Der Zebrafisch als vielseitiges Modellsystem JOHANN SCHREDELSEKER GERHARD KRUMSCHNABEL

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1 DOI: /biuz Vom Zierfisch zum Forschungsobjekt Der Zebrafisch als vielseitiges Modellsystem JOHANN SCHREDELSEKER GERHARD KRUMSCHNABEL Die Knockout-Maus ist seit langem DAS Versuchstier der medizinischen Grundlagenforschung. In mancher Hinsicht läuft ihr der Zebrafisch jedoch zunehmend den Rang ab. Durch seine einfache genetische Manipulierbarkeit ist er nicht nur in der Grundlagenforschung einsetzbar, sondern auch in Studien zur Entstehung von Krebs und anderen Krankheiten, sowie zum Screening von biologisch wirksamen Substanzen in der Pharmakologie. ABB. 1 VORTEILE UND ANWENDUNGEN DES ZEBRAFISCH-MODELLS Mit der Verleihung des Medizin-Nobelpreises 2007 an die Entwickler der Gen-Knockout-Technologie wurde eine revolutionäre Technologie gewürdigt, mit deren Hilfe in den vergangenen beiden Jahrzehnten grundlegende Fragestellungen der Biologie und Medizin beantwortet werden konnten [9].Mit so genannten Knockout-Mäusen,in denen einzelne Gene selektiv ausgeschaltet sind, konnte die Bedeutung dieser Gene für die normalen Lebensfunktionen und für die Entstehung vieler Krankheiten untersucht werden [17]. Ebenso hat sich die Herstellung transgener Tiere, bei denen kein Gen ausgeschaltet, sondern ein zusätzliches Gen eingeschleust wird, als äußerst fruchtbar erwiesen. Ungeachtet dessen hat sich ein ursprünglich nur für Aquarianer interessanter Fisch, der Zebrafisch (Danio rerio), zu einem wichtigen Studienobjekt der Biologie und Medizin gemausert.ausschlaggebend für diese Entwicklung sind die geringen Ansprüche in Bezug auf seine Haltung, gepaart mit relativ einfacher genetischer Manipulierbarkeit, einer sehr raschen Entwicklung, sowie der Tatsache, dass sowohl das Ei als auch das frühe Larvenstadium des Tieres transparent und damit leicht zu beobachten sind. Sein Einsatzbereich reicht von der Untersuchung grundlegender Fragen der Biologie bis zur Analyse seltener genetisch bedingter Krankheiten, und so wie beim Mausmodell erweitert der Fortschritt der Gentechnik sein Anwendungsgebiet zunehmend (Abbildung 1). Der Zebrafisch: ein perfektes Modell für die Entwicklungsbiologie Im Gegensatz zu den Modellsystemen Taufliege (Drosophila melanogaster) und Fadenwurm (Caenorhabditis elegans) ist der Zebrafisch ein Wirbeltier.Die meisten biologische Prozesse wie die Entwicklung oder das Zusammenspiel und die Funktion der inneren Organe laufen daher weitgehend genauso wie beim Menschen ab. Gegenüber der Maus wiederum grenzt sich der Zebrafisch durch andere Eigenschaften ab. So legt ein Zebrafischweibchen aus einem gut gehaltenen Stamm pro Gelege einige hundert Eier und das mehrmals pro Die mit einem grünen Pfeil markierten Begriffe werden im Glossar auf Seite 396 erklärt Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 6/2009 (39) Biol. Unserer Zeit 389

2 a) 4-Zell-Stadium circa 1,5 Stunden nach Befruchtung der Eizelle. b) 26 Stunden alter Embryo. c) 50 Stunden alter Embryo. ABB. 2 ENTWICKLUNGSSTADIEN DES ZEBRAFISCHS a) b) c) Woche. Diese große Anzahl an Nachkommen erlaubt es, in groß angelegten Kreuzungsexperimenten die Vererbung von Merkmalen zu studieren. Außerdem entwickeln sich die heranwachsenden Larven absolut synchron und außerhalb des Muttertiers. Faszinierend ist dabei vor allem die Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung: Die befruchtete Eizelle teilt sich zum ersten Mal nach circa 40 Minuten, innerhalb von 24 Stunden ist bereits ein Embryo zu erkennen, der erste Bewegungen im Ei durchführt, und am dritten Tag nach Befruchtung schlüpft der Embryo und beginnt zu schwimmen (Abbildung 2). Während dieser frühen Lebensphase bleiben die Larven transparent, was es ermöglicht, die Entwicklung innerer Organe im lebenden Tier mit Hilfe einfacher mikroskopischer Techniken zu studieren. Die inneren Organe des Zebrafischs entsprechen dabei weitgehend den Organen anderer Wirbeltiere wie auch jenen des Menschen. In mancher Hinsicht sind sie als Forschungsobjekt denen von Säugern sogar überlegen, handelt es sich dabei doch häufig um Miniaturausgaben der Organe höherer Wirbeltiere, wie auch des Menschen. Die einfacheren Strukturen lassen sich weitaus besser erforschen und die Ergebnisse können anschließend auf die komplexeren Strukturen der höheren Wirbeltiere und des Menschen übertragen werden. Um auch in späteren Stadien die Entwicklung von inneren Organen beobachten zu können,entwickelten Forscher aus Boston durch die gezielte Kreuzung von mutierten Stämmen vor kurzem den adult transparenten Zebrafisch casper. In ihrer 2008 publizierten Studie konnten sie mit dessen Hilfe erfolgreich die Metastasierung eines implantierten Tumors beobachten [18]. Die Herstellung von transgenen Zebrafischen und Mutanten Die oben genannten Eigenschaften machten den Zebrafisch aber nur deshalb derartig populär, weil sie mit umfangreichen Möglichkeiten zur genetischen Manipulation Hand in Hand gehen. So kann beispielsweise zur Herstellung von transgenen Linien relativ einfach Fremd-DNA mit fein ausgezogenen Glaskapillaren in die großen Eizellen injiziert werden (Abbildung 3a), die anschließend in das Genom der heranwachsenden Larven integriert wird. Aus diesen Larven werden Zebrafisch-Stämme gezüchtet, die dauerhaft diese Fremd- DNA exprimieren. Diese Methode ist vor allem bei der Erzeugung so genannter Markerlinien wesentlich, bei denen ein Reportergen, beispielsweise das grün fluoreszierende Protein GFP (green fluorescent protein) aus der Tiefseequalle Aequorea victoria oder das rot fluoreszierende dsred aus der Koralle Discosoma sp., in das Genom eingeschleust wird. Bei einer Markerlinie wird dieses Reportergen mit einem regulatorischen Genabschnitt einem Promotor gekoppelt, der bewirkt, dass es nur in einem ganz speziellen Zelltyp, beispielsweise Keimzellen oder Nervenzellen, exprimiert wird und die Zellen dadurch markiert (Abbildung 3b). Mit einfachen fluoreszenzmikroskopischen Methoden lassen sich diese Markerproteine sichtbar machen und erlauben es folglich genau zu beobachten, aus welchen Vorläuferzellen ein Organ entsteht, zu welchem Zeitpunkt der Entwicklung das geschieht und wie sich das Organ zusammensetzt. Zusätzlich zu den klassischen Markerlinien wurden innerhalb der vergangenen Jahre aber auch vermehrt transgene Linien für die Untersuchung physiologischer Prozesse hergestellt.so sorgte beispielsweise an der Universität San Francisco (UCSF) dieses Jahr ein Zebrafisch für Aufsehen, der selektiv im Herzmuskel ein artifizielles Protein,gCaMP,exprimiert,das in Anwesenheit von Kalzium verstärkt fluoresziert [6]. Da die Kontraktion des Herzmuskels über Kalzium gesteuert wird, leuchten die Herzen der gcamp-fische bei jedem Herzschlag auf. Somit können Kalziumströme eines intakten und eines erkrankten Herzens im lebenden Organismus beobachtet und Herzkrankheiten,die mit einer gestörten Regulation von Kalzium verbunden sind, studiert werden. Ein entscheidender Anstoß zur verbreiteten Verwendung von Zebrafischen in der Forschung kam mit der Publikation von Studien aus dem Cardiovascular Research Center des Massachusetts General Hospital in Boston, sowie aus den von der Nobelpreisträgerin Christiane Nüsslein-Volhard geleiteten Laboratorien am Max-Planck-Institut für Entwicklungsbiologie in Tübingen, in denen die Produktion, Identifikation und schließlich die Anwendung von Zebrafisch-Mutanten vorgestellt wurde. Dazu wurden adulte Zebrafische einem chemischen Mutagen (Ethylnitrose-Harnstoff, ENU) ausgesetzt und anschließend mit unbehandelten (Wildtyp) Fischen so gekreuzt, dass in der vierten Generation Nachkommen entstehen, die eine spontan entstandene Mutation tragen und dadurch einen mehr oder weniger ausgeprägten Phänotypen zeigen (Kreuzungsschema in Abbildung 4). 390 Biol. Unserer Zeit 6/2009 (39) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

3 MODELLSYSTEM ZEBRAFISCH GENETIK ABB. 3 MARKERLINIEN MACHEN EINZELNE ZELLEN SICHTBAR a) Mit fein ausgezogenen Glaskapillaren wird Fremd-DNA in eine befruchtete Eizelle injiziert. Nach Integration der Fremd-DNA in das Genom und Weiterzucht der Larven kann schließlich eine Markerlinie hergestellt werden, die dauerhaft jene Fremd-DNA exprimiert. b) Der circa 30 Stunden alte Embryo dieser Markerlinie exprimiert das Reportergen GFP (green fluorescent protein) spezifisch in Blutgefäßen und Nieren. Transgene Linie und Foto: Valerija Arkhipova. a) b) Mit den aus diesem screen hervorgegangenen Mutanten füllten die Forscher aus Tübingen und Boston 1996 mit 37 Originalartikeln eine ganze Ausgabe der Zeitschrift Development [1]. Es standen nun weit über tausend verschiedene Phänotypen zur Verfügung, die von Wissenschaftlern auf der ganzen Welt genutzt werden konnten. Über genetische Methoden wie die linkage-analyse kann an diesen Mutanten das mutierte, für den Phänotyp verantwortliche Gen identifiziert werden und es können somit neue Gene, die an der Entwicklung, Regulation oder Funktion von Organen beteiligt sind, entdeckt werden. Mittlerweile ist dieser Ansatz, der unter dem Namen forward genetic screens bekannt wurde, in zahlreichen Laboratorien durchgeführt worden und eine der am häufigsten verwendeten Methoden für die Identifizierung neuer Gene, die bei der Ausprägung bestimmter Merkmale beteiligt sind [13].Der Begriff forward genetics bezeichnet dabei alle jene Verfahren, bei denen das mutierte Gen nicht bekannt ist und erst über den Phänotyp identifiziert wird. Beispiel Muskelfunktion Ein Beispiel für eine aus einem forward genetic screen hervorgegangene Mutante ist die Mutante relaxed ABB. 4 FORWARD GENETIC SCREENS: ERZEUGUNG VON ZUFALLSMUTANTEN a) b) c) d) a) Um neue Mutanten zu erzeugen, werden männliche Zebrafische (schlanke Körperform) mit dem Mutagen Ethylnitroseharnstoff (ENU, engl. ethylnitrosourea) behandelt und anschließend mit nicht behandelten (Wildtyp) Weibchen (rundliche Körperform) verpaart. b) Die Nachkommen dieser ersten Generation tragen heterozygot spontan entstandene Mutationen. c) Um diese Mutationen zu vereinzeln, werden die Tiere wiederum mit Wildtyp Fischen verpaart, was dazu führt, dass in der 3. Generation 50% der Nachkommen heterozygot die neu erworbene Mutation tragen und 50% Wildtyp Fische sind. d) Werden nun zwei heterozygote Tiere aus dieser Generation untereinander verpaart, tragen 25% der Nachkommen homozygot die neu erworbene Mutation und zeigen den damit verbundenen Phänotyp Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 6/2009 (39) Biol. Unserer Zeit 391

4 ABB. 5 a) b) c) d) e) GEN-INAKTIVIERUNG MIT ZINKFINGER-NUKLEASEN a) Der vorliegende DNA-Abschnitt codiert für ein hypothetisches Protein mit der in schwarz angezeigten Aminosäuresequenz und soll inaktiviert werden. b) Verwendet wird dafür eine Zinkfingernuklease. Diese besteht aus dem inaktiven Monomer des DNA schneidenden Enzyms Fok I, einer Nuklease, gekoppelt an eine Kette von Zinkfingern: Proteindomainen, die spezifisch an eine Erkennungssequenz von je drei Nukleotiden in der DNA binden. Die DNA-Erkennungssequenz für eine Zinkfingerdomaine kann durch gezielte Modifikationen (protein design) künstlich festgelegt werden, die Verwendung von mehreren Zinkfingerdomänen (in der Regel 3) lässt eine hochspezifische Erkennungssequenz entstehen. c) Durch den gezielten Einsatz von zwei Zinkfingernukleasen wird die Spezifität derartig erhöht, dass eine Sequenz erkannt wird, die im Genom einmalig ist. Nur an dieser Stellen können beide Zinkfingernukleasen binden, was dazu führt, dass zwei Fok I Monomere aufeinander treffen und sich zum aktiven Dimer verbinden, welches die DNA zerschneidet. d) Durch den Fok I-Schnitt entstehen kurze einzelsträngige Überhänge. e) Bei der darauf folgenden Reparatur werden die Überhänge eliminiert, was zu Fehlern im Gen führt und es dadurch inaktiviert. (engl., entspannt). Die homozygoten Larven von relaxed zeichnen sich dadurch aus, dass sie absolut bewegungsunfähig sind. Forscher an der Medizinischen Universität Innsbruck konnten nun zeigen, dass es sich bei relaxed um eine Mutation in einem Kalziumkanal handelt, der daran beteiligt ist, als Folge eines neuronalen Signals die Kontraktion von Muskelzellen auszulösen. Durch die Mutation kann der Kalziumkanal seine korrekte Position nicht mehr einnehmen und die Signalweiterleitung ist unterbrochen. Um zu beweisen, dass die identifizierte Mutation tatsächlich für den Phä- notyp verantwortlich ist, injizierten die Forscher intakte, nicht mutierte mrna, die für den betroffenen Kanal codiert,in die Eizelle von relaxed Larven.Die mrna wurde in den Zellen des heranwachsenden Embryos in Protein umgewandelt und stellte dem sich entwickelnden Tier somit den intakten Kanal wieder zur Verfügung. Es gelang den Forschern so, die volle Bewegungsfähigkeit in den Larven wieder herzustellen [16]. Diese Art von Experimenten sind als rescue (engl. Rettung) Experimente bekannt, da sie den mutierten Phänotypen wieder herstellen (retten) können. Der Gen-Knockdown das Pendant zur Knockout-Maus Im Gegensatz zu forward genetics-ansätzen versteht man unter reverse genetics jene Methoden, die dazu dienen, ein bekanntes Gen auszuschalten und die Auswirkung auf den Organismus zu untersuchen. Das klassische Beispiel hierfür ist die eingangs erwähnte Knockout-Maus. Im Zebrafisch ist das vorübergehende Abschalten bestimmter Gene durch den Einsatz von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden, kurz Morpholinos,möglich.Diese werden in die Eizelle injiziert,binden an die mrna eines bestimmten Gens und verhindern damit die Produktion des entsprechenden Proteins. Im Gegensatz zur Knockout-Maus, deren Erzeugung sehr langwierig ist, können mit der Morpholino-Methode innerhalb kurzer Zeit eine Vielzahl von relevanten Genen abgeschaltet und die Auswirkungen untersucht werden. Der Nachteil dieses Morpholino-induzierten Gen-Knockdowns liegt darin,dass er nur einige Tage anhält,da der Morpholino im Organismus langsam abgebaut wird. An einer Methode, Gene im Zebrafisch dauerhaft abzuschalten, wird derzeit intensiv geforscht. Ein erfolgversprechender Ansatz beruht auf der Verwendung so genannter Zinkfinger-Nukleasen (ZFNs) (Abbildung 5), die in Form von RNA in die Zygote injiziert werden, wo sie von der Zelle transkribiert werden und schließlich wirken [12]. Zinkfinger sind Proteindomänen, die spezifisch an eine Erkennungssequenz von drei Nukleotiden in der DNA binden. Kombiniert man mehrere Zinkfinger mit einem DNA schneidenden Enzym, einer Nuklease, entsteht eine ZFN, die nur an einer bestimmten Stelle im Genom bindet und den DNA-Doppelstrang aufschneidet. Bei der darauf folgenden Reparatur werden die durch den Schnitt entstandenenen kurzen Einzelstränge abgebaut oder aufgefüllt und es entstehen Fehler im Leseraster des an dieser Stelle lokalisierten Gens, die zu dessen Inaktivierung führen. Weitere Ansätze basieren darauf, in diversen groß angelegten Mutagenese-screens für alle Mutanten die betroffenen Gene schnell zu identifizieren und somit Banken anzulegen, in denen Mutanten für nahezu alle 392 Biol. Unserer Zeit 6/2009 (39) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

5 MODELLSYSTEM ZEBRAFISCH GENETIK Gene vorhanden sind. Zu diesen Methoden zählen z.b. retroviral-induzierte Mutagenese-screens, bei denen anhand der bekannten Sequenz des Virus sehr schnell bestimmt werden kann, welches Gen betroffen ist oder die gezielte Identifizierung von Genen in ENU-mutagenisierten Fischen mittels spezieller PCR-Verfahren beim TILLING. Small molecule screens Eine noch verhältnismäßig junge, aber viel versprechende Anwendungsmöglichkeit für den Zebrafisch sind die so genannten small molecule screens [19]. Diese Methode dient in erster Linie der Entdeckung neuer biologisch aktiver Substanzen, die als Medikamente dienen können. Mit dem Zebrafisch bieten sich hier neue Möglichkeiten, da, anders als bei Mäusen, Kaninchen oder Ratten Substanzen nicht in das Tier injiziert werden müssen, sondern direkt über das Wasser zugegeben werden können. Dadurch und durch die hohe Individuenzahl (mehrere tausend Larven pro Tag von einem Stamm) ist es erstmals möglich, große Mengen an Substanzen parallel zu testen. Zu diesem Zweck werden die Larven einzeln in Plastikplatten mit 24, 96 oder 384 einzelnen kleinen Kammern so genannte Mikrotiterplatten gegeben (Abbildung 6). Das ermöglicht es, die Larven in geringen Wassermengen genauen Konzentrationen der oft teuren oder nur in geringen Mengen herstellbaren Substanzen auszusetzen.in diesem Arrangement können in kurzer Zeit mit geringem Aufwand tausende von Substanzen getestet und deren Wirkung auf den Embryo untersucht werden. Häufig werden solche Screens an Fischen durchgeführt, die einen bekannten Gendefekt aufweisen und einen Phänotypen zeigen, der einem humanen Krankheitsbild entspricht. In solchen Experimenten können Substanzen identifiziert werden, die der Ausprägung des Phänotyps entgegenwirken und somit als Medikamente zur Behandlung der Krankheit in Frage kommen. Eine Gruppe von Forschern am Cardiovascular Research Center des Massachusetts General Hospital in Boston stellte vor Kurzem die Verwendung automatisierter Mikroskope vor,mit denen es möglich ist,gleichzeitig verschiedene Herzparameter, wie beispielsweise Herzfrequenz und -rhythmus von hunderten Larven aufzuzeichnen. In Kombination mit einem small molecule screen erlaubt dies eine rasche und effektive Identifikation von potenziellen Herzmedikamenten [19]. Der Zebrafisch als Krankheitsmodell Viele der aus forward genetic screens hervorgegangenen Mutanten zeigen einen Phänotyp, der humanen Krankheitsbildern ähnelt. So wurden in den vergangenen Jahren etliche Modelle entwickelt, die für die Erforschung von beispielsweise Herzstörungen wie Kardiomyopathien (Erkrankungen des Herzmuskels), Kam- merflimmern oder Rhythmusstörungen herangezogen werden. Ebenso haben Zebrafischmodelle für Diabetes oder Porphyrie (Störung des Aufbaus des roten Blutfarbstoffs) wissenschaftliches Aufsehen erregt [15].Seit einigen Jahren hält der Zebrafisch auch in dem in der biomedizinischen Wissenschaft sehr bedeutenden Feld der Krebsforschung Einzug. Die Aufklärung von Mechanismen der Krebsentstehung Die Ursache für viele Erkrankungen und nicht zuletzt für die Entstehung von Krebs liegt häufig in einem durch genetische Fehlfunktionen bedingten Ungleichgewicht zwischen der natürlichen Vermehrung von Zellen durch Teilung und deren natürlichem Absterben durch Apoptose. Mutationen, die zur Inaktivierung von Todesproteinen oder zur andauernden Aktivierung von Zellteilungssignalen führen, bewirken, dass Zellen sich übermäßig vermehren und letztlich Krebs entsteht. In jüngster Zeit hat sich auch in dieser Hinsicht der Ze- ABB. 6 SMALL MOLECULE SCREENS Für die Entdeckung neuer Wirkstoffe werden Zebrafischlarven auf die einzelnen Kammern von Mikrotiterplatten aufgeteilt. Nach Zugabe von verschiedenen unbekannten chemischen Substanzen in die Kammern werden physiologische Parameter der einzelnen Larven gemessen und für jede Kammer getrennt dargestellt. Somit kann sehr rasch festgestellt werden, ob eine oder mehrere der getesteten Substanzen eine Wirkung auf den Organismus haben Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 6/2009 (39) Biol. Unserer Zeit 393

6 ANGST, DEMENZ UND LUNGENENTZÜNDUNG BEIM ZEBRAFISCH Die Auswahl an Zebrafisch-Modellen für verschiedene Krankheiten wächst monatlich, eine umfassende Liste würde viele Seiten füllen. Hier seien einige interessante und überraschende Modelle erwähnt, die das breite Spektrum an Anwendungsmöglichkeiten demonstrieren: Tauopathien: Neben Alzheimer sind auch einige andere Demenzerkrankungen möglicherweise durch Veränderungen eines Proteins namens TAU bedingt. An einer Zebrafischlinie, die fluoreszierendes TAU exprimiert, konnten die Konformationsveränderung des Proteins, die Bildung von krankhaften neurofibrillären Bündeln, sowie der dadurch bedingte neuronale Zelltod und die daraus resultierenden Verhaltensveränderungen am lebenden Tier studiert werden [14]. Gerontologie: Mit zunehmendem Alter der Tiere findet man im Zebrafisch von Veränderungen der Muskulatur über die Bildung von Augenkatarakten bis zu Altersflecken in der Leber diverse Alterserscheinungen, die auch bei Menschen auftreten. Mittels Mutanten mit einem auffälligen alterungsbezogenen Phänotyp soll die Bedeutung der entsprechenden Gene in den Alterungsprozessen geklärt werden [10]. Psychopharmakologie: In Studien zur Wirkung von Medikamenten zur Behandlung von Angstzuständen wurde das explorative Verhalten von Fischen nach dem Umsetzen in eine neue Umgebung untersucht. Je nach Wirkstoff konnte damit etwa der angstlösende Effekt eines serotonergen Rezeptor-Agonisten von der weniger erwünschten sedativen Wirkung eines GABA-Rezeptor-Agonisten unterschieden werden [3]. Pulmonologie: Es scheint kurios, an Fischen Erkrankungen der Lunge untersuchen zu wollen. Tatsächlich kann aber durch eine gezielt gesetzte Verletzung der Schwanzflosse eine reproduzierbare Entzündungsreaktion mit ähnlichem immunologischen Verlauf wie unter anderem bei Lungenentzündungen induziert werden. Nach Gabe etablierter Medikamente konnte deren Wirkung verfolgt werden, durch Selektion entsprechender Mutanten aus einem forward genetic screen sollen nun neue involvierte Gene entdeckt werden [11]. Stammzellenforschung: Natürlich darf der Zebrafisch auch beim heißesten Thema zurzeit nicht fehlen und so wird an ihm die Rolle von Stammzellen bei der Krebsentstehung sowie bei Regenerationsprozessen des Herzens und im Nervensystem studiert. Die im Vergleich zu Säugern hohe Dichte adulter neuronaler Stammzellen im Gehirn des Fisches ermöglicht es die Bildung, das Schicksal und die Funktion fluoreszenzmarkierter proliferierender Zellen am lebenden Tier zu untersuchen, wie es bei anderen Tiermodellen kaum oder gar nicht möglich ist [2, 5]. brafisch als geeignetes Modell erwiesen. So werden etwa zur Untersuchung der Genese von Leukämien Krebserkrankungen des blutbildenden Systems aus durch chemische oder retrovirale Mutagenese induzierten Mutanten gezielt all jene selektiert, die sich durch einen Defekt in der Blutbildung auszeichnen. Da an der Blutbildung beteiligte Faktoren häufig auch in der Entstehung von Blutkrebs wichtig sind, ist die Chance groß, dass ein Teil dieser Mutanten krebsrelevante Gene betrifft. Wegen der großen Nachkommenzahl der Zebrafische können nun nicht nur relativ viele solcher Mutanten entdeckt werden, es ist dies auch in sehr kurzer Zeit möglich. So finden im Zebrafisch viele wesentliche Ereignisse der Blutbildung bereits in den ersten 48 Stunden nach Befruchtung der Eizelle statt, und mittels Färbung bestimmter Vorläuferzellen, die sich über entsprechende Markerproteine identifizieren lassen, kann somit in kürzester Zeit ein entsprechender Defekt nachgewiesen werden [4]. Mit Mäusen ist ein solcher screen schon wegen der benötigten Infrastruktur um ein Vielfaches aufwendiger, und es dauert auch wesentlich länger, entsprechende Mutanten zu identifizieren und weiter zu züchten. Doch auch beim Zebrafisch ist die Identifikation des mutierten Gens bei chemisch induzierten Mutationen relativ kompliziert und beinhaltet die erwähnte linkage-analyse und weitere gentechnische Methoden, weshalb bislang nur ein geringer Teil der beobachteten Phänotypen auch genotypisch bekannt ist.bei einer retroviral-induzierten Mutation ist dies hingegen vergleichsweise einfach.tatsächlich konnten damit am Zebrafisch bereits mehrere Gene identifiziert werden, deren Relevanz für die Krebsentstehung zuvor unbekannt war [7]. Sind die an der Entstehung einer bestimmten Form von Krebs beteiligten Gene bereits aus Untersuchungen an Mäusen und Menschen bekannt, so eignet sich der Zebrafisch ausgezeichnet dazu, die Mechanismen der Krebsentstehung zu entschlüsseln. Zum Beispiel wurde zur Untersuchung von Vorgängen, die zur Ausbildung von Leukämie führen, eine transgene Zebrafisch-Linie gezüchtet, die die Mausversion des Onkogens Myc, mmyc, exprimiert. Die Expression des Proteins wurde unter die Kontrolle des für lymphoide Zellen spezifischen Promotors rag2 gestellt, und wurde mit dem Reportergen GFP gekoppelt, womit seine Expression im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden kann. Tatsächlich entwickelten die transgenen Fische die erwartete T-Zell-Leukämie und zeigten viele Aspekte der Erkrankung, wie sie beim Menschen typisch sind. Als sich in den ursprünglich hergestellten Myctransgenen Fischen die Tumorentwicklung als so aggressiv erwies, dass eine Weiterzucht der Fische nicht möglich war,wurde in der Folge eine transgene Fischlinie erzeugt, bei der die Expression des mmyc Proteins über ein weiteres eingekreuztes Gen indirekt unter der Kontrolle eines Hitzeschock -Promotors stand. Nunmehr konnte die Aktivierung des Gens dadurch indu- ziert werden, dass man die Fische für eine kurze Zeit vom gewohnten 28 C warmen Wasser in 37 C warmes 394 Biol. Unserer Zeit 6/2009 (39) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

7 MODELLSYSTEM ZEBRAFISCH GENETIK ABB. 7 a) b) c) KNOCKOUT-MODELL ZUR UNTERSUCHUNG VON T-ZELL-LYMPHOMEN a) In 28 C warmem Wasser ist die unter Kontrolle eines Hitzeschock(HS)- Promotors stehende Cre-Recombinase inaktiv, der Transkriptions-Aktivator Hitzeschock-Faktor (HSF) liegt ungebunden als Monomer vor. Gleichzeitig exprimieren lymphoide Zellen unter Kontrolle des Promotors rag2 das rot-fluoreszierende Reporterprotein RFP, das dahinterliegende, für die Entstehung von Krebs verantwortliche mmyc-gen bleibt inaktiv. b) Bei einer Wassertemperatur von 37 C binden HSF-Trimere an den Hitzeschock-Promotor und induzieren die Expression der Cre-Recombinase. Cre-Recombinasen binden spezifisch an loxp-sequenzen und vermitteln über Rekombination ein Herausschneiden der dazwischen liegenden Gensequenz. c) Nun wird unter Kontrolle des rag2- Promotors das GFP-gekoppelte Onkogen mmyc exprimiert. d) Nach wenigen Monaten bei 28 C beschränkt sich die Expression des Onkogens nicht mehr auf den normal großen Thymus (Kontrolltiere, links), sondern induziert eine massive Expansion des Thymus und infiltriert benachbarte Gewebe (rechts), bevor transformierte Zellen schließlich auch andere Gewebe befallen. d) Wasser umsetzte (Abbildung 7).Wurden die Fische anschließend wieder bei 28 C gehalten, so entwickelte sich in vielen Tieren schon nach relativ kurzer Zeit Krebs, dessen Fortschreiten anhand der Ausbreitung des fluoreszierenden Markergens direkt am lebenden Tier beobachtet werden konnte [8]. Zebrafischforschung In den vergangenen Jahren erlebte der Zebrafisch als Modellorganismus in der biomedizinischen Forschung einen schier kometenhaften Aufstieg. Waren es vor zehn Jahren noch circa 2000 Publikationen, die sich mit dem Zebrafisch beschäftigen, so sind es heute an 2009 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 6/2009 (39) Biol. Unserer Zeit 395

8 GLOSSAR Gen-Knockout: selektives Ausschalten der Expression eines Gens. Der Knockout kann alle Zellen eines Organismus betreffen, oder durch Kopplung an einen bestimmten Promoter auf bestimmte Zellen und/oder Gewebe beschränkt sein, oder erst durch bestimmte Bedingungen (Hitzeschock; Verabreichung von Substanzen im Trinkwasser) aktiviert werden (konditioneller Knockout). Gen-Knockdown: transiente oder permanente Reduktion der Expression eines Gens zu einem variablen Ausmaß, typischerweise durch Zugabe inhibitorischer RNA; wird zumeist in der Zellkultur angewandt, ist beim Zebrafisch durch Einsatz von Morpholinos auch am ganzen Tier möglich. Hitzeschock-Promotor: regulatorischer Genabschnitt, an den abhängig von der Temperatur bestimmte Transkriptionsfaktoren (Hitzeschock-Faktoren) binden und dadurch die Expression des Gens an- oder abschalten. linkage-analyse: Methode zur genauen Lokalisierung eines mutierten Gens auf einem Chromosom. Dazu wird aus der Häufigkeit, in der die Mutation in verschiedenen Individuen der gleichen Familie gemeinsam mit bekannten Genabschnitten (Markern, Mutationen...) auftritt, auf dessen chromosomale Lokalisation geschlossen. TILLING: Gezieltes Auffinden von Mutationen in mutagenisierten Fischen. Dazu wird ein PCR-Produkt aus jenem Gen, in dem eine Mutation detektiert werden soll, aufgeschmolzen und wieder renaturiert. Es kommt zur Bildung von Doppelsträngen, die sich aus dem Wildtyp- und dem mutierten Allel zusammensetzen, und die durch das Restriktionsenzym Cel-I, das unspezifisch mismatches erkennt, geschnitten und somit detektiert werden können. Onkogen: ein Gen, das nach Mutation oder bei sehr starker Expression die Entstehung von Krebs fördert. Reportergen: ein künstlich in Zellen oder einen Organismus eingebrachtes Gen, welches keine unmittelbare biologische Funktion im jeweiligen Gewebe hat und Eigenschaften aufweist, die dessen Nachweis wesentlich vereinfachen (z.b. fluoreszierende Proteine). retroviral-induziert: Verwendung eines in-vitro synthetisierten Retrovirus zum Einschleusen genetischer Information in Zellen. die Zwischen vielen Laboratorien auf der ganzen Welt, die Zebrafische für ihre Forschung verwenden, hat sich seither eine gut ausgebildete Gemeinschaft entwickelt und so werden Markerlinien oder Mutanten auch anderen Laboratorien für deren Forschung zur Verfügung gestellt. Zur besseren Koordination wurden große Datenbanken wie das Zebrafish Information Network ZFIN ( geschaffen, in denen Details zu Mutanten, Publikationen, aber auch zu Forschern, Laboratorien und vielem mehr abgefragt werden können. Dass Zebrafischforschung auch in Europa eine bedeutende Rolle spielt, zeigt das dieses Jahr zu Ende gehende Projekt ZF-Models ( Dieses unter der Leitung des Max-Planck-Instituts für Entwicklungsbiologie in Tübingen stehende gesamteuropäische Projekt befasste sich mit der Entwicklung von Krankheitsmodellen am Zebrafisch und wurde vom 6. EU Forschungsrahmenprogramm mit 12 Millionen Euro gefördert. Innerhalb dieses Projekts entstanden bis 2008 circa 80 Publikationen in internationalen Fachjournalen, sowie eine Vielzahl an neuen Modellen, die in den nächsten Jahren für die eine oder andere wissenschaftliche Sensation sorgen könnten. Zusammenfassung In den vergangenen Jahren hat sich der Zebrafisch vom Zierfisch zum weitverbreiteten Modellsystem der biomedizinischen Forschung entwickelt. Er ist einfach zu halten, produziert in rascher Folge viele Nachkommen, entwickelt sich schnell und außerhalb des Muttertiers und ist zudem in den frühen Entwicklungsphasen transparent. Entsprechend wurde er zuerst vor allem zur unmittelbaren Beobachtung von Entwicklungsvorgängen genutzt. Da er aber auch relativ einfach genetisch manipulierbar ist, wurde er in Folge zur Herstellung transgener Linien verwendet, in denen Fremd- DNA exprimiert und die Bedeutung des jeweiligen Genprodukts für die Biologie des Tieres untersucht werden kann. Außerdem kann er durch Zufalls-Mutagenese zur unvoreingenommenen Entdeckung krankheitsrelevanter Gene verwendet werden, zum Screening biologisch wirksamer Substanzen für die Entwicklung von Medikamenten und zunehmend auch als Modell in der Krebsforschung. Summary Over the past years, the zebrafish rose from an aquarium fish to a widespread model of biomedical research. It is easily maintained, produces relatively large offspring, shows rapid extra maternal development, and is transparent during early development. Hence, it was initially primarily utilized for direct microscopic observation of developmental processes. However, as it is easily genetically manipulated, it was soon used to produce transgenic lines expressing DNA derived from other organisms. These lines could be used to study the importance of specific genes for biological processes. In addition, zebrafish is used for random mutagenesis screens, allowing the unbiased detection of genes relevant for diseases, for small molecule screens applied for the discovery of biologically active substances, and increasingly as a model for cancer research. Schlagworte Zebrafisch, Danio rerio, Modellorganismen, Krankheitsmodelle 396 Biol. Unserer Zeit 6/2009 (39) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

9 MODELLSYSTEM ZEBRAFISCH GENETIK Literatur [1] Development 1996,123. [2] C. G. Becker, T. Becker, Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration, Restor. Neurol. Neurosci. 2008, 26, [3] Z. Bencan, D. Sledge, E. D. Levin, Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety, Pharmacol. Biochem. Behav. 2009, 94, [4] D. Carradice, G. J. Lieschke, Zebrafish in hematology: sushi or science?, Blood 2008, 111, [5] P. Chapouton, R. Jagasia, L. Bally-Cuif, Adult neurogenesis in nonmammalian vertebrates, Bioessays 2007, 29, [6] N. C. Chi, R. M. Shaw, B. Jungblut, et al., Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system, PLoS Biol. 2008, 6, e109. [7] H. Feitsma, E. Cuppen, Zebrafish as a cancer model, Mol. Cancer Res. 2008, 6, [8] H. Feng, D. M. Langenau, J. A. Madge et al., Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish, Br. J. Haematol. 2007, 138, [9] J. Graw, Nobelpreis 2007 in Medizin: Herstellung von knockout- Mäusen, Biologie in unserer Zeit 2007, 37, [10] S. Kishi, B. E. Slack, J. Uchiyama, I. V. Zhdanova, Zebrafish as a genetic model in biological and behavioral gerontology: where development meets aging in vertebrates a mini-review, Gerontology 2009, 55, [11] J. S. Martin, S. A. Renshaw, Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease, Biochem. Soc. Trans. 2009, 37, [12] X. Meng, M. B. Noyes, L. J. Zhu, N. D. Lawson, S. A. Wolfe, Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases, Nat. Biotechnol. 2008, 26, [13] C. Nüsslein-Volhard, R. Dahm, Zebrafish. Oxford: Oxford University Press [14] D. Paquet, R. Bhat, A. Sydow et al., A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation, J. Clin. Invest. 2009, 119, [15] W. Penberthy, E. Shafizadeh, S. Lin, The zebrafish as a model for human disease, Front Biosci. 2002, 7, [16] J. Schredelseker, A. Dayal, T. Schwerte, C. Franzini-Armstrong, M. Grabner, Proper restoration of excitation-contraction coupling in the dihydropyridine receptor β 1 -null zebrafish relaxed is an exclusive function of the β 1a subunit, J. Biol. Chem. 2009, 284, [17] S. Selbert, Genmanipulation nach Wunsch: gewebsspezifisch und induzierbar, Biologie in unserer Zeit 1999, 29, [18] R. M. White, A. Sessa, C. Burke et al., Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis, Cell Stem Cell 2008, 2, [19] L. I. Zon, R. T. Peterson, In vivo drug discovery in the zebrafish, Nat. Rev. Drug Discov. 2005, 4, Danksagung: Die Autoren danken Valerija Arkhipova und Dirk Meyer für die Zurverfügungstellung der Markerlinienbilder. Die Autoren Johann Schredelseker, geboren 1979 in Wuppertal, hat in Innsbruck Biologie und medizinische Wissenschaften studiert und 2007 promoviert. Derzeit ist er Forschungsassistent an der Division für Biochemische Pharmakologie der Medizinischen Universität Innsbruck. Sein aktueller Forschungsschwerpunkt ist die Physiologie von Skelett- und Herzmuskulatur. Seit 2002 verwendet er erfolgreich Zebrafische in seiner Forschungstätigkeit. Korrespondenz: Dr. Johann Schredelseker Division für Biochemische Pharmakologie Medizinische Universität Innsbruck Peter-Mayr-Str. 1 A-6020 Innsbruck, Österreich johann.schredelseker@gmail.com Gerhard Krumschnabel, geb. 1965, hat in Innsbruck Biologie studiert und dort 1996 promoviert; mehrere Forschungsaufenthalte im Ausland, 2001 Habilitation in Zoologie und bis 2007 Assistent am Institut für Zoologie der Universität Innsbruck mit dem Forschungsschwerpunkt Fischphysiologie und Zellbiologie; derzeit arbeitet er als Forschungsassistent an der Division für Entwicklungsimmunologie der Medizinischen Universität Innsbruck und untersucht Zelltod und Krebs. Korrespondenz: Dr. Gerhard Krumschnabel Division für Entwicklungsimmunologie Medizinische Universität Innsbruck Fritz-Preglstr. 3 A-6020 Innsbruck, Österreich gerhard.krumschnabel@i-med.ac.at 2009 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim 6/2009 (39) Biol. Unserer Zeit 397