Methoden zur Untersuchung von Papier, Karton und Pappe für Lebensmittelverpackungen und sonstige Bedarfsgegenstände

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1 Methoden zur Untersuchung von Papier, Karton und Pappe für Lebensittelverpackungen und sonstige Bedarfsgegenstände 5. Bestiung von Einzelsubstanzen 5.26 Saccharose, 1. Allgeeine Angaben Saccharose C 12 H MC = 342,3 C 6 H M = 180,16 Bezeichnung in der Epfehlung XXXVI: Saccharose, Ordnungsnuer: C II 5, Feuchthalteittel Stand: März 1979 Analytisches Messprinzip: Photoetrie Bearbeiter: E. Peterann und I. Vetter*,. Henniger** * Herzberger Papierfabrik, Ludwig Osthushenrich bh & Co. K, Andreasberger Straße 1, 3420 Herzberg/Harz. ** Boehringer Mannhei bh, Bahnhofstraße 9-15,8132 Tutzing. 2. rundlagen des Verfahrens Die zu untersuchende Probe wird zerfasert, it Wasser extrahiert und i Extrakt werden Saccharose und nebeneinander bestit, d. h., dass der gehalt vor und nach der enzyatischen Hydrolyse der Saccharose bestit wird. Die wird bei ph 7,6 it Adenosin-5'-triphosphat (ATP) in egenwart des Enzys Hexokinase (HK) zu -6-phosphat (6P) phosphoryliert. 6P wird it Nicotinaid-adenin-dinucleotidphosphat (NADP) durch eine it -6-phosphat-Dehydrogenase (6P-DH) katalysierte enzyatische Reaktion spezifisch zu lukonat-6-phosphat oxidiert, wobei reduziertes Nicotinaidadenin-dinucleotidphosphat (NADPH) entsteht. NADPH ist der enge äquivalent und kann aufgrund seiner Absorption bei 334, 340 oder 365 n bestit werden. Zur Bestiung der Saccharose wird der Probelösung das Enzy ß-Fruktosidase (Invertase) zugegeben, das bei ph 4,6 die Saccharose zu und Fruktose hydrolisiert. Die bestiung nach enzyatischer Inversion (esatglukose) erfolgt unter den schon beschriebenen Bedingungen. Aus der Differenz der konzentration vor und nach der enzyatischen Inversion wird der ehalt an Saccharose berechnet. 3. Cheikalien und Lösungen Es sind ausschließlich Reagenzien des Reinheitsgrades zur Analyse" und frisch bidestillierte Wasser zu verwenden. Cheikalie Konzentration Sonstige Angaben Natronlauge c = 0,2 ol/l Na OH Natronlauge c = 5 ol/l Na OH Citrat-Pufferlösung c = 0,32 ol/l ph = 4,6; 6,9 g Citro 1

2 nensäure (C 6 H 8 S0 7 H 2 O) und 9,1 g tri- Natriucitrat-2-hydrat (C 6 H 5 Na 3 O 7 2 H 2 0) werden in ca. 150 l Wasser gelöst, it Natronlauge (c=0,2 ol/l) auf ph 4,6 eingestellt und it Wasser auf 200 l aufgefüllt (Halt-barkeit: bei +4 C ind. 1 Jahr). ß-Fruktosidase-Lösung c = 5 g/l 10 g ß-Fruktosidase werden it 2 l Wasser gelöst (Haltbarkeit: bei +4 C ind. 1 Woche). Pufferlösung Nicotinaid-adenindinucleotidphosphat-Lösung 6 Adenosin-5'-triphosphat- Lösung Hexokinase/-6- phosphat-dehydrogenase c = 0,75 ol/l Triethanolain c = 10 ol/l Mg 2+ c = ca. 11,5 ol/l ph 7,614,0 g Triethanolain-Hydrochlorid und 0,25 g Magnesiusulfat (Mg SO 4 7 H 2 O) werden in 80 l Wasser gelöst, it ca. 5 l NaOH (c=5 ol/l) auf ph 7,6 eingestellt und it Wasser auf 100 l aufgefüllt Haltbarkeit: bei +4 C ind. 4 Wochen). NADP; 60 g NADP- Na 2 H werden it 6l Wasser gelöst (Haltbarkeit: bei +4 C ind. 4 Wochen). c = ca. 81 ol/l ATP; 300 g ATP-Na 2 H 2 und 300 g Natriuhydrogencarbonat (NaHCO 3 ) werden in 6 l Wasser gelöst (Haltbarkeit: bei +4 C ind. 4 Wochen). 2 g HK/l, 1 g 6P- DH/l Polyaidpulver oder Polyvinylpolypyrrolidon k. A. k. A. Tabelle 1 Cheikalien und Lösungen 4. eräte HK/6P-DH die Suspension ist bei +4 C ind. 1 Jahr haltbar 4.1 Spektrallinienfilter-Photoeter it Messöglichkeit bei 365 n oder Spektralphotoeter (340 n) 4.2 lasküvetten, Schichtdicke 0,5 c, 1,0 c, DIN 58936, Teil Analysenwaage, Messgenauigkeit 0,0001 g 4.4 Messkolben it Kegelschliffhülse und Stopfen, 200 l, 100 l, DIN Messpipetten, 10 l, 2 l, 1 l, 0,2 l, 0,1 l, DIN Trichter, DIN

3 4.7 lasfaserfilter (vor ebrauch sind die Filter ehrals it heiße Wasser zu waschen) 4.8 Aufschlaggerät, z. B. Ultra Turrax 4.9 Bechergläser, HF 250, DIN Messzylinder, 250 l, 100 l, DIN ph-messgerät it laselektrode 4.12 Beheizbarer Magnetrührer it Rührkern 5. Probenahe und Probenvorbereitung 5.1 Probenahe Die Probenahe erfolgt nach DIN Dait keine Veränderung der Probe bis zur Durchführung der Prüfung eintritt, ist die Probe in Aluiniufolie einzuschlagen. 5.2 Probenvorbereitung Die Probe wird in Schnitzel von ca. 1 X 1 c Kantenlänge zerschnitten. Außerde sind für die Bestiung der Flächenasse nach DIN 53104, Teil 1, und zur Bestiung des Trockengehaltes nach DIN gesondert engengerechte Anteile zu entnehen. 6. Bestiung der Flächenasse nach DIN 53104, Teil 1 7. Bestiung des Trockengehaltes nach DIN Extraktion der Probe Von der zerschnittenen Probe werden ca. 1 g auf 0,0001 g genau gewogen, in ein 250 l- Becherglas gegeben, it ca. 50 l Wasser übergossen und it eine Aufschlaggerät zerfasert. Das Aufschlaggerät wird anschließend sorgfältig it ca. 10 l Wasser abgespült. Die vorbereitete Probe wird it eine beheizbaren Magnetrührer 15 in bei 60 C gerührt. Nach de Abkühlen wird die Probe quantitativ in einen 100 l-messkolben übergeführt und it Wasser bis zur Eicharke aufgefüllt. Vor der Durchführung der Bestiung wird die Probe über lasfaserfilter filtriert, und der Extrakt wird für die Untersuchung eingesetzt. Anerkung: Bei Färbung der Probelösung ist it Polyaidpulver oder Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) zu behandeln und über lasfaserfilter zu filtrieren. 9. Durchführung 9.1 Bestiung der Von der vorbereiteten ProbeIösung (Extrakt) werden 2,0 l in eine Küvette pipettiert, it 1 l Pufferlösung (siehe Tabelle 1), 0,1 l NADP-Lösung (siehe Tabelle 1) und 0,1 l ATP-Lösung (siehe Tabelle 1) versetzt und gut durchgeischt. Nach 3 in wird die Extinktion E 1 der Lösung gegen Luft geessen, die Reaktion durch Zugabe von 0,02 l HK/6P-DH (siehe Tabelle 1) gestartet. Nach Stillstand der Reaktion (15 in) wird die Extinktion E 2 der Lösung gegen Luft geessen. Ein Reagenzien leerwert wird unter den gleichen Bedingungen wie beschrieben hergestellt, wobei anstelle der ProbeIösung 2,0 l Wasser eingesetzt werden. Von der Extinktionsdifferenz der Probelösung wird die Extinktionsdifferenz des Leerwertes abgezogen, die Differenz ist der in die Berechnung als E einzusetzende Wert. 3

4 9.2 Bestiung der esatglukose Von der vorbereiteten Probelösung werden 2,0 l in eine Küvette pipettiert, it 0,2 l Citrat-Pufferlösung (siehe Tabelle 1) und 0,02 l ß-Fruktosidase-Lösung (siehe Tabelle 1) versetzt, gut durchgeischt und 15 in bei C stehengelassen. Nach Zugabe von 1,0 l Pufferlösung (siehe Tabelle 1), 0,1 l NADPLösung (siehe Tabelle 1) und 0,1 l ATP-Lösung (siehe Tabelle 1) wird gut durchgeischt. Nach 3 in wird die Extinktion E 1 der Lösung gegen Luft geessen und die Reaktion durch Zugabe von 0,02 l HK/6P-DH (siehe Tabelle 1) gestartet. Nach Stillstand der Reaktion (15 in) wird die Extinktion E 2 der Lösung gegen Luft geessen. Der Reagenzienleerwert wird unter den gleichen Bedingungen wie beschrieben hergestellt, wobei anstelle der Probelösung 2,0 l Wasser eingesetzt werden. Von der Extinktionsdifferenz der Probelösung wird die Extinktionsdifferenz des Leerwertes abgezogen, die Differenz ist der in die Berechnung als E esatglukose einzusetzende Wert. 9.3 Bestiung der Saccharose Für die Berechnung des Saccharosegehaltes wird die erittelte Extinktionsdifferenz der bestiung (9.1) nach Voluenkorrektur von der erittelten Extinktionsdifferenz der esatglukosebestiung (9.2) abgezogen E E 3,22 E 3,44 ( Saccharose esatglukose ) E Saccharose ist der in die Berechnung des Saccharosegehaltes einzusetzende Wert. Pro Ansatz sollten nicht ehr als µgsaccharose/ vorliegen. Falls it eine höheren ehalt zu rechnen ist, ist das eingesetzte Probevoluen zu verringern, it Wasser auszugleichen und in der Berechnung entsprechend zu berücksichtigen. 10. Auswertung Es sind Parallelbestiungen von indestens zwei Proben durchzuführen. Die Auswertung erfolgt nach der allgeeinen Berechnungsforel für die Bestiung der Konzentrationen: V M c E d v 1000 [ g / l] Hierin bedeuten: V = Testvoluen [I] v = Probevoluen [I] M = Molekulargewicht der zu bestienden Substanz (für =180,16; für Saccha rose = 342,3) d = Schichtdicke [c] ε = Extinktionskoeffizient (von NADPH bei Hg 365 n = 3,5 [1 ol -1 c -1 ] bzw. 6,3 [l ol -1 c -1 ] bei 340 n) E = Extinktionsdiferenz Hieraus ergibt sich für die bestiung unter den beschriebenen Bedingungen (d = 0,5 c; γ = 365 n): 4

5 3,22 180,16 c1 E [ g / l Probelösung ] 3,5 0, c 1 = 0,1657 E [g/l] c 1 = 16,57 E [g/100 l] Für die Bestiung der Saccharose ergibt sich folgende Berechnung (d = 0,5 c; γ = 365 n): 3,44 342,3 c2 ESaccharose [ g Saccharose / l Probelösung ] 3,5 0, c 2 = 0,3364 E [g/l] c 2 = 33,64 E [g/100 l] 10.1 Der ehalt an lu beträgt a) bezogen auf die Trockenasse der Probe in g/kg: lu1 c Tr b) bezogen auf die Flächenasse der Probe in g/²: lu 2 A c E Der ehalt an Saccharose Sac beträgt a) bezogen auf die Trockenasse der Probe in g/kg: Sac1 c Tr b) bezogen auf die Flächenasse der Probe in g/²: Sac2 A c E 2 Hierin bedeuten: A = Flächenasse der Probe nach DIN 53104, Teil1, in g/! E = Einwaage der Probe in g c 1 = 16,57. L\ Ein g c 2 = 33,64. L\ E in g Saccharose Tr = Einwaage der Probe in g,berechnet auf Trockengewicht nach DIN

6 11. Prüfbericht I Prüfbericht sind unter Hinweis auf diese Vorschrift anzugeben: Art und Bezeichnung der Probe Anzahl der Parallelbestiungen Trockengehalt der Probe nach DIN Flächenasse der Probe in g/² nach DIN Teil 1 ehalt an in g/kg bzw. in g/² nach 10.1.a oder 10.1.b ehalt an Saccarose in g/kg bzw. in g/² nach 10.2.a oder 10.2.b Einzelwerte und Mittelwert egebenenfalls Abweichungen von dieser Vorschrift Prüfdatu 12. Wiederfindungsrate ca. 93 % 13. Nachweisgrenze 5µg ( / Saccharose) (2,5 g -Saccharose / kg Extrakt) 14. Literatur Methoden der enzyatischen Lebensittelanalytik 77/78, Fa. Boehringer Mannhei bh, Postfach , 6800 Mannhei 31 Bergeyer, H. U., Bernt E., in Methoden der enzyatischen Analyse (Bergeyer, H. U., Hrsg.), Bd. 2, S (1974), Verlag Cheie, Weinhei Handbuch für diätetische Lebensittel, Analytik-Reinheitsanforderungen des Bundesverbandes der diätetischen Lebensittelindustrie e. V., Bad Hoburg, herausgegeben von der Fördergesellschaft Diätetische Lebensittel bh (1973) 15. Anerkung 15.1 Für die enzyatische Saccharose/-Bestiung sind Fertigreagenzien erhältlich, z.b. UV-Test zur Bestiung von Saccharose und in Lebensitteln, Bestell-Nr der Fa. Boehringer Mannhei bh Für Routineuntersuchungen hat sich folgendes Pipettierschea bewährt: In Küvetten pipettieren Leerwert Probe Leerwert Saccharose Probe Saccharose (esatglukose) Probe - 2,00 l - 2,00 l Citrat-Puffer - - 0,20 l 0,20 l β-fruktosidase - - 0,02 l 0,02 l ischen und 15 in bei C stehenlassen Puffer 1,00 l 1,00 l 1,00 l 1,00 l Wasser 2,00 l - 2,00 l - NADP 0,10 l 0,10 l 0,10 l 0,10 l ATP 0,10 l 0,10 l 0,10 l 0,10 l 6

7 Mischen, nach 3 in Extinktion E 1 der Lösungen gegen Luft essen und Reaktion starten durch Zugabe von HK/6P-DH 0,02 l 0,02 l 0,02 l 0,02 l Mischen, nach Stillstand der Reaktion (15 in) Extinktion E 2 der Lösungen gegen Luft essen. Für Leerwerte und Proben Extinktionsdifferenzen E 2 -E 1 bilden. Extinktionsdifferenz des jeweiligen Leerwertes von der Extinktionsdifferenz der entsprechenden Probe abziehen = E. Extinktionsdifferenz für Saccharose berechnen nach E Saccharose E esatglukose 3,22 E 3,44 7