Schlussbericht zur Studienwoche Biologie und Medizin vom März 2014

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Herta Schwarz
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Schlussbericht zur Studienwoche Biologie und Medizin vom 16.-22.

1 Schlussbericht zur Studienwoche Biologie und Medizin vom März 2014 Projekt: Zellbiologie: Hormonproduktion in adrenalen Zellen im Labor Nephrologie & Hypertonie & klinische Forschung am Inselspital, Bern LeiterInnen: Prof. Dr. med. M. G. Mohaupt Carine Gennari, DVM-PhD Heidi Jamin, Laborantin Nicole Eisele, PhD-Studentin Teilnehmer: Lukas Dinkelmann; Simon Eitzinger Fragestellung Abb. 1: Funktion des Aldosterons Hormone werden in Drüsen produziert. Die Produktion vieler besonders wichtiger Steroidhormone findet an einem geschützten Ort statt, der Nebenniere. Zellen der Nebenniere bezeichnet man als adrenale Zellen. Die Nebenniere ist ein hormonproduzierendes Organ, welches aussen eine Rinde und innen ein Mark aufweist. Die Rinde ist weiter in drei Zonen aufgeteilt, wobei die äusserste Zone für dieses Projekt von Bedeutung war. Die von uns verwendeten Zellen stammen aus der äussersten Zone der Nebennierenrinde (auch zona glomerulosa genannt) und heissen H295R. Zellen der zona glomerulosa bilden als Endprodukt das wichtige Hormon Aldosteron. Die wichtigste Funktion von Aldosteron ist die Regulation der Körperflüssigkeit, was den Blutdruck entscheidend mitbestimmt. Sobald der Blutdruck im Körper sinkt, melden die Nieren den Nebennieren, dass sie Aldosteron produzieren müssen. Sobald Aldosteron in den Nebennierenzellen gebildet wurde, gelangt es über die Blutbahn zur Niere. In der Niere macht Aldosteron, dass mehr Salz (Na + ) und begleitend auch Wasser in der Niere zurückbehalten werden. Dies führt dazu, dass der Blutdruck steigt. Leider gibt es aber auch Erkrankungen, bei welchen Aldosteron falsch oder nicht reguliert wird und dies führt zu hohem Blutdruck (Hypertonie). Die Nebennieren bilden in solchen Fällen zuviel Aldosteron, 1

2 welches dann medikamentös gehemmt werden muss. Solche Medikamente sind zum Beispiel Aldosteron-Rezeptor-Blocker (MR-Antagonisten). Ziel dieses Projekts war es herauszufinden, ob die H295R Zellen Aldosteron produzieren können (indem wir die Aldosteronsynthase = CYP11B2 untersuchten) und ob sie auch den Aldosteron-Rezeptor (auch Mineralocorticoidrezeptor = MR genannt) haben. CYB11β2 1. Progesteron 2. DOC 3. Corticosteron 4. Aldosteron Abb. 2: Hormonkaskade Vorgehen und Methoden Wir haben mit drei verschiedenen Methoden der Grundlagenforschung gearbeitet: Immunfluoreszenz (IF), Dünnschichtchromatographie (TLC) und Western Blot (WB). Im Folgenden werden wir auf die drei oben genannten Methoden näher eingehen. Vorbereitung für IF, WB und TLC: Als Vorarbeit für die drei durchzuführenden Methoden entnahmen wir von zwei identischen Zellkulturflaschen H295R Zellen. Diese wurden ursprünglich aus einem menschlichen Nebennierentumor isoliert. Um die optimale Anzahl Zellen für unser Experiment so haben, mussten wir zuerst die Zellen mithilfe der Neubauer Zählkammer zählen. Die Anzahl der Zellen betrug bei uns ca. 25*10 6. Diese Zellen verteilten wir auf vier 10cm grosse Petrischalen (für WB und TLC) und auf zwei 6-well Platten (für IF). Für die IF haben wir vor dem Ansetzen der Zellen Coverslips mit Collagen beschichtet, damit die Zellen darauf wachsen können. Über Nacht waren die Zellen im Inkubator (37 0 C, 5% CO2) 1. Immunfluoreszenz (IF) Nachdem die Zellen mit Formaldehyd fixiert und mit Triton-X 100 permeabilisiert wurden, gelangten Antikörper (MR bzw. CYP11β2) in die Zellen. Diese haben an das gesuchte Protein (CYP11B2 bzw. MR) gebunden. Ein an den ersten bindender Antikörper (2. Antikörper) konnte unter dem Immunfluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Von den Zellen wurden Fotos gemacht. 2

3 Beim ersten Präparat haben wir das CYP11β2 Protein nachweisen können und im zweiten Präparat den Aldosteronrezeptor = MR. 2. Dünnschichtchromatographie (TLC) Bei der Dünnschichtchromatographie haben wir zuerst radioaktives 3 H-Progesteron zu unseren H295R Zellen gegeben. Nach einer Wirkungszeit von 4h entnahmen wir das Medium in welches die Zellen nun ihre produzierten Hormone abgegeben haben und extrahierten die Hormone. Anschliessend gaben wir den Hormonmix in kleinen Mengen auf eine TLC-Platte, um die entstandenen Hormone voneinander zu trennen. Mithilfe des UV-Lichtes und der Vergleichshormone konnten wir die einzelnen Hormone gezielt markieren und in verschiedene Tubes abfüllen. Aufgrund der Radioaktivität der Hormone konnte der β-counter die von den Hormonen ausgesendeten β-strahlen messen und somit konnten wir Rückschlüsse auf die Menge der einzelnen produzierten Hormone ziehen. 3. Western Blot (WB) Zuerst wurden die Zellen, welche sich zuvor in der Petrischale vermehrt haben, zerstört um die Proteine freizusetzen. Danach wurde die Konzentration der gewonnenen Proteine gemessen. Mithilfe der Gelelektrophorese haben wir das CYP11β2 Protein von den anderen Proteinen getrennt und anschliessend dessen Menge bestimmt. Resultate Dünnschichtchromatographie: In der Graphik 1 ist die Menge der gebildeten Hormone in % zu sehen. Aus dem Progesteron wurde demzufolge innerhalb von vier Stunden 18.3% Aldosteron, 41.4% Corticosteron und 26.8% Deoxycorticosteron (DOC) gebildet: 3

Anteil in % Graphik 1: TLC H295R, 3 H- Progesteron, 4h 50.0 40.0 41.4 30.0 26.8 20.0 18.3 13.5 10.0 0.

4 Anteil in % Graphik 1: TLC H295R, 3 H- Progesteron, 4h Aldosteron Corticosteron Deoxycorticosteron Progesteron Immunfluoreszenz: Durch den zweiten Antikörper, welcher an den CYP11β2 Antikörper band, wurden die in Abb. 1 sichtbaren CYP11β2- Proteine grün gefärbt. Die Zellkerne wurden mit dem blauen Farbstoff, DAPI genannt, gefärbt. Abb. 2 zeigt das Vorhandensein des Mineralocorticoidrezeptors (MR), ebenfalls in grün. Zellkerne CYP11β2 Abb.1: Sicht durch das Immunfluoreszenzmikroskop ( CYP11B2; Vergrösserung 40x) M R M R Zell ker n Zellk erne M R 4

Abb. 2: Sicht durch das Immunfluoreszenzmikroskop (Mineralcorticoid- Rezeptor (MR); Vergrösserung 100x und 60x)) Westernblot: Mit der Westernblot-Technik kann man spezifische Proteine der H295R

5 Abb. 2: Sicht durch das Immunfluoreszenzmikroskop (Mineralcorticoid- Rezeptor (MR); Vergrösserung 100x und 60x)) Westernblot: Mit der Westernblot-Technik kann man spezifische Proteine der H295R Zellen detektieren. Unser Ziel war es, das 55 kda grosse CYP11B2 Protein darzustellen. Als Ladekontrolle wurde β-actin verwendet. Diskussion Mit der Dünnschichtchromatographie konnten wir zeigen, dass H295R Zellen in der Lage sind aus Progesteron weitere Hormone zu produzieren. Somit haben wir bewiesen, dass H295R Zellen hormonproduzierende Zellen sind. Das Vorhandensein vom CYP11β2 Protein, welches schlussendlich die Aldosteronproduktion erst ermöglicht, wiesen wir mit dem Western Blot nach. Mit der dritten Methode, der Immunfluoreszenz, konnten wir zeigen, dass das CYP11β2 Protein und der Aldosteronrezeptor (MR) im Cytoplasma lokalisiert sind. Schlussfolgerung Zusammenfassend konnten wir beweisen, dass die von uns verwendeten adrenalen Zellen (H295R) das Enzym Aldosteronsynthase = CYP11β2 haben, dass dieses Enzym aktiv ist und dass diese Zellen über den Aldosteron-Rezeptor = MR verfügen. CYP11β2 katalysiert den letzten Schritt in der Aldosteronproduktion und ist in den Mitochondrien lokalisiert. Der MR liegt frei im Cytoplasma. Aldosteron ist ein Steroidhormon. Steroidhormone sind fetthaltig und können somit frei durch die Zellmembran hindurch diffundieren. Aldosteron gelangt über die Blutbahn zur Niere, wo es in spezielle Nierenzellen eindringt und dort an den MR bindet. Sobald es an den MR gebunden ist, wandert dieser Aldosteron-MR-Komplex zusammen in den Zellkern hinein. Dort bindet er an die DNA und fördert die Bildung von Salzkanälen. Folglich wird mehr Salz im Blut zurückbehalten. Begleitend kommt es zu einer Expression von Wasserkanälen, die dazu beitragen, dass auch mehr Wasser im Blut zurückgehalten wird; somit steigt der Blutdruck an. 5

6 Spannend wäre es jetzt zu sehen, was die H295R Zellen machen würden, wenn man ihnen einen CYP11B2-Blocker ins Medium geben würde. Wir würden erwarten, dass diese Zellen dann weniger oder gar kein Aldosteron mehr bilden könnten. Dank Wir bedanken uns herzlich bei unseren kompetenten Betreuerinnen, Carine, Nicole und Heidi, welche uns mit Rat und Tat zur Seite standen und uns ein Studium in Biologie und Medizin schmackhaft machten. Ein ebenso aufrichtiges Dankeschön ist an die SJf gerichtet, die uns diese spannende und lehrreiche Woche ermöglichte. Ebenso möchten wir Markus danken, der uns in das Labor Nephrologie & Hypertonie & klinische Forschung eingeladen hat. 6

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