Fraktionierung von Milch und Untersuchung einiger ihrer Komponenten

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1 Universität zu Köln Institut für Zoologie WS 2000/2001 Übungen für Fortgeschritte: Tierphysiologie B Fraktionierung von Milch und Untersuchung einiger ihrer Komponenten

2 1. Einleitung An diesem Praktikumstag haben wir uns mit der Säugermilch beschäftigt, wobei wir nur Kuhmilch untersucht haben. Da Säugermilch die einzige Nahrungsquelle für Neugeborene ist, kann man davon ausgehen, dass sie alle essentiellen Nährstoffe für die betreffende Art enthält. Somit kann man Rückschlüsse auf den Nährstoffbedarf dieser Art ziehen. Dafür wird die Milch in ihre Bestandteile fraktioniert. Dieses sind Proteine (hier vor allem das Kasein), Fette, Kohlenhydrate (v.a. Laktose), Mineralstoffe (v.a. Calcium) und Vitamine. 2. Material und Methoden Zu 1.3: Die Milchprobe wurde mit 2ml Milch und 2ml Wasser angesetzt. Ansonsten wurden die Versuche wie im Skript beschrieben durchgeführt. 3. Ergebnisse 1. Abtrennen der Kaseine (isoelektrischer Punkt) 1.0 Säurefällung Bei Erreichen eines ph-wertes von 4,6 ist eine Ausfällung des Caseins zu beobachten. 1.1 Labfällung: Tabelle 1: Geschwindigkeit der Labfällung ml Lab Zeit [s] Seite 2 von 2

3 1.3 Kontrollexperiment zur Labfällung Die Zusammensetzung der verwendeten Kontrollansätze wurden zur Verdeutlichung in einer Tabelle angetragen: Um herauszufinden, welches Ion eine Fällung der Milch auslösen kann Tabelle 2: Übersicht über die Ansätze zum Kontrollversuch Ansatz Nr Reagens Lablösung (gekocht) EDTA CaCl MgCl FeCl NaCl Fällung beobachtet? nein ja ja ja nein nein nein ja nein + Reagens zugesetzt, - Reagens nicht zugesetzt Seite 3 von 3

4 2. Charakterisierung des Milchproteins: Anhand der bekannten Aminosäuregemische konnten wir in der DC die einzelnen Banden gut zuordnen. Danach sind im Casein folgende Aminosäuren enthalten: His, Arg, Lys, Gly, Ser, Asp, Thr, Glu, Pro, Ala, Val, Met, Ile, Phe, Leu Dabei war die Bande von Alanin so schwach, dass hier eine endgültige Aussage nicht getroffen werden kann. Sowohl bei Valin und Methionin, wie auch bei Phenylalanin und Leucin haben sich die Banden so überlagert, dass eine eindeutige Identifizierung nicht möglich ist. Aus der Probe der Gelatine konnten wir folgende AS ermitteln: Thr, Hypro, Ala, Met / Val, Pro, Phe Dabei war die Identifizierung von Met und Val anhand der Banden nicht eindeutig möglich. Die im Mengenverhältnis bedeutendste Aminosäure in der Gelatine wäre nach unserer DC Threonin. Der Strukturformel nach sollte diese Position jedoch dem Glycin zukommen. Seite 4 von 4

5 3. Charakterisierung des Milchfettes 3.1 Jodzahl Die Jodzahl wurde mit Hilfe folgender Formel aus der Menge der zutitrierten Na 2 S 2 O 3 bestimmt: g Jod (10ml 0,1 n Na2 S 2O3 ) 0, Jodzahl = 100 g Fett g vorgegebenes Fett Tabelle 3: Ermittlung der Jodzahl ml Na 2 S 2 O 3 Jodzahl [g Jod/100g Fett] mol Jod/100g Fett Butter 6,3 42,68 0,34 6,4 41,53 0,33 Olivenöl 1,4 99,21 0,78 1,8 94,6 0,75 Leinöl 1,7 191,5 1,51 1,3 200,73 1,58 Beispielrechnung: 42,68 g Jod / 100 g Fett (Jodzahl) = 0,34 mol Jod/100g Fett 126,9 (Molekulargewicht) Seite 5 von 5

6 3.2 Verseifungszahl Die Verseifungszahl wurde mit Hilfe folgender Formel aus der Menge der zutitrierten HCl bestimmt: Tabelle 4: Ermittlung der Verseifungszahl ml HCl Verseifungszahl [mg KOH/g Fett] mittleres Molekulargewicht der Fettsäuren [g/mol] Butter 3, ,53 4,3 199,5 281,20 Olivenöl 5,5 157,5 356, ,71 Tributyrin , ,49 mg KOH Verseifungszahl g Fett Beispielrechnung: ( 10ml ml 0,5 n HCl) 28 = g vorgegebenes Fett ((10ml 3,8ml HCL) x 28) / 0,8g Fett = 217mg KOH / g Fett 217mg KOH/g Fett x 1/56100 mg/mol= 0,004mol KOH/g Fett=X 1/X = 258,53g/mol (mittleres Molekulargewicht der Fettsäuren) Mittlere Zahl der Doppelbindungen Da sich Jod nur an den Doppelbindungen anlagert, kann man die Jodzahl direkt zur Bestimmung der Zahl der Doppelbindungen heranziehen. Dabei gehen wir davon aus, dass 1 mol J 2 / 100g entspricht 1 mol Doppelbindungen. Tabelle 5: Doppelbindungszahl Jodzahl [g Jod/100g Fett] mol Jod/100g Fett mol Doppelbindungen / 100g Fett Butter 42,68 0,34 0,17 41,53 0,33 0,16 Olivenöl 99,21 0,78 0,39 94,6 0,75 0,37 Beispielrechnung: Seite 6 von 6

7 42,68 g Jod/100 g Fett = 21,34 g J 2 / 100 g Fett 21,34g J 2 /100 g Fett / 126,9 (Molekulargewicht) = 0,17 mol J 2 /100g Fett = 0,17 mol Doppelbindungen / 100g Fett 4. Calcium und Phosphatgehalt Calciumgehalt: Tabelle 6: Bestimmung des Calciumgehaltes Säuremolke Labmolke ml EDTA 7,5 3,2 ml EDTA 7,8 3,4 ml EDTA 7,9 3,8 Mittelwert 7,73 3,47 mmol EDTA 0,08 0,03 Die Menge des EDTA in mmol entspricht dem Ca 2+ -Gehalt in mmol / 5 ml Molke. Aus den Mittelwerten der jeweiligen Ergebnisse lässt sich der Ca 2+ -Gehalt in mmol / l Milch berechnen. Rechnung: (mmol Ca 2+ x ml Molke -1 ) x 2000 da 5ml Molke 2,5ml Milch entsprechen. Aus diesen Ergebnissen lässt sich mit Hilfe des Molekulargewichts von Calcium (40,08 g / mol) die Menge an Calcium-Ionen in 100 ml Milch berechnen. Seite 7 von 7

8 Tabelle 7: Umrechnung: Calcium in Milch Säuremolke Labmolke mmol Ca2+/l Milch 30,93 13,87 mg/100 ml Milch 123,98 55,58 Beispielrechnung: 0,08mmol EDTA / 5 x 2000 = 30,93 mmol Ca 2+ /l Milch 30,93 mmol Ca 2+ /l Milch * 40,08(Molekulargewicht) /10 = 123,98 mg/100ml Milch Phosphatgehalt: Aus der Eichgerade wurde für unsere drei Proben der Säure-Schotte folgende Phosphat-Werte bestimmt: Tabelle 8: Bestimmung des Phosphatgehalts anhand der Eichgerade Probe Extinkti ml Phosphat mg Phosphat mg Phosphat / L on 1 0,1286 1,1 0,15 136,36 2 0,1482 1,25 0,17 136,0 3 0,1386 1,2 0,16 133,34 Umrechnungsfaktor: ~8,55 4. Diskussion 1.0 Säurefällung Bei einem ph von 4,6 konnte eine Ausfällung des Kaseins beobachtet werden. Bei diesem ph erreicht das Kasein seinen isoelektrischen Punkt. Die Nettoladung des gesamten Moleküls ist bei diesem ph also neutral, damit wird es wasserunlöslich und fällt aus. Der so ermittelte isoelektrische Punkt deckt sich mit dem entsprechenden ph aus der Literatur. 1.1 Labfällung Mit der Labfällung wird auf unterschiedlichem Wege auch eine Fällung des Kaseins ausgelöst. Lab sorgt dafür, dass Kasein-Micellen zerstört werden und das Kasein somit ausfällt (Es liegt normalerweise kolloidal gelöst in der Milch vor.) Nach Zugabe von 1ml der Lablösung erfolgte nach 210 Sekunden eine Fällung des Caseins. Bei einer zweiten Probe erfolgte nach Zugabe von 2 ml bereits nach 55 s eine Fällung, das entspricht Seite 8 von 8

9 etwa einem Viertel der Zeit. Es lässt sich also vermuten, dass bei größeren Gaben der Lablösung die Reaktionsgeschwindigkeit noch entsprechend gesteigert werden kann. 1.3 Kontrollexperiment Dieses Experiment diente zur Kontrolle und näheren Untersuchung der Labfällung. Zunächst stellten wir mit Probe 1 fest, ob die beobachtete Ausfällung tatsächlich vom Lab herrührt. Dies konnte bestätigt werden, da nach Abkochen und somit Denaturieren des Enzyms keine Fällung mehr beobachtet wurde. In Ansatz 2 5 wurden die in der Molke befindlichen Ca-Ionen durch EDTA gebunden. Wir konnten feststellen, dass unter diesen Bedingungen eine Fällung nur noch dann erfolgt, wenn ein 2- wertiges Ion zugegeben wird. Die Labfällung findet also unter natürlichen Bedingungen nur unter Vorhandensein von Ca ++ statt, dieses kann im Experiment aber erfolgreich gegen andere zweiwertige Ionen ausgetauscht werden. Die Ansätze 6 9 dienten als Kontrolle, ob die unter 2 4 zugesetzten Ionen nicht auch selbst eine Fällung des Kaseins auslösen können. Dies war beim FeCl 3 der Fall, da hier die negative Ladung groß genug war, um eine Absenkung des ph bis zum isoelektrischen Punkt des Kaseins hervorzurufen, hier fand also eine Säurefällung statt. 2. Charakterisierung des Milchproteins Die Auswertung der DC zeigte deutlich, daß im Casein fast alle essentiellen Aminosäuren enthalten sind. Die Verteilung der Aminosäuren scheint aufgrund der Färbung der Banden sehr gleichmäßig zu sein. Im Vergleich dazu war die Aminosäureverteilung bei der Gelatine sehr ungleichmäßig, es sind nur wenige Aminosäuren vorhanden. Es handelt sich daher bei der Gelatine um ein ernährungsphysiologisch niederwertiges Protein. Die nach unserem DC-Ergebnis häufigste Aminosäure in der Gelatine ist das Threonin. Nach der Strukturformel sollte jedoch Glycin mit einem Anteil von etwa einem Drittel am häufigsten vorkommen. Ursache für dieses Ergebnis könnte ein Vertauschen der angegebenen Laufreihenfolge im Skript sein, oder auch ein fehlerhaftes Aminosäuregemisch. 3. Charakterisierung des Milchfettes 3.1 Jodzahl In diesem Versuchsteil haben wir für drei unterschiedliche Fette stark voneinander abweichende Jodzahlen gefunden. Damit hat das Olivenöl mehr als doppelt so viele Doppelbindungen wie die Butter, während das Leinöl diesen Wert noch einmal um den Faktor Zwei übersteigt. Seite 9 von 9

10 3.2 Verseifungszahl Nach unseren Ergebnissen enthält Olivenöl die längsten Fettsäuren, Tributyrin enthält fast um den Faktor 2 kürzere Fettsäuren, während Butter noch einen etwas höheren Wert als Tributyrin hat. 4.Calcium und Phosphatgehalt Calciumgehalt: Der Calciumgehalt in der Labmolke ist deutlich geringer als der in der Säuremolke. Dies deckt sich mit den Ergebnissen aus Versuchsteil 1.3, wo wir für die Aktivität des Labenzyms einen Verbrauch von Ca ++ -Ionen nachweisen konnten. Bei der Säurefällung wird dagegen kein Calcium benötigt, es liegt daher der annähernd gleiche Calciumgehalt vor wie beim Versuchsbeginn. Phosphatgehalt: Mit einer geringen Abweichung haben wir einen Gehalt von ~136mg Phosphat/l Milch nachweisen können. Die Untersuchung wurde dabei an der Säureschotte durchgeführt, d.h. am Überstand der durch Säurefällung und Zentrifugation fraktionierten Milch. Seite 10 von 10

11 Verwendete Literatur:!#"%$ &('*),+ $.-0/21),),+ $ "%$:9 KLM#NOQPSRTJUVXWZY [\S] ^_#`ba cdcea[ f gjfbhjijkml fon pq r%str5uv wbijwxwzy {*}~wj J C ƒj ƒjˆ Š Œ Ž: J Ž % Z S Ž # š œ ž. oÿ J m J J š z 5 «ªB %. %±²j %±@ ³µ %. ¹ 0ºCºJž»2¼½¾¼ ÁÀÂCà À ¾.Ç5ÀE»ÃÈ ÉËÊ5ÊÌÊÇƼ Í ÎCÏJÍoÐ ÑJÒmÓ ÍoÔ Õ:Ö %Øt 5ÙËÚ ÛšÑCÛxÛQÜ%ÝÞÁÛjßáàJàJâ Seite 11 von 11