RPE Proben mit dem Argonlaser Aufbau aus Kapitel wurde bei den Reflexionsmessungen der Bestrahlungspuls selbst als Probepuls verwendet. Da mit diesem Laseraufbau lange Pulsdauern appliziert wurden, konnte auf die zusätzliche Einkopplung eines Probe-Lasers verzichtet werden. Jedoch können Mikroblasen, die genau am Ende des Bestrahlungspulses entstehen, nicht detektiert werden Reflexdetektion bei der Bestrahlung von Kaninchen

53 Kapitel 5: Material und Methoden 51 pelt. In diesem Aufbau wurde das Bestrahlungslicht mit einem Filter (Schott, KV550) vor dem PMT-Pinhole ausgeblendet, da das Licht der Laserdiode als Reflexionssignal genommen wurde. Transientenrekorder Laserdiode Trigger Signal des PMT Lasertreiber dichroidischer Strahlteiler Spaltlampenfaser, 160µm, NA 0.1 KV550 Laserfaser 105µm, NA 0.1 Fotodiode Abbildung 5.24 :Fasergeführte Einkopplung des gepulsten Laserdiodenlichts für Reflexionsmessungen bei Kaninchenbestrahlung. 5.7 Mikroblasenbildungs- und Zellschadensschwellen bei Lichtexposition von RPE-Proben im µs- bis ms-zeitbereich Die Schwellen für Mikroblasenbildung und RPE-Zellschädigung bei Laserbestrahlung mit Einzelpulse mit Pulslängenbereich vom 5 µs - 3 ms wurde an präpariertem Schweine-RPE für untersucht. Mit Hilfe der optoakustischen Detektion (Kap ) und der Reflexdetektion (Kap ) wurde Mikroblasenbildung bei der Bestrahlung nachgewiesen. In der Prinzipskizze (Abb. 5.25) sind die Zusammenhänge zusammenfassend dargestellt. Wird ein Laserpuls appliziert und es entstehen Mikroblasen so sollte einerseits eine Mikroblasentransiente wie auch eine transiente Rückstreuung des bestrahlten Lichtes meßbar sein. Werden beide Signale gemessen, so wurde mit zwei physikalisch unabhängigen Systemen Mikroblasenbildung nachgewiesen. Entsteht keine Mikroblase, so sollte nur diffuse Rückstreuung von der RPE-Probe ohne transiente Änderungen gemessen werden. Es wurden Schweine-RPE Proben wie in Kap. 5.3 präpariert und zum genauen Nachweis einer RPE-Schädigung wurde erst nach der Bestrahlung eine Färbung mit CalceinAM durchgeführt. Es wurden für alle Pulsdauern die RPE-Schadensschwellen und die Schwelle für die Bildung von Mikroblasen bestimmt und statistisch mit Probit (Kap ) ausgewertet.

54 52 Kapitel 5: Material und Methoden Für die Versuche wurde der in Kap beschrieben Argon Laseraufbau verwendet. Es wurden einzelne Laserpulse mit Pulslängen 5 µs, 50 µs, 500 µs und 3 ms bei verschiedenen Pulsenergien appliziert. Während der Bestrahlung wurden die optoakustischen Signale mit dem in Kap beschriebenen Aufbau gemessen und simultan Reflexmessungen mit dem in Kap erläuterten Spaltlampenaufbau gemacht. Durch die Wahl eines kleinen Spotdurchmessers von 50 µm (ca. 8 RPE-Zellen) und der damit verbundenen niedrigen Pulsenergien, aber vor allem der Verwendung langer Laserpulse können die bei Bestrahlung entstehenden sehr schwachen thermoelastischen Transienten nicht detektiert werden. Im Vergleich zu einer verwendeten Pulslänge von 1.7 µs mit gleicher Bestrahlung und 178 µm Bestrahlungsdurchmesser reduziert sich die thermoelastische Druckamplitude um 96 % [78] bei der Applizierung von 5 µs Laserpulsen in einen 50 µm Spot. Laserpuls keine Mikroblase Mikroblase diffuse Rückstreuung Mikroblasentransiente transiente Rückstreuung durch Mikroblasen Nachweis: keine Mikroblasenbildung Nachweis: Mikroblasenbildung Abbildung 5.25 :Prinzipskizze der Einzelpulsuntersuchungen zum Nachweis des RPE-Schadensmechanismus im µs- bis ms-zeitbereich. 5.8 Parameterstudien in vivo am Kaninchen Die ersten Versuche zur selektiven Schädigung des RPEs wurden von Roider und Birngruber an Kaninchen durchgeführt [2]. Dabei wurde mit einem Argonlaser (5 µs, 500 Hz, 100 Pulse) und einem Nd:YAG (200 ns, 500 Hz, 100 Pulse) bestrahlt [2]. Es wurde von einem thermisch induzierten RPE-Schaden ausgegangen. Im schwellennahen Bereich zeigten sich in den histologischen Ergebnissen keine entscheidenden Unterschiede zwischen beiden Lasersystemen. Erst bei vierfach überschwelliger Bestrahlung mit dem Nd:YAG wurden Schäden an den Außensegmenten der Photorezeptoren sichtbar. Der direkte Vergleich mehrfach überschwelliger Bestrahlung, z.b. bei Einzelpulsen mit 5µs Pulsdauer, war aus technischen Gründen nicht möglich. Da sich im Rahmen dieser Arbeit zeigte, dass es bei Einzelpulsen mit 5µs Bestrahlungsdauer (Kap 6.5) zu Mikroblasenbildung bei der Schädigung der RPE-Zellen kommt, wurde in Tierexperimenten untersucht, ab welcher kürzeren Pulsdauer es zu einer signifikant anderen Schädigungszone um das RPE herum kommt. Auch galt es die Additivität multipler Laserpulse bei bekanntem Schadensmechanismus zu untersuchen.

55 Kapitel 5: Material und Methoden 53 In den Tierversuchsstudien wurden zwei Schädigungsmerkmale ausgewertet. Als Kriterium für eine erfolgte Schädigung des RPE wurde die fluoreszenzangiographische Leckage, mit Durchtritt des chorioidealen Fluoreszein durch die geschädigte Blut-Retina-Schranke festgelegt. In diesem Fall müssen mindestens die Tight-Junctions zwischen den RPE-Zelle geschädigt, oder die RPE-Zellmembran ganz zerstört sein, um ein hindurchdiffundieren des Fluoreszein zu ermöglichen. Als Kriterium für einen sicheren Schaden an den Photorezeptoren wurde die ophthalmoskopische Sichtbarkeit der Läsionen festgelegt. Jedoch ist bei diesem Kriterium nicht ausgeschlossen, dass unterhalb der ophthalmoskopischen Sichtbarkeit ein Schaden an den Photorezeptoren entsteht. Deshalb wurden ebenfalls Histologien angefertigt um das Ausmaß des gesetzten Schadens genauer beurteilen zu können. Die Kaninchenbestrahlungen wurden mit allen drei oben aufgeführten experimentellen Lasern durchgeführt. Es konnten Pulslängen zwischen 8ns (Nd:YAG, 532 nm) bis cw-bestrahlung (Argon, 514 nm) realisiert werden. Dabei blieb die Wellenlänge auf einem kleinen Bereich von 18 nm (514 nm nm) begrenzt. Da die Absorption von Melanin und anderen retinalen Chromophoren in dieser spektralen Region als konstant angesehen werden kann (Abb. 3.1) sind Effekte durch unterschiedlich hohe retinale Lichtabsorption ausgeschlossen [30]. In der ersten Studie wurden mit dem Nd:YLF-Lasersystem Pulse von 5 µs, 1.7 µs und 200 ns Pulslänge (je 100 Pulse, 500 Hz) und als Vergleich mit dem Argon-Laser bei 5 µs und 200 ms appliziert. In der zweiten Studie wurden mit dem Nd:YLF-Laser Experimente mit weiter abgestufter Anzahl der Pulse (100 Pulse, 10 Pulse bei 100 Hz sowie Einzelpulse) mit jeweils 1.7 µs und 200 ns Pulsdauer als auch mit dem experimentellen Nd:YAG 1 und 10 Pulse (10 Hz) bei 8 ns durchgeführt. Zusammengefaßt sind alle Parameter in Tabelle 2. Studie No Laser Wellenlänge Pulsdauer Pulszahlen Pulswiederholrate I Nd:YLF 527nm 200ns Hz I Nd:YLF 527nm 1.7µs Hz I Nd:YLF 527nm 5µs Hz I Argon 514nm 5µs Hz II Nd:YAG 532nm 8ns 1, 10 10Hz II Nd:YLF 527nm 200ns 1, 10, Hz II Nd:YLF 527nm 1,7µs 1, 10, Hz Tabelle 2: Experimentelle Parameter der Tierversuchsstudien

56 54 Kapitel 5: Material und Methoden In Zusammenarbeit mit Herrn Dr. C. Framme von der Augenklinik Regensburg wurden die Parameterstudien durchgeführt. Der Tierversuchsantrag wurden von der Ethikkomission der Medizinischen Universität zu Lübeck genehmigt. Die Versuche wurden nach den Bestimmungen der Association for Research in Vision and Ophthalmology (Resolution on the Use of Animals in Research, 1995) durchgeführt Tiere Die Versuche wurden an Chinchilla Bastard Kaninchen durchgeführt. Die Kaninchen wurden mit Ketamin-Hydrochlorid (35 mg/kg KG) und Xylazin-Hydrochlorid (5 mg/kg KG) anästhesiert und in einem Halteapparat plaziert, der Bewegungen in alle Richtungen zuließ. Ein plankonkaves Kontaktglas (Haag-Streit, 903L) wurde auf das Auge dessen Pupillen aufgeweitet wurden aufgesetzt. Als Kontaktgel wurde Methylcellulose (Novartis, Methocel 2 %) verwandt. Das Kontaktglas wurde am Halteapparat arretiert, um unerwünschte Bewegungen während der Bestrahlung zu vermeiden Laserbestrahlung Die Laserbestrahlungen wurden an einer ophthalmologischen Spaltlampe (Zeiss, SL/L30) durchgeführt. Das Licht der verschiedenen Laser wurde über deren Glasfasern in die Spaltlampenfaser (Zeiss, 160 µm, NA 0.1) eingekoppelt, so dass der Bestrahlungsdurchmesser in Luft durch die 1:1 Abbildung der Spaltlampe ebenfalls 160 µm betrug. Aufgrund der optischen Eigenschaften des Kaninchenauges ergibt sich durch die Verwendung eines Kontaktglases für ein Menschenauge eine Verkleinerung des Laserspots um den Faktor 0.66 [13]. Das verwendete Kontaktglas Haag-Streit 903L macht noch eine Vergrößerung um den Faktor 1.1 beim menschlichen Auge. Daraus ergibt sich für alle Kaninchenbestrahlungen ein retinaler Spotdurchmesser von 116 µm. Zur Orientierung wurden in allen Augen Markerläsionen gesetzt. Dazu wurden sechs bis acht Läsionen in die Regio macularis in einem Gebiet von etwa 3x3mm mit µJ und verschiedenen Laserparametern appliziert. Diese Herde wurden zeichnerisch dokumentiert. Die Pulsenergie dieser Orientierungsmarkerläsionen wurde dabei so hoch eingestellt, dass sich ophthalmoskopisch sichtbare Läsionen ergaben. Die eigentlichen Testläsionen wurden zwischen die Markerläsionen gesetzt und wiederum in Relation zu den Markerläsionen zeichnerisch dokumentiert (Abb. 5.26). Zwischen 30 und 70 Testläsionen mit unterschiedlichen Energien konnten in ein Auge appliziert werden. Insgesamt wurden in allen Versuchen zusammen 1095 Läsionen gesetzt.

57 Kapitel 5: Material und Methoden 55 Abbildung 5.26 :Fundusbild und Fluoreszenzangiographie am Kaninchenauge mit Anfärbung der ophthalmoskopisch nicht sichtbaren, aber angiographisch überschwelligen selektiven Laserherde Datenauswertung der Parameterstudie Außer bei den Soforthistologien wurde immer eine Stunde nach Laserbehandlung der Fundus fotografisch mit einer Funduskamera (Carl Zeiss, Oberkochen) dokumentiert. Anschließend wurde eine Fluoreszenzangiographie mit Injektion von 10 % Fluoreszein-Lösung in eine Ohrvene durchgeführt. Nach Injektion des Farbstoffes färben sich alle Läsionen, bei denen die Blut-Retina Barriere durch einen Schaden des RPEs nicht mehr gegeben ist, die sogenannte angiographische Sichtbarkeit (Abb. 5.26). So wurden auch die während der Bestrahlung ophthalmoskopisch nicht sichtbaren selektiven RPE-Schäden nachgewiesen Schadensschwellenbestimmung mit Probit Nach Auswertung der ophthalmoskopischen Dokumentation und der Angiogramme wurden die dichotomen Werte statistisch ausgewertet. Dichotom bedeutet, dass die Ergebnisse in die Werte 0 und 1 aufgeteilt werden (0 = keine angiographische / ophthalmoskopische Läsion, 1 = sichtbare angiographische / ophthalmoskopische Läsion). Bei der Definition einer ophthalmoskopischen Sichtbarkeit wurde dadurch nur die Erkennbarkeit registriert, nicht aber die Farbnuancen des Laserherdes bewertet. Die statistischen Berechnungen werden unter der Voraussetzung durchgeführt, dass sowohl die angiographische, als auch die ophthalmoskopische Schwellenenergie eine logarithmische normalverteilte Zufallsgröße ist. Die Richtigkeit dieser Hypothese gilt erfahrungsgemäß bei sehr vielen Zufallsgrößen, die keine negativen Werte annehmen können, vor allem aber bei den meisten biologischen Zufallsgrößen. Dies wird auch standardmäßig zur Bestimmung von Laserschadensschwellen am Augenhintergrund angenommen [81]. Mit Hilfe des Statistikalgorithmus Probit [79] des Programmpakets SPSS wurde die logarithmische Normalverteilung an die dichotomen Datenwerte angepaßt [80]. Dabei wird sowohl die bei Schwellenuntersuchungen übliche effektive Dosis bei 50-prozentiger Schädigungswahrscheinlichkeit (ED 50 ), als auch die Steigung (slope) und die Fiduzialin-

58 56 Kapitel 5: Material und Methoden tervallgrößen bestimmt. Dieser Algorithmus wird in SPSS mit der Fortranroutine NPSOL umgesetzt [82]. Ein typisches Ergebniss der Analyse ist in Abb für den RPE-Zellschaden und in Abb für Mikroblasenbildung bei 50 µs Einzellaserpulse an Schweine-RPE in vitro dargestellt (Kap ). Typischerweise wird die slope der Verteilungskurve durch die ED 84 und ED 16 Werte charakterisiert. Diese Werte entsprechen der Standardabweichung der angepaßten Normalverteilung mit logarithmischer Kovariantenbasis. Die verwendete Software SPSS gibt nur die angepaßten Werte für die Schwellen ED 15 und ED 85 an. Diese wurden hier für weitere Auswertung verwendet, da die minimalen Abweichungen die Ergebnisse in ihrer grundsätzlichen Aussage nicht beeinflussen. Der Bereich zwischen der angiographischen ED 85 und der ophthalmoskopischen ED 15 Schwelle wurde als die therapeutische Breite gewertet. Je größer der Unterschied zwischen beiden Schwellen ist, desto sicherer sollte eine selektive Behandlung mit diesem Parameter sein, weil inter- und intraindividuelle Unterschiede in der Energieabsorption eher kompensiert werden können. In den bereits abgeschlossenen Tierversuchsstudien zur SRT wurde bisher immer nur das therapeutische Fester als Bereich zwischen der angiographischen ED 50 und der ophthalmoskopischen ED 50 Schwelle betrachtet [2, 4]. Die teils erhebliche Breite der angepaßten logarithmischen Normalverteilung, also die Streuung der Schwellenwerte, wurde nicht berücksichtigt. Bei den Ergebnissen der hier durchgeführten Studie (Kap ) wurde der Wert ED 50 ophth zu ED 50 ang zum besseren Vergleich zwar noch mit angegeben, aber in der Diskussion mit mehr berücksichtigt Morphologische Untersuchungsmethoden Zur Beurteilung der Gewebeeffekte nach Laserexposition wurden die Läsionen lichtmikroskopisch Untersucht. Für die Soforthistologien ist sofort nach Exposition ein Fundusbild als auch eine Fluoreszenzangiographie gemacht worden, anschließend die Augen enukleiert und für die histologischen Untersuchungen aufgearbeitet worden. In die Bulbi wurde zunächst eine Fixierlösung nach Karnovski [83] injiziert und danach der gesamte Bulbus darin für 30 Minuten fixiert. Anschließend wurden die Bulbi limbusparallel an der Pars Plana eröffnet, der Glaskörper entfernt und weitere 30 Minuten fixiert. Zwei Tage wurden sie in einer 4 % igen Glutaraldehydlösung immersionsfixiert und anschließend in 0.2 M Kakodylatpuffer gespült. Nach mehrmaligen Waschen konnte das Gewebe in 1 % iger Osmiumtetroxydlösung in 1 % igem Kakodylatpuffer über Nacht nachfixiert und anschließend mit Kakodylatgepuffer gespült werden. Nach Entwässerung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und Propylenoxid inkubierten die Proben in Araldidpropylenoxid 1:1 über Nacht. Nach weiterem 2 stündigen Bad in Araldid wurden die Proben in Formen ausgegossen, orientiert und drei Tage lang bei 59 C polymerisiert. Es wurden Semidünnschnitte mit Glasmessern an einem Leica Ultramikrotom mit einer Dicke von

59 Kapitel 5: Material und Methoden µm angefertigt und anschließend mit Toluidinblau gefärbt. Dadurch werden alle Strukturen angefärbt, die als basophil und osmiophil bekannt sind. Neutralfett färbt sich im osmierten Material grünlich, als metachromatisch bekannte Strukturen rotviolett [83]. 5.9 Patientenbehandlungen Die Behandlungen am Medizinischen Laserzentrum Lübeck wurden in Kooperation mit Herrn Dr. Ch. Wirbelauer, Frau Dr. E. Joachimmeyer, Herrn Dr. H. Elsner unter der Koordination von Herrn Dr. H. Hoerauf von der Klinik für Augenheilkunde der medizinischen Universität zu Lübeck durchgeführt. In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. J. Roider und Herrn Dr. C. Framme von der Augenklinik der Universität Regensburg wurden Patienten auch dort behandelt. Die Ethikanträge für diese Studien wurden von den Ethikkomissionen der medizinischen Universität zu Lübeck und der Universität Regensburg genehmigt. Die Patienten wurden aufgeklärt und willigten für die Behandlung ein. Wie in Kapitel 2.4 dargelegt, wurden die drei Krankheitsbilder, diabetischen Makulopathie (DMP), Retinopathia centralis serosa (RCS) und die Drusenmakulopathie behandelt. Am Medizinischen Laserzentrum Lübeck wurden 70 Patientenbehandlungen mit dem frequenzverdoppeltem Nd:YLF Laser (1.7 µs, Kap ) mit den Parametern 500 Hz und 100 Pulse als auch 100 Hz und 30 Pulse mit µj Pulsenergie durchgeführt. Da die Laserfaser durch die Spaltlampe abgebildet wurde ergab sich durch die Verwendung des Haag-Streit Kontaktglases mit der Vergrößerung von 1.1 ein retinaler Spotdurchmesser von 176 µm. Es wurde jeweils die Änderung der Autofluoreszenz (Kap. 6.6) als auch die optoakustischen Transienten (Kap. 6.7) gemessen und analysiert. Bei 100 Hz Wiederholrate wurden auch spektral aufgelöste AF-Messungen mit einem angekoppeltem OMA durchgeführt (Kap ). Bei jeder Behandlung wurden zuerst am unteren Gefäßbogen des Auges Probeläsionen gesetzt. Dabei wurde mit 50 µj Pulsenergie begonnen und die Energie ab 70 µj in 10 µj - Schritten erhöht bis ein Effekt mit der optoakustischen On-line Dosimetrie (Kap. 6.7) nachweisbar war. Mit dieser Schwellenenergie wurde dann begonnen Zentral zu behandeln. Während der Behandlung mußte noch je nach Areal die Energie um bis zu 20 µj variiert werden. Dabei wurde auf die Ergebnisse der optoakustische On-line Dosimetrie (Kap. 6.7) zurückgegriffen. Nach den Behandlungen wurden Fluoreszenzangiographien und teilweise ICG-Angiographien des behandelten Auges aufgenommen um die Schädigung des RPE nachzuweisen und zu dokumentieren. An der Augenklinik Regensburg wurden 50 Patienten mit dem klinischen Nd:YAG Prototypen (800 ns, Kap ) der Firma Zeiss mit den Parametern 500 Hz und 100 Pulse als auch 120 Hz und 30 Pulse mit µj Pulsenergie behandelt. Der retinale Spotdurchmesser war 200 µm. Bei jeder Behandlung wurden zuerst am unteren Gefäßbogen des Auges Probeläsionen gesetzt und anschließend eine Fluoreszenzangiographie durchgeführt. Mit der dabei bestimmten Schwellenenergie wurde anschließend behandelt.

60 58 Kapitel 5: Material und Methoden Danach wurden Fluoreszenzangiographien und ICG-Angiographien des behandelten Auges aufgenommen um die Behandlung zu dokumentieren. Bei 5 Patienten wurden die bei der Behandlung entstehenden optoakustischen Transienten gemessen Temperaturbestimmung mit optoakustischen Methoden Während der Bestrahlung mit Laserlicht bei den verschiedenen Therapieformen der Ophthalmologie kommt es immer zu einer Erwärmung des bestrahlten Gewebes durch Absorption des Lichtes und der Umwandlung in Wärme. Da gerade an der Retina mit ihren Photorezeptoren eine thermische Schädigung durch eine Bestrahlung in vertretbaren Grenzen bleiben sollte, ist die laserinduzierte Temperaturerhöhung ein kritischer Faktor. In den meisten Fällen werden die induzierten Temperaturen über Berechnungen abgeschätzt. Zur Verifizierung der Berechnungen wurden Temperaturmessungen der Retina während der cw-koagulation mit invasiven Verfahren durchgeführt. Dabei wurde einerseits ein Mikro-Thermoelement nahe der Retina plaziert [42]. Damit konnte mit guter thermischer und zeitlicher Auflösung gemessen werden. Diese Methode ist durch ihren höchst invasiven Charakter nur in Tierversuchen durchführbar. Andererseits konnte mit einem fluoreszierenden temperaturempfindlichen Liposome-Dye ebenfalls Temperaturerhöhungen an der Retina gemessen werden [84]. Diese Methode erlaubt keine zeitliche, dafür aber eine räumliche Temperaturauflösung des bestrahlten Areals. Die Temperaturauflösung ist deutlich geringer als bei [42] und der Messbereich ist auf ein Detektionslimit des Dyes von 42 C bis 65 C beschränkt. Diese Methode wurde bisher nur in Tierversuchen verifiziert, ist aber durch den weit weniger invasiven Charakter auch am Menschen vorstellbar. Ebenfalls wäre eine Temperaturmessung mittels Ultraschall durchführbar [85, 86]. Dabei wird die Temperaturabhängigkeit der Schallgeschwindigkeit ausgenützt. Dies führt zu einer Laufzeitverschiebung der unterhalb des erwärmten Bereichs liegenden Gewebestrukturen. Durch zurückrechnen auf das Ausgangsbild läßt sich damit die Temperaturerhöhung nachweisen. Diese Methode wird bereits zum Monitoring bei der LITT (Laser Induced Thermo Therapy) eingesetzt [85, 86]. Die an der Retina benötigte Ortsauflösung von mindestens 100 µm würde Schallfrequenzen von ca. 40 MHz zur Folge haben. Aufgrund der hohen Schallabsorption von Wasser und okularen Medien in diesem Frequenzbereich ist eine Transmission des Schallwelle durch die dicke des Augapfels von 25 mm nicht realisierbar. Eine reale Umsetzung erscheint aus physikalischen Gründen schwierig. Mit einem auf optoakustischen Methoden basierenden System zur nichtinvasiven Temperaturbestimmung konnte die Temperaturverteilung während der LITT gemessen werden [87, 88, 89]. Es konnte eine gute Übereinstimmung der räumlichen und zeitlichen Verteilung der Temperaturen mit Thermoelementen nachgewiesen werden. Zur Erzeugung der optoakustischen Transiente wurden mehrere Joule Pulsenergie verwendet, was für eine Anwendung im Auge nicht tragbar ist. Da das RPE mit seiner Absorptionsdicke von ca. 10 µm eine viel effektivere Umsetzung der Laserenergie in Schallwellen zuläßt, sollte am

61 Kapitel 5: Material und Methoden 59 Auge eine niedriger Pulsenergie zur Temperaturbestimmung ausreichen. Es soll im Folgenden die Entwicklung der Methode zur optoakustischen Temperaturbestimmung dargestellt werden Grundlagen zur OA-Temperaturbestimmung Wie in Anhang A: Thermoelastische Druckentstehung gezeigt, kann für die gegebenen Behandlungsparameter am Auge der maximale Druck der optoakustischen Transiente mit Gleichung (84) abgeschätzt werden. Dabei wird von einer homogen absorbierenden Schicht ausgegangen, deren laterale Ausdehnung groß gegenüber der Schichtdicke ist [65]. Dies ist bei der SRT erfüllt, da der retinale Spotdurchmesser von 176 µm (Kap. 5.9) groß gegenüber der Schichtdicke des RPE von 10 µm ist. Weitere Randbedingung ist kein akustischer aber ein thermischer Einschluß [65]. Für das 10 µm dicke RPE ergibt sich eine akustische Transitzeit von 6.6 ns, was deutlich kürzer der verwendeten 1.7 µs Laserpulse ist. Die thermische Relaxationszeit einer 10 µm dicken Sicht ist mit über 100 µs [92] deutlich länger als die verwendete Laserpulszeit. Führt man den aus Gleichung (68) definierten Grüneisenparameter ein, so erhält man für minimale Variationen der Laserspitzenintensität I 0 : P max Γ I 0 = ---- c 0 (10) Das Druckmaximum ist also direkt proportional zum Grüneisenparameter. Dieser Parameter ist temperaturabhängig. Die Abhängigkeit ist für Wasser bis in den metastabilen Zustand bis 300 C bekannt [95]. Im Bereich von C kann diese Funktion noch als linear angesehen werden (Abb. 5.27). Da auch das Gewebe in Durchschnitt zu % aus Wasser besteht [96], kann auch hierfür eine Linearität angenommen werden. Dies ist für die hier verwendete absorbierende Struktur, das RPE, mit Messungen zu zeigen.

62 60 Kapitel 5: Material und Methoden 0.4 Grüneisenkoeffizient [1/m] Temperatur [ C] Abbildung 5.27 :Grüneisenkoefizient für Wasser im Bereich C ; nach [95]. In diesem Temperaturbereich kann der Grüneisenkoeffizient in Näherung als linear angenommen werden. Im Temperaturbereich von 0 C bis 80 C ist der thermische Expansionskoeffizient die Größe die den Grüneisenparameter am stärksten ändert [65]. Die Wärmekapazität ändert ihren Wert nur um 1 % in diesem Bereich. Daraus folgt: P max ( T) ΓT ( ) I 0 (11) Aufgrund der angenommen Linearität von Γ( T) mit der Temperatur folgt, dass das Druckmaximum linear zur Temperatur ist. Durch eine lineare Approximation erhält man: P max ( T) = I ( T T RPE ) B 0 (12) Es ergibt sich noch eine Verschiebung um T RPE, der Temperatur, bei der Γ( T) = 0 ist. Bei dieser Temperatur wird bei infinitesimaler Erwärmung keine optoakustische Transiente gebildet. Bei Wasser ist diese Temperatur T H2 O = 4 C. Sie stellt bei infinitisimaler Erwärmung den Achsenschnittpunkt für den P = 0 bei der Auftragung Druckamplitude über Probentemperatur dar. Dies ist Beispielhaft aus der Arbeit von Sigrist [65] für eine Messung an Wasser in Abb dargestellt.

63 Kapitel 5: Material und Methoden 61 Abbildung 5.28 :Maximaldruck der thermoelastischen Transiente über der Wassertemperatur. (CO2-Laser (9P(20)), 90 ns, Wasser) aus [65]. Um 4 C kommt es bei Erwärmung durch den Laserpuls zu einer Druckamplitudenumkehr. Im experimentellen Fall, bei dem zur Druckgenerierung immer erwärmt wird, zeigt sich ein Vorzeichenumkehr der Druckamplitude [65]. T RPE ist eine gewebespezifische Materialkonstante und muß durch Messungen für RPE bestimmt werden. Der Wert B 0 hat die Funktion einer Normierungskonstante des Druckes. Diese enthält die experimentell wichtigen Werte wie Wandlerempfindlichkeit, Signalverstärkung und die Amplitude der akustischen Übertagungsfunktion. Für jede Messung, bei der die akustische Übertagungsfunktion unbekannt ist, muß diese Konstante experimentell bestimmt werden, z.b. durch einen Probepuls. Bei bekannter Probentemperatur T 0, welche bei 0 Patientenbehandlung ist die Körpertemperatur, und gemessenem P max des Probepulses wird der Normierungswert durch B 0 ( T 0 T RPE ) I 0 B 0 = P max (13) bestimmt. Dieser Wert für B 0 kann verwendet werden, solange sich die akustische Übertragungsfunktion nicht ändert. Dies ist im Fall kurzer Bestrahlungszeiten bis zu 300 ms gegeben, da in diesem Zeitraum nur minimale Augenbewegungen möglich sind.

64 62 Kapitel 5: Material und Methoden Die absolute Temperatur des Absorbermediums T i beim i-ten Laserpuls ist nach Gl. (12) gegeben durch: i T i B ( P max ) T 0 P max = RPE I 0 (14) Wichtig für die Anwendung bei der Patientenbehandlung ist, dass es für eine Temperaturbestimmung hinreichend ist, die thermisch induzierten relativen Druckänderungen zu bestimmen. Es muß keine absolute Druckmessung gegeben sein, wenn der Wert B 0 vor der Temperaturmessung bei gegebenen durch z. B. einen Probepuls bestimmt wird. T 0 Das Meßprinzip ist in Abb graphisch dargestellt. Bei bekanntem T RPE und bekannter Probenstarttemperatur T 0 wird mit dem ersten Probepuls das Druckmaximum P max 0 0 erzeugt und gemessen. Somit sind die Punkte A 0 (, T 0 P max ) und A 1 (,0), T RPE durch die i die Gerade festgelegt wird, gegeben. Für alle folgenden Druckwerte P max die bei gleicher Pulsenergie appliziert werden kann der korrespondierende Temperaturwert T i bestimmt werden. Daraus ist auch ersichtlich, dass bei bekannter Probenstarttemperatur T0 und Materialkonstante T RPE absolute Druckmessung zur Temperaturbestimmung nicht nötig sind. Aus Abb ist auch ersichtlich, dass bei einer nichtlinearen Abhängigkeit der Druckamplitude von der Temperatur eine genaue Temperaturbestimmung nicht unbedingt äquivalent möglich ist. Eventuell kann man mit einem Probepuls nicht den weiteren Verlauf der Funktion erfassen. Dies ist aber genau für eine Temperaturmessung nötig. Die Datenauswertung wurde unter LabView [75] programmiert und liefert in Echtzeit den Temperaturverlauf.

65 Kapitel 5: Material und Methoden 63 Druck P i max P 0 max A 0 A 1 T RPE T 0 Abbildung 5.29 :Meßprinzip der optoakustischen Temperaturmessung. Ti Temperatur Bestimmung der Materialkonstante für RPE Zur Bestimmung der Materialkonstante T RPE wird bei konstanter gepulster Bestrahlung das Druckmaximum für verschiedene Schweine-RPE-Probentemperaturen gemessen. Dafür wird der in Abb skizzierte Aufbau verwendet. Die Schweine-RPE Proben werden wie in Kap beschrieben präpariert. Es wird 45 C warme physiologische Kochsalzlösung in die Probenküvette gefüllt. Während des Abkühlens wird die Probe mit konstanten Nd:YLF Laserpulsen (50 mj/cm², 250 ns, rep. rate 1 Hz) bestrahlt. Die emittierten Transienten werden mit dem Schallwandler empfangen und mit einem PC gespeichert. Zur Bestimmung der Druckamplitude wird ein Peakfind-Algorithmus von LabView verwendet [75]. Er basiert auf einem Algorithmus, der ein quadratisches Polynom an sequentielle Datenwertgruppen anpaßt. Die Temperatur der RPE-Probe wird durch ein Thermoelement Typ J, welches direkt neben dem Bestrahlungsort plaziert wird, bestimmt. Es waren nur Messungen bis 45 C möglich, da sich oberhalb dieser Temperatur eine optische Änderung der RPE-Probe durch thermische Denaturierung ergab Umsetzung bei selektiver RPE Behandlung Durch die Verwendung von repetitiver Laserbestrahlung kommt es bei hohen Wiederholraten und großen Bestrahlungsdurchmessern zu einer Adaption der einzelnen Temperaturerhöhungen des RPE. Es bildet sich, ähnlich wie bei der cw Bestrahlung eine Grundtemperatur aus, die durch Wärmediffusion auch die Photorezeptoren schädigen kann. In Abb ist schematisch die Grundtemperatur dargestellt. Durch die langen

66 64 Kapitel 5: Material und Methoden Bestrahlungszeiten eines Laserpulszuges von ms diffundiert die Wärme ebenfalls in die Schicht der Photorezeptoren und kann durch eine mögliche thermische Schädigung die Selektivität der Behandlung negativ beeinflussen. Temperatur RPE Temperaturspitze Temperatur Photorezeptor Temperatur [a.u.] Grundtemperatur Zeit [ms] Zeit [ms] Abbildung 5.30 :Temperaturverlauf bei repetitiver Bestrahlung (500Hz) mit Ausbildung einer Grundtemperatur. Diese ist aufgrund der langen Zeitkonstanten in der Schicht der Photorezeptoren ebenfalls stark ausgebildet. Im Falle der selektiven RPE Behandlung können die bei der Bestrahlung mit den Behandlungslaserpulsen entstehenden thermoelastischen Transienten zur Bestimmung der Grundtemperaturerhöhung verwendet werden. Dabei wird der notwendige Normierungswert B 0 0 für jeden Bestrahlungsort mit der Druckamplitude P max des ersten Behandlungspulses und der Körpertemperatur als T 0 nach Gleichung (13) bestimmt. Mit den i folgenden Laserpulsen werden aus den jeweiligen Durckamplituden Pmax mit dem bestimmten Normierungswert B 0 aus Gleichung (14) die jeweilige Temperaturerhöhung bestimmt. T i Es ist wichtig zu beachten, dass nicht die Temperaturspitzen gemessen werden die mit dem Laserpuls im RPE erzeugt werden. Durch die vorgenommene Normierung der ersten 0 Druckamplitude P max auf die Probenstarttemperatur, beim Menschen die Körpertemperatur, wird aus den folgenden relativen Druckamplitudenänderungen nur die Temperaturänderungen relativ zu dieser Probenstarttemperatur bestimmt. Da es bei Patientenbehandlungen nur möglich ist relative Drücke zu messen kann nur aus der Änderung der relativen Druckamplituden die nur Grundtemperaturerhöhung bestimmt werden. Die Bestimmung der Temperaturspitzen ist nur mit einer absoluten Druckmessung möglich.

67 Kapitel 5: Material und Methoden Modellrechnungen Wärmeleitung lichtabsorbierender Strukturen Um die Temperaturverteilung lichtabsorbierender Strukturen beschreiben zu können muß die räumlich und zeitliche Entwicklung Temperatur T( r, t) beschrieben werden. Sie kann als Lösung der Wärmeleitungsgleichung (54) beschrieben werden. Dabei ist t die zeitliche, und r die räumliche Koordinate, ρ die Dichte, C P die spezifische Wärmekapazität und k die Diffusifität des Mediums. Da durch die Lichtabsorption Wärme hinzugeführt wird, muß Gl. (54) um einen Quellterm q( r, t) erweitert werden. Dieser Quellterm q( r, t) entspricht der durch die Laserstrahlung extern zugeführten Wärmeenergiedichte pro Zeiteinheit. Man erhält: T( r, t) ρc P k T( r, t) = q( r, t) t (15) Zur Lösung der inhomogener Wärmeleitungsgleichung homogener Medien für einen komplizierten Quelltern kann das Superpositionsprinzip angewendet werden. Es erlaubt somit die Aufspaltung des Quellterms in einzelne separate Berechnungen. Die Lösung ergibt sich aus des Summe der Einzelergebnisse. Der Green-Funktionen-Formalismus gestattet die Rückführung der inhomogenen Wärmeleitungsgleichung für einen allgemeinen Quellterm auf die Lösung für einen Quellterm, der in Ort und Zeit durch die Dirac-Funktion δ( r r' ) δt ( t' ) gegeben ist. Die Lösung von Gl. (15) mit diesem Quellterms ergibt mit den Randbedingungen lim g( r, t, r' t',) = 0 ( r r' ) t t' lim g( r, t, r' t',) = 0 r (16) (17) die Green-Funktion g( r, t, r' t',) = ρC p [ πkt ( t' )] 3 2 exp 2 r r' k( t t' ). (18) Damit läßt sich die Lösung von Gl. (15) für beliebige Quellterme der Green-Funktion berechnen. q( r, t) als Faltung mit t T( r, t) = dt' dr'g( r, t, r' t',)q( r', t' ) 0 (19)

68 66 Kapitel 5: Material und Methoden Punktquelle Eine besonders einfache Geometrie mit der sich die laserinduzierte Erwärmung granulärer Strukturen beschreiben lassen ist die instantane Punktwärmequelle [112]. Sie ergibt sich direkt aus Gl. (18) und erzeugt eine Temperaturverteilung nach T( r, t) = q ρC p ( πkt) 2 3 exp r kt (20) homogene Kugel Eine weiter, noch analytisch lösbare Geometrie die zur laserinduzierten Erwärmung granulärer Strukturen verwendet werden kann ist die homogen erwärmte Kugelgeometrie mit unterschiedlichen thermischen Eigenschaften. Bei inhomogenen Medien, mit unterschiedlichen thermischen Materialeigenschaften im betrachteten Volumen ist das Superpositionsprinzip für die Raumkoordinaten nicht mehr gültig. Der Green-Formalismus kann aber weiterhin für die zeitliche Temperaturentwicklung angewendet werden. Goldenberg löste die Kugelwärmequelle unter den folgenden Randbedingungen [56]. T 1 = T 2 = 0, für t = 0 für alle r (21) T 1 = T 2, für r = R für alle t (22) δt δt 2 K1 = δr δr K2, für r = R für alle t (23) wobei T die Temperaturen des umgebenden Mediums (2) und der Kugel (1), K die Wärmeleitfähigkeit und R der Radius der Kugelgeometrie ist. Die Temperatur außerhalb der Kugel (r > R) ist gegeben durch [56]: T 2 () r = AR rk 1 K 1 2F K 2 π (24) F 2 = 0 ν t exp a2 ( sinν νcosν) [ bνsinνcosσν ( gsinν νcosν) sin σν] [( gsinν νcosν) 2 + b 2 ν 2 sin 2 dν ν] ν 3 (25)

69 Kapitel 5: Material und Methoden 67 R 2 κ 1 K 1 wobei: a = ; b = ; g = ; σ K 2 κ 1 κ 2 K 2 K 1 r = R r der Abstand vom Kugelmittelpunkt und ν die Integrationvariable ist. A ist die Heizrate des im Volumen absorbierten Lichtes. Innerhalb der Kugel (r < R) ergibt sich κ κ 2 T 1 () r = AR K 1 K 1 1 r 2 2R F 3K 2 6 rπ 1 R 2 (26) F 1 = 0 ν t exp a2 ( sinν νcosν) sin( rν R) ν [( gsinν νcosν) 2 + b 2 ν 2 sin 2 dν ν] (27) Die homogene Erwärmung kann jedoch nur in so fern übertragen werden, wenn die Absorptionseigenschaften und die thermischen Eigenschaften der Kugel eine homogene Wärmeentstehung zulassen. rechteckige Schicht Der Übergang von einer absorbierenden granulären Schicht zu einer homogen absorbierenden Schicht kann in vielen Fällen, bei denen das einzelne Granulum keine entscheidende Eigenschaften als Punkt oder Kugelquelle mehr besitzt, eine signifikante Reduzierung des Rechenaufwandes bedeuten, da keine einzelnen Superpositionierungen durchgeführt werden müssen. Das infinite Medium in der Umgebung der absorbierenden Schicht sei optisch transparent und besitze homogene thermischen Eigenschaften. Für die absorbierende Schicht werden die selben thermischen Eigenschaften wie das umgebende Medium angenommen. Die Absorption des Laserstrahls in der Schicht wird durch das Lambert-Beer-Gesetz beschrieben. Die Dicke der absorbierenden Schicht in Einfallsrichtung des Laserstrahls wird mit h bezeichnet und muß von der Dimension her größer der lateralen Ausdehnung des mit dem Laser bestrahlten Rechtecks mit der Kantenlänge 2 e und 2 f sein ( h«e, h«f ). Der Quellterm q( r', t' ) wird in in die räumliche und zeitliche Funktion aufgeteilt. q( r', t' ) = q( r' ) qt' ( ) (28)

70 68 Kapitel 5: Material und Methoden Der räumliche Quellterm wird durch die Absorption im rechteckigen Bereich der Laserbestrahlung durch das Lambert-Beer-Gesetz mit dem Absorptionskoeffizien α beschrieben durch: q( r' ) = αi 0 Ψ( e x' ) Ψf ( y' ) exp( αz' ) 0 z' h q( r' ) = 0 ; sonst (29) (30) wobei die räumlich limittierende Stufenfunktion Ψξ ( ) 1 ξ > 0 = 1 2 ξ= 0 0 ( ξ < 0) (31) ist. Nach einsetzten in Gl. (19) und räumlicher Integration erhält man nach Freund [98]: T( r, t) = αi t Ψ( t t' ) erf 8ρC p 0 e + x erf 2 kt' x e kt' (32) erf f + x erf 2 kt' x f kt' Zzt' (,, h α, k, ) wobei Zzt' (,, h α, k, ) ( αz ) ( kt'α 2 =exp exp ) erf z α kt' erf 2 kt' z h α kt' 2 kt' (33) Das zeitliche Integral in Gl. (32) entspricht einer Faltung der räumlichen Integration mit der Laserpulsform Ψ( t' ). numerische Lösungen Alle hier vorgestellten Ergebnisse wurden in eine Softwarebibliothek für das Mathematik-Softwarepaket Mathematica [97] von Herrn Dr. G. Hüttmann vom Medizinisches Laserzentrum Lübeck umgesetzt. Dabei werden die nötigen Integrationen mit numerischen Methoden gelöst. Da bei den Berechnungen hauptsächlich Gewebestrukturen betrachtet werden, die bis zu 80 % aus Wasser bestehen [96], wurde für alle Medien die thermischen Eigenschaften für Wasser angenommen. Bei den Temperaturberechnungen von Melanosomen wurden ebenfalls die thermischen Eigenschaften von Wasser angenommen. Dadurch ist das raum-zeitliche Superpositionsprinzip nicht verletzt und kann angewendet werden.

71 Kapitel 5: Material und Methoden Temperatur- und thermische Denaturierungsberechnungen im µs bis ms-zeitbereich Für thermische, als auch für thermomechanische Schäden, ist die laserinduzierte Temperaturänderung im Gewebe von entscheidender Bedeutung. Bei einer rein thermischen Denaturierung hängt das Ausmaß des thermischen Schadens dabei direkt von der freien Energie im geschädigten Volumen ab. Dadurch ist auch eine Additivität der Schäden bei Mehrfachpulsen gegeben. Bei der Denaturierung als Reaktion erster Ordnung führt das Arrheniusintegral zu einem Maß für den thermischen Schädigungszustand [13]. t Ω() t A 0 e E g κt() t = dt 0 (34) wobei E a κ =Aktivierungsenergie, (Unterschied der inneren Energie zwischen dem aktiviertem Zustand und dem Anfangszustand) = Bolzmannkonstante ist und der Frequenzfaktor A 0 durch A 0 = RT e e N A h S R G (35) gegeben ist, wobei: R G N A h T S = Gaskonstante = Avogadro Konstante = Plancksches Wirkundquantum = Temperatur = Aktivierungsentropie Die Temperaturabhängigkeit des Frequenzfaktors kann gegenüber der starken Abhängigkeit von kt() t in Gl. (34) vernachlässigt werden. e E g Mit dem hier beschriebenen Modell werden die Temperaturverläufe und Arrheniusintegrale bei verschiedenen relevanten Aufpunkten in einem Melanosomenfeld mit den in vitro Versuchen gemessen Schwellenbestrahlungen berechnet.

72 70 Kapitel 5: Material und Methoden Zur Berechnung wurden drei Lagen kugelförmiger Melaninpartikel im Abstand von 1.5 µm auf einem regelmäßigen Gitter angeordnet (Abb. 3.1). Im inneren Bereich wurden 61 Kugelwärmequellen (nach Gl.(24) und Gl. (26)) mit Durchmesser 1 µm verwendet. Zur Reduzierung der Rechenzeit wurden im äußeren Bereich Punktwärmequellen (nach Gl. (20)) als Melanosomen verwendet. Der gesamte Bestrahlungsdurchmesser lag bei 50 µm. Die einzelnen Melanosomen absorbieren 53 %, was einem Absorptionskoeffitient von cm -1 entspricht, der in Experimenten an Schweine-RPE bestimmt wurde [12]. Die unteren beiden Melanosomenlagen erwärmen sich durch die Abschattung der oberen Lage entsprechend weniger stark. Die gesamte Schicht absorbiert 56 % der eingestrahlten Laserleistung was der Absorption von humanen RPE entspricht. Die Temperaturen wurden an verschiedenen Stellen, an der Oberfläche der Granula bis zum Abstand von 16 µm berechnet. Zur Berechnung der thermischen Schäden wurde mit diesen Temperaturverläufen das Schadensintegral nach Arrhenius berechnet. Für die Temperaturabhängigkeit der Schadensraten wurden die für ms Bestrahlungszeiten im Tiermodell gefundenen Parameter verwendet die sich aus der minimalen Sichtbarkeit der Läsionen im Kaninchenmodell ergaben [92]. Es sind der Frequenzfaktor A 0 = s 1 und die Aktivierungsenergie = 290kJ Mol. E a Abbildung 5.31 :Simuliertes dreilagiges Melanosomenfeld mit dem Durchmesser von 50 µm. Im inneren Bereich wurden Kugelwärmequellen mit Radius 0.5µm und im äußeren Bereich Punktwärmequellen als Melanosomen verwendet Berechnungen der Grundtemperaturerhöhung im RPE bei gepulster Bestrahlung Wie in Kapitel 5.10 beschrieben, läßt sich mit optoakustischen Methoden die Grundtemperaturänderung bei Bestrahlung am Auge bestimmen. Da die gemessen Druckamplitude von der gesamten bestrahlten Fläche emittiert wird, wird damit die über die Fläche räumlich gemittelte Temperaturerhöhung bestimmt. Zur Berechnung der Grundtemperaturerhöhung wurde Gleichung (32) verwendet, die eine homogen absorbierende rechteckige Schicht betrachtet die mit einem zeitlich rechteckigem Laserpuls bestrahlt wird [98] (Kap ).

73 Kapitel 5: Material und Methoden 71 Zur Bestimmung der räumlich mittleren Temperaturerhöhung wird über die Kreisfläche im Innern des Rechtecks gemittelt (Abb. 5.32). Für den Fall der repetierenden Bestrahlung wird die Grundtemperatur des n-ten Laserpulses zur Zeit ( n τrep) durch die Aufsummierung der vorherigen Grundtemperaturen gegeben durch: Trep( n) = n i = 1 A T( r, ( i τ rep )) df π( d 2) 2 (36) wobei: τ rep =1/ Laserwiederholrate, d = Spotdurchmesser, Mit dieser Gleichung werden die Bestrahlungssituationen mit den verwendeten Spotdurchmessern, Bestrahlung und Laserwiederholrate berechnet. I 0 τ l Zeit h d Abbildung 5.32 :Prinzipskizze der Bestrahlungs- und Laserpulsgeometrie für die verwendete Lösung der Wärmediffusionsgleichung nach Freund [98]. Zur Berechnung der mittleren Temperatur wird über die Kreisfläche mit Durchmesser d gemittelt.

74 72 Kapitel 5: Material und Methoden

75 Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion 73 6 Ergebnisse und Diskussion 6.1 Spekle-Werte der Lasersysteme Die Ergebnisse der Spekle-Faktoren sind über 20 Messungen gemittelt in Tabelle 3 zusammengefaßt dargestellt. Laser Faserdurch -messer [µm] NA Faserlänge [m] Spekle-Faktor F Kontrast K Spekle-Durch messer[µm] Nd:YLF ± ± Nd:YLF 160/ /0.1 1 / ± ± Argon ± ± Argon ± ± exp. Nd:YAG klin. Nd:YAG ± ± 0.01 n.a ± ± Tabelle 3: Spekle-Werte nach Fasertransmission für die verwendeten Lasersysteme. Es zeigt sich, dass zur effektiven Reduzierung des Spekle-Faktors für alle Lasersysteme eine lange Faser notwendig ist. Dabei haben die im Q-switch mode betriebenen Laser Nd:YAG und Nd:YLF mit einer 50 m langen Faser die niedrigsten Spekle-Faktoren. Deren Werte liegen schon nahe dem Wert für ein ideales tophat Profil F tophat = 1. Die Kohärenzlänge der Laser ist durch ihren gepulsten Betrieb beschränkt. Bei kürzer Faser (1 m, NA = 0.1) erhöht sich beim Nd:YLF schon der Spekle-Faktor um 37 %. Jedoch hat der cw-argonlaser mit seiner längeren Kohärenzlänge bei gleicher Faser (1 m, NA = 0.1) einen deutlich erhöhten Spekle-Faktor um den Faktor 2. Aufgrund der geringen Intensitätsmodulation nach Fasertransmission bei dem experimentellen Nd:YAG-Laser konnte keine Spekle-Größe bestimmt werden. Mit den jeweiligen Spekle-Faktoren F laser wurden die bei den Schadenschwellen laser laser bestimmte Bestrahlung H mean auf deren maximale Bestrahlung H max mittels Gleichung (5) korrigiert. Aufgrund der Wärmeleitung wird erwartet, dass es gerade bei langen Laserpulsen zu einer effektiven Verringerung der Temperatur der Melanosomen kommt, die durch die Speklebildung ungleichmäßig aufgeheizt wurden. Es wurde für den maximal gemessenen

76 74 Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion Spekle-Faktor von 3.8 des Argonlasers (50 µm Kern, NA 0.1, 2 m) die Temperaturverteilung zwei nebeneinander liegender Melanosomen nach Gl.(24) und Gl. (26) exemplarisch berechnet. Dabei wurden die Melanosomen, wie in Kap beschrieben, als kugelförmige Wärmequellen mit dem Durchmesser von 1 µm und dem Abstand 2.5 µm mit homogener Wärmeproduktion angenommen. Als Abstand der beiden Melanosomen wurde der durchschnittlich größte gemessen Spekle-Radius (halber Durchmesser) aus Tab 3 verwendet, da dies das gegebene Ausmaß der Bestrahlungsunterschiede mit dem längsten Wärmediffusionsausgleich ist, unabhängig von der Melanosomendichte. Einem Melanosom wurde die 3.8-fache Energie des anderen im gleichen Zeitraum zugeführt. Die Berechnungen wurden für 8 ns, 200 ns, 1.7 µs, 5 µs und 3 ms Pulsdauer durchgeführt. In Abb. 6.1 sind die Temperaturverteilungen am Ende des jeweiligen Laserpulses auf die maximale Temperatur normiert dargestellt. Wertet man die berechneten Temperaturunterschiede der Melanosomenoberfläche relativ zueinander aus, so zeigt sich, dass bei den kurzen Pulslängen 8 ns bis 1.7 µs der Spekle-Faktor auch direkt in der Temperaturverteilung gegeben ist. Bei 5 µs Pulslänge ist Temperatur der nebeneinander liegenden Wärmequellen aufgrund von Wärmediffusion gleichmäßiger verteilt. Die Temperaturdifferenzen an den beiden Melanosomenoberflächen haben sich bei 5 µs Pulslänge nur um den Faktor 3.4 erhöht. Dies ist eine Verringerung des Spekle-Faktors um 10 % zu einem effektiven Temperaturunterschied um Faktor 3.3. Erst bei 3 ms Pulsdauer kommt es zu einer effektiven Reduzierung des Spekle-Faktors durch Wärmediffusion. Für Pulslängen kürzer 1.7 µs wird der Einfluß der Wärmediffusion schon bei einer Spekle-Größe von 2.5 µm vernachlässigbar. normierte Temperatur ns - Faktor ns - Faktor µs - Faktor µs - Faktor ms - Faktor ms 5 µs 1.7µs 200 ns 8 ns Ort [µm] Abbildung 6.1 :Normierte Temperaturverteilung zweier Melanosomen mit Abstand 2.5 µm am Ende eines 8 ns, 200 ns, 1.7 µs, 5 µs und 3 ms Laserpulses. Die beiden Melanosomen wurden um den Faktor 3.8 unterschiedlicher Bestrahlung ausgesetzt. Der Abstand der Melanosomen entspricht dem mittleren kleinsten gemessenen Spekle-Größe.

77 Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion 75 Die Korrektur der Bestrahlungswerte mit den gemessenen Spekle-Faktoren ist bei Laserpulsen kleiner als 1.7 µs korrekt. Bei 5 µs Laserpulsen ist eine Korrektur der Bestrahlungswerte noch immer zulässig. Es kommt thermisch bedingt zu einer Verringerung des Spekle-Faktors um 10 %. 6.2 Empfindlichkeit der Schallwandler Die Kalibrierung wurde wie in Kap beschrieben durchgeführt. Für die Bestimmung der Wandlerempfindlichkeit wurde der erste positive Maximum des Drucksignals ausgewertet. In Abb. 6.2 sind einzelne mit dem kalibrierten Hydrophon gemessene Transienten bei verschiedenen Pulsenergien dargestellt. Mit Hilfe von Gl. (8) wurde unter Berücksichtigung der Verstärkungsfaktoren der Vorverstärker und den durch die Schallaufzeiten bestimmten Abständen r der Wandler von der Schallquelle die Empfindlichkeit in Bezug auf das kalibrierte Hydrophon errechnet. Die Daten sind über 10 Messungen gemittelt in Tabelle 4 zusammengefaßt Druck [bar] µJ 30µJ 40µJ 50µJ 60µJ 70µJ 80µJ 90µJ 100µJ 110µJ 120µJ 130µJ Zeit [µs] Abbildung 6.2 :Gemessene Transienten des kalibrierten Hydrophons bei verschiedenen applizierten Pulsenergien. Der erste positive Peak wurde zur Kalibrierung ausgewertet.. Die beiden verwendeten Wandler detektieren die Schallsignale hochempfindlich im Bereich einiger V / bar. Dazu muß auch beachtet werden, dass mit dieser Kalibrierung keinerlei Aussage über die spektrale Empfindlichkeit der Wandler gemacht werden kann,

78 76 Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion Modell Empfindlichkeit [mv/bar] Ceram, No.118 Herstellerangabe 15 Valpey-Fisher, VP ± 40 OA-Kontaktglas, Haag-Streit 5100 ± 700 Tabelle 4: Kalibrierungsdaten der verwendeten Schallwandler da mit einem Signal der Mittenfrequenz 0.5MHz angeregt wurde. Somit gibt diese Kalibrierung eher die Größenordnung der Empfindlichkeit richtig wieder, als exakte Werte. Dies ist bei der Beurteilung der späteren Daten immer zu berücksichtigen. 6.3 Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases Mit Hilfe des Programms ULTRASIM wurde die Empfangscharakteristik des OA-Kontaktglases in Abhängigkeit der möglichen Behandlungspositionen am Augenhintergrund untersucht. Dabei wurde, wie in Kap beschrieben, die aufgrund der geometrischen Verkippungen entstandene Änderung der Phasenflächen des akustischen Signals untersucht. In Vorversuchen zur Simulation wurde mit dem Breitbandhydrophon (Ceram, No. 118) die Mittenfrequenz der vom RPE emittierten optoakustischen Signale bei Bestrahlung mit 1.7 µs Laserpulsen (10-40 µj) mit dem Aufbau für optoakustische in vitro Messungen (Kap ) bestimmt. Gemittelt über die Ergebnisse von 12 Schweine-RPE Proben ergab sich eine Mittenfrequenz von 1 MHZ (Standardabweichung 120 khz). Umgesetzt auf die vorliegende Anwendung wurden 20 Punktquellen auf der Bestrahlungsfläche mit einem Durchmesser von 160 µm am Augenhintergrund gesetzt. Diese 20 Punktquellen wurden in verschiedene Aufpunkten (Abb. 5.14) im Auge zu der jeweiligen Verkippung der optischen Achse hin verschoben. Als Näherung der gemessenen optoakustischen Signale wurde ein spektral engerer Burst [ sin( t ) 2 t0π 2 2 ; [, ] ; sin( t) ; t[ π 2, π] ] (Abb. 6.3) mit der Mittenfrequenz 1 MHz für die Simulation verwendet. Die Punktschallquellen strahlen zum Zeitpunkt t = 0 eine Wellenlänge ab.

79 Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion 77 Frequenzleistung [a.u.] Druckamplitude [a.u.] 1,0 0,5 0,0-0,5-1,0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 Zeit [µs] 1E-6 1E-7 1E-8 1E-9 1E-10 1E-11 1E-12 0, Frequenz [MHz] Abbildung 6.3 :Angenäherte anregende Burst-Funktion mit 1 MHz Mittenfrequenz und dazugehöriges Frequenzleistungsspektrum. In der Wandlerebene aus Abb wird die Druckverteilung zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Hygenschen Prinzip errechnet. Dabei werden die Druckwerte über den ringförmigen Bereich (Abb. 6.4) der Wandlerfläche integriert. Abbildung 6.4 :Druckverteilung in der Wandlerebene zum Zeitpunkt 15.9 µs nach Abstrahlung der Schallwelle bei 10 Verkippung des Auges. Über die ringförmige Wandlerfläche wird das Schallsignal numerisch integriert. In Abb. 6.5 ist die Druckverteilung in der Wandlerebene zu verschiedenen Zeitpunkten bei einer Versetzung des Aufpunktes im Auge um 10 dargestellt. Man erkennt das dezentrale Auftreffen der Druckverteilung zum Zeitpunkt 15.9 µs.

80 78 Kapitel 6: Ergebnisse und Diskussion Abbildung 6.5 : Druckverteilung in der Wandlerebene zu verschiedenen Zeitpunkten bei Versetzung des Aufpunktes im Auge um 10. Man erkennt bereits im ersten Bild ein dezentrales Auftreffen der Druckverteilung. Über die ringförmige Wandlerfläche (Abb. 6.4) wird anschließend numerisch integriert. Es wurde für die bei der Behandlung mögliche Versetzungen des Aufpunktes im Auge die so detektierbare Schallwelle simuliert. In Abb. 6.6 sind die so ermittelten Transienten für einen Verkippungsbereich von 0 bis 40 dargestellt. Bei einer Behandlung würde 0 einer zentralen Makulabehandlung entsprechen und 40 der Probeläsionen außerhalb des Gefäßbogens. Bei 0 wird die höchste Amplitude und die zeitlich kürzeste Transiente erreicht, die schon um den Faktor 1.5 länger ist als die anregende Welle. Bei größeren Winkeln wird die Amplitude bis um den Faktor 2 kleiner und es kommt zu einer starken Verbreiterung der anregenden Welle um den Faktor 5, da durch Verkippung die Laufzeit der Schallwelle über die Wandlerfläche größer wird. Diese Veränderungen spiegeln sich auch im Frequenzraum wieder (Abb. 6.7). So ist das Frequenzmaximum der bei 0 Verkippung detektierten Welle von 1 MHz auf 0.6 MHz abgefallen. Bei einer Winkelverkippung nimmt der obere Frequenzbereich stark ab und im Frequenzbereich unter 1 MHz wird entsprechend der geringeren Amplituden das Spektrum niedriger. Das Frequenzmaximum bleibt bei ca. 0.6 MHz. Wandlersignal [a.u.] Grad 5 Grad 10 Grad 15 Grad Grad 30 Grad 40 Grad Zeit [µs] Abbildung 6.6 : Zu den verschiedenen geometrischen Versetzungen des Aufpunktes im Auge ermittelte Drucktransienten. Es kommt zu einem unterschiedlichen Beginn der Transiente als auch zu einer zeitlichen Verbreiterung.